본 연구는 큰개불알풀에탄올 추출물의 항산화 활성과 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에서의 항염증 활성 효과를 확인하기 위하여 수행되었다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과 추출물 1 mg/mL의 농도에서 각각 65.22 mg/g, 43.82 mg/g 함유하고 있음을 확인하였고 DPPH와 ABTS radical 소거능 측정 결과, 농도 의존적으로 소거능이 증가하였고 $200{\mu}g/mL$, $500{\mu}g/mL$ 농도에서 72.0%, 73.9%의 소거활성을 확인하였다. 환원력 측정 결과에서도 큰개불알풀 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가하였고, $1000{\mu}g/mL$ 농도에서 53.0%의 환원력을 나타내었다. 세포독성 측정을 위한 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell 세포생존율 측정 결과, 큰개불알풀 추출물 $0{\sim}800{\mu}g/mL$에서 세포독성이 나타나지 않았으며, NO 생성 억제활성은 추출물 $800{\mu}g/mL$ 농도에서 NO 생성량이 80% 이상 억제됨을 확인할 수 있었다. 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2 발현량을 측정한 결과, 모두 농도 의존적으로 억제되는 경향을 보였고, 특히 iNOS는 $800{\mu}g/mL$ 농도에서 LPS 처리군에 비해 50% 정도 억제되었다. LPS로 인한 $NF-{\kappa}B$ p65와 복합체 단백질인 $IkB-{\alpha}$의 인산화 수준 또한 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 인산화 된 $NF-{\kappa}Bp65$는 $800{\mu}g/mL$ 농도에서 정상군과 같은 발현량을 보였다. 이와 같이 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 및 항염증 활성의 생리활성 평가를 통해 천연 기능성 소재로서 활용 가능성을 확인하였으며 추후 생리활성을 나타내는 유효성분 탐색 및 분리 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구는 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 활성과 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에서의 항염증 활성 효과를 확인하기 위하여 수행되었다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과 추출물 1 mg/mL의 농도에서 각각 65.22 mg/g, 43.82 mg/g 함유하고 있음을 확인하였고 DPPH와 ABTS radical 소거능 측정 결과, 농도 의존적으로 소거능이 증가하였고 $200{\mu}g/mL$, $500{\mu}g/mL$ 농도에서 72.0%, 73.9%의 소거활성을 확인하였다. 환원력 측정 결과에서도 큰개불알풀 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가하였고, $1000{\mu}g/mL$ 농도에서 53.0%의 환원력을 나타내었다. 세포독성 측정을 위한 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell 세포생존율 측정 결과, 큰개불알풀 추출물 $0{\sim}800{\mu}g/mL$에서 세포독성이 나타나지 않았으며, NO 생성 억제활성은 추출물 $800{\mu}g/mL$ 농도에서 NO 생성량이 80% 이상 억제됨을 확인할 수 있었다. 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2 발현량을 측정한 결과, 모두 농도 의존적으로 억제되는 경향을 보였고, 특히 iNOS는 $800{\mu}g/mL$ 농도에서 LPS 처리군에 비해 50% 정도 억제되었다. LPS로 인한 $NF-{\kappa}B$ p65와 복합체 단백질인 $IkB-{\alpha}$의 인산화 수준 또한 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 인산화 된 $NF-{\kappa}Bp65$는 $800{\mu}g/mL$ 농도에서 정상군과 같은 발현량을 보였다. 이와 같이 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 및 항염증 활성의 생리활성 평가를 통해 천연 기능성 소재로서 활용 가능성을 확인하였으며 추후 생리활성을 나타내는 유효성분 탐색 및 분리 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Veronica persica (V. persica) is a perennial plant that is broadly distributed in Europe, Asia and so on. V. persica is used for pain about the lower abdomen and low back. The aim of this study was to investigate the anti-oxidant and anti-inflammatory effects of V. persica ethanol extract in LPS-ind...
Veronica persica (V. persica) is a perennial plant that is broadly distributed in Europe, Asia and so on. V. persica is used for pain about the lower abdomen and low back. The aim of this study was to investigate the anti-oxidant and anti-inflammatory effects of V. persica ethanol extract in LPS-induced RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-oxidant activity, the DPPH and ABTS radical scavenging, total polyphenol and flavonoid contents, and reducing power activity were carried out. The DPPH and ABTS radical scavenging activity were evaluated as 72.0% and 73.0% at the concentrations of 200 and $500{\mu}g/mL$, respectively. Total polyphenol and flavonoid contents of V. persica extracts were measured as 65.22 mg/g and 43.82 mg/g at the concentration of 1 mg/mL. The reducing power activity measurement showed 53.0% activity at 1 mg/mL. The anti-inflammatory effects of the V. persica extract were evaluated in LPS induced RAW 264.7 cells. In the evaluation of cell viability by proliferation ＆ cytotoxicity assay kit, the cytotoxicity of the extract was not confirmed at $0{\sim}800{\mu}g/mL$ concentration. And the V. persica significantly inhibited NO production in a concentration dependent manner. The inhibition effects of NO in cell medium of V. persica was over 80% at $800{\mu}g/mL$. The V. persica also suppressed the expression of iNOS, COX-2, and phosphorylation of $NF-{\kappa}B$ and $IkB-{\alpha}$ proteins. These results indicate that the V. persica has anti-oxidant and anti-inflammatory effects by modulating $NF-{\kappa}B$ signaling pathways and can be used as natural functional materials.
Veronica persica (V. persica) is a perennial plant that is broadly distributed in Europe, Asia and so on. V. persica is used for pain about the lower abdomen and low back. The aim of this study was to investigate the anti-oxidant and anti-inflammatory effects of V. persica ethanol extract in LPS-induced RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-oxidant activity, the DPPH and ABTS radical scavenging, total polyphenol and flavonoid contents, and reducing power activity were carried out. The DPPH and ABTS radical scavenging activity were evaluated as 72.0% and 73.0% at the concentrations of 200 and $500{\mu}g/mL$, respectively. Total polyphenol and flavonoid contents of V. persica extracts were measured as 65.22 mg/g and 43.82 mg/g at the concentration of 1 mg/mL. The reducing power activity measurement showed 53.0% activity at 1 mg/mL. The anti-inflammatory effects of the V. persica extract were evaluated in LPS induced RAW 264.7 cells. In the evaluation of cell viability by proliferation ＆ cytotoxicity assay kit, the cytotoxicity of the extract was not confirmed at $0{\sim}800{\mu}g/mL$ concentration. And the V. persica significantly inhibited NO production in a concentration dependent manner. The inhibition effects of NO in cell medium of V. persica was over 80% at $800{\mu}g/mL$. The V. persica also suppressed the expression of iNOS, COX-2, and phosphorylation of $NF-{\kappa}B$ and $IkB-{\alpha}$ proteins. These results indicate that the V. persica has anti-oxidant and anti-inflammatory effects by modulating $NF-{\kappa}B$ signaling pathways and can be used as natural functional materials.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 큰개불알풀 추출물에 대한 기본적인 생리활성을 정립하고자 항산화 및 항염증 활성 평가를 실시하였으며, 이러한 기능성 평가를 통해 천연물 소재 및 기 능성 작물화의 가능성을 검토하고자 하였다.
본 연구는 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 활성과 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에서의 항염증 활성 효과를 확인하기 위하여 수행되었다.
제안 방법
농도에 따른 DPPH 소거능은 시료를 첨가하지 않은 대조구와 시료 첨가구를 비교하여 백분율(%)로 나타내었고 양성 대조구로는 ascorbic acid를 사용하였다.
다음날 1×PBST로 5회 세척 후 실온에서 2차 항체(Santa Cruz, CZ, USA)를 2시간 반응시킨 후 1×PBST로 세척하였고 membrane을 X-ray films에서 발색시약 A, B를 1:1 (v/v)로 혼합하여 도포하고 Chemi DocTM MP imaging system (Bio-Rad, California, USA)을 이용하여 관찰하였다.
본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell에서 큰개불알풀 추출물에 의한 전사인자 p-NF-κB p65와 p-IkB-α의 발현량 변화를 측정하였다.
분주한 세포에 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도의 추출물을 처리하고 1시간 방치한 다음 LPS 1 μg/mL을 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 반응시키고, 다음으로 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine)에 기초하여 배양액 중의 NO를 분석하였다.
표준물질로 sodium nitrate를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 cell이 생성한 NO의 양을 평가하였다.
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능은 추출물의 DPPH에 대한 수소공여 효 과로 측정하였다(Mathangi and Prabhakaran, 2013).
Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 이용하여 제조한 시료를 증류수로 희석하여 농도별로 제조하였고 시료와 0.2 mM DPPH 용액을 1:1 (v/v) 비율로 혼합하여 37℃ incubator에 30분간 차광 상태로 방치하였다.
Lipopolysaccharide (LPS)에 의해 활성화된 대식세포 RAW 264.7 cell의 배양액 중에 존재 하는 nitrite (NO2-)의 양을 Griess 반응을 이용하여 NO 생성량을 측정하였다.
추출용 시료를 만들기 위해 분쇄한 시료 10 g에 70% ethanol 100 mL를 넣고 2시간씩 3회 반복하여 환류 추출하였다.
큰개불알풀 추출물이 세포 생존율에 영향을 주는지 확인하기 위해 proliferation & cyto- toxicity assay kit를 이용하여 독성평가를 실시하였다.
큰개불알풀의 독성을 평가하기 위해 proliferation & cytotoxicity assay kit를 이용하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 큰개불알풀은 2017년 5월 전북 전주 일대에서 자생하는 전초를 채취하여 세척하였다.
염증분석에 사용되는 대표적인 마우스 대식세포인 RAW 264.7 cell을 American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
모든 실험에 대한 결과는 3반복으로 측정하여 평균과 표준편차로 나타냈으며, 각 데이터의 통계 분석은 T-test를 사용하여 통계적 유의성을 나타내었다.
이론/모형
LPS에 의해 활성화된 대식세포 RAW 264.7 cell에 존재하는 염증성 단백질 발현량을 측 정하기 위해 western blotting을 수행하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법으로 측정하였다(Chon et al., 2012).
총 플라보노이드 함량은 Davis변법을 사용하여 측정하였다(Kim et al., 2016b).
환원력은 Oyaizu (1986)의 방법을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
따라서 큰개불알풀 추출물은 LPS로 활성화 된 대식세포 RAW 264.7 cell에서 NO 생성 및 iNOS와 COX-2 염증성 단백질 발현 억제를 통해 항염증 효과를 보이는 것으로 확인되었다.
또한 PGE2 합성에 영향을 미치는 COX-2의 발현량은 LPS만 처리한 세포에서 무처리구에 비해 30배 이상 발현이 증가하였는데 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL으로 처리하였을 때 발현량이 각각 27, 23배로 농도 의존적 으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5B).
또한 p-IkB-α의 발현량은 무처리구에 비해 LPS를 처리한 실험군에서 1.21배의 발현량을 나타내었고, 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL로 처리하였을 때 각각 1.18, 1.11배로 농도 유의하게 발현량이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 6B).
본 실험에서 큰개불알풀 에탄올 추출물의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 125, 250, 500 μg/mL에서 각각 24.3, 43.1, 73.9%로 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1B).
세포독성 측정을 위한 LPS로 유도된 RAW 264.7 cell 세포생존율 측정 결과, 큰개불알풀 추출물 0~800 μg/mL에서 세포독성이 나타나지 않았으며, NO 생성 억제활성은 추출물 800 μg/mL 농도에서 NO 생성량이 80% 이상 억제됨을 확인할 수 있었다.
염증성 단백질인 iNOS와 COX-2 발현량을 측정한 결과, 모두 농도 의존적으로 억제되는 경향을 보였고, 특히 iNOS는 800 μg/mL 농도에서 LPS 처리군에 비해 50% 정도 억제되었다.
총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 을 측정한 결과 추출물 1 mg/mL의 농도에서 각각 65.22 mg/g, 43.82 mg/g 함유하고 있음을 확인하였고 DPPH와 ABTS radical 소거능 측정 결과, 농도 의존적으로 소거능이 증가하였고 200 μg/mL, 500 μg/mL 농도에서 72.0%, 73.9%의 소거활성을 확인하였다.
측정 결과 추출물 0, 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도에서 RAW 264.7 cell 생존율이 모두 100% 이상으로 큰개불알풀 추출물은 세포에 대한 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 3).
큰개불알풀 추출물의 NO 생성 억제 활성을 평가하기 위해 대식세포인 RAW 264.7 cell에 염증유발 물질 LPS를 처리하여 cell에서의 NO 생성 정도를 측정한 결과, 정상군에 비해 LPS를 처리한 대조군에서 NO의 생성이 현저히 증가하였으며 LPS와 큰개불알풀 추출물을 함께 처리한 세포에서 농도 의존적으로 억제되어 100, 200, 400, 800 μg/mL 에서 NO 생성이 각각 92.0, 86.9, 54.7, 12.9%로 억제되는 경향을 확인하였 고 특히 800 μg/mL 농도에서 80% 이상의 높은 억제율을 나타냈다(Fig. 4).
큰개불알풀의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 표준물질인 ascorbic acid는 200 μg/mL 농도에서 79.6%의 소거능을 보였으며 큰개불알풀 추출물은 25, 50, 100, 200 μg/mL 순으로 농도 의존적으로 증가하여 각각 13.8%, 27.9%, 48.7%, 72.0%의 소거능을 나타냈고, 200 μg/mL 농도에서 ascorbic acid와 유사한 소거활성을 보였다(Fig. 1A).
LPS로 인한 NF-κB p65와 복합체 단백질인 IkB-α의 인산화 수준 또한 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 인산화 된 NF-κBp65는 800 μg/mL 농도에서 정상군과 같은 발현량을 보였다.
LPS에 의해 유도된 iNOS의 발현량 측정 결과, LPS 처리구에서 무처리구에 비해 유의하게 발현이 증가하였고 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL로 처리하였을 때 농도가 증가할수록 iNOS 발현량이 유의하게 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 5A).
p-p65와 p-IkB-α의 발현량을 확인한 결과 p-p65의 발현량은 LPS를 처리한 실험군에서 1.4배 정도 증가하였고 큰개불알풀 추출물을 400, 800 μg/mL로 처리하였을 때 각각 1.2, 1.0배로 농도 의존적으로 발현량이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 6A).
이러한 결과로부터 큰개불알풀 추출물의 유의적인 항산화 능력을 검정할 수 있었고, LPS 로 유도된 RAW 264.7 cell에서 독성 없이 전사인자 NF-κB의 활성 조절을 통해 염증성 단백질 iNOS와 COX-2의 발현, 염증매개인자 NO의 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 보이는 것으로 확인되었다.
후속연구
이와 같이 큰개불알풀 에탄올 추출물의 항산화 및 항염증 활성의 생리활성 평가를 통해 천연 기능성 소재로서 활용 가능성을 확인하였으며 추후 생리활성을 나타내는 유효성분 탐색 및 분리 연구가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
큰개불알풀이란?
큰개불알풀은 현삼과에 속하는 두해살이 귀화식물로 원산지는 유럽, 서아시아 등이며 양지바른 밭이나 길가에서 흔히 볼 수 있다. 현재 큰개불알풀에 관한 생리활성 연구로는 큰개불알풀에서 추출한 페닐에타노이드와 이리도이드 계통의 글리코시드가 암 치료에 중요 한 물질이라는 연구가 진행되었으며(Harput et al.
현재 염증 치료제로 사용되는 대표적 제제는?
, 2007; Lawrence, 2009). 일반적으로 사용되고 있는 항염증제는 염증 세포의 활성 억제 및 염증성 단백질의 생성 억제를 중점으로 하고 있으며, 현재 사용되는 대부분의 염증 치료제는 비스테로이드계와 스테로이드계와 같은 합성 항염제가 사용되고 있다. 그러나 장기간 복용 시 소화불량 및 위 .
NO와 PGE2를 생성하는 염증성 단백질의 종류는?
, 2015b). lipopolysaccharide (LPS)의 자극으로 활성화된 대식세포는 nitric oxide (NO)와 prostaglandin E2 (PGE2)와 같은 염증 매개인자를 분비하며 이 매개인자들은 각각 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현을 통해 생성된다(Leem et al., 2011).
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