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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서 합성물질인 Sodium Lauryl Sulfate (SLS) 및 Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)를 대체 할 수 있는 후보천연물질인 파와 탄닌산을 선택하여 반추위 내에서 메탄 저감에 관한 비교 연구를 실시하였다.
- 본 연구는 반추동물의 메탄 감소에 효과가 있는 합성첨가제를 대체 할 수 있는 천연첨가제를 찾고자 연구를 실시하였다. 첨가제인 MRA-1(파), MRA-2 (SLS), MRA-3 (SDS),MRA-4(파+탄닌산)를 만들어 발효시간대별(3, 6, 9, 12, 24 및 48 h) in vitro 시험을 실시하였다.
제안 방법
- pH 측정은 Weaton decapper (Weaton Co., USA)를 이용하여 serum bottle의 aluminum seal 및 butyl rubber를 제거한 후 배양액을 pH meter (Mettler Toledo, MP230)를 이용하여 측정하였다.
- 건물소화율은 serum bottle 내 nylon bag을 수거하여 물을 채운 수조에 넣고 Heidolphs Rotamax 120 (Heidolph Instrument, Germany)를 이용하여 100 rpm에서 20분간 3회 세척 후, 65℃의 dry oven (Jeio tech, Korea)에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량을 측정하였다. 그 후 발효 전 기질 량과의 차이를 구한 후, 이 차이를 발효 전 기질 량의 백분율로 환산하여 건물소화율을 계산하였다.
- 연구 절차 및 공시축의 사양관리는 국립경상대학교 실험동물 복지 윤리법에 따라 수행되었으며, 반추위액은 국립경상대학교 야생동물보호센터에서 사육중인 반추위 cannula가 장착된 한우 암소(체중 450 kg ± 30 kg)로부터 채취하였다. 공시동물의 사양관리는 농후사료(제 BBVMRO 158호)와 timothy를 6:4의 비율로 체중의 2%를 1일 2회(09:00 및 17:00) 분할 급여 하였으며 물과 미네랄 블록은 자유 섭취토록 하였다. 반추위액은 오전 사료급여 직전 반추위 cannula를 통해 채취하여 4겹의 cheese cloth로 여과 한 다음, 혐기상태의 2 L의 유리병에 담아 실험실로 이동하여 39℃ water bath (Lab Companion; BS-21)에 1시간 정치 후, 진공펌프로 사료 입자를 제거하여 in vitro 시험에 사용하였다.
- , Japan) 10 µL를 섞은 pre-mixture를 11 µL 분주하여 총 20 µL가 되게 하였다. 그 후 Denman과 McSweency (2006), Denman 등(2007)의 방법으로 Real-Time PCR(CFX96TM Real-Time system, BIO RAD)을 수행하였으며, total bacteria를 reference gene으로,섬유소 박테리아(Ruminococcus albus, Ruminocuccus flavefaciens, Fibrobacter succinogenes)와Methanogenic archaea 및 Ciliate associated methanogen의 발현율을 측정하였고, control구를 1로 보고 다른 첨가구를 상대정량하여 미생물 군집변화를 비교하였다.
- 건물소화율은 serum bottle 내 nylon bag을 수거하여 물을 채운 수조에 넣고 Heidolphs Rotamax 120 (Heidolph Instrument, Germany)를 이용하여 100 rpm에서 20분간 3회 세척 후, 65℃의 dry oven (Jeio tech, Korea)에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량을 측정하였다. 그 후 발효 전 기질 량과의 차이를 구한 후, 이 차이를 발효 전 기질 량의 백분율로 환산하여 건물소화율을 계산하였다.
- 미생물성장량은 배양액 1 mL를 채취한 다음, 3,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 사료입자를 제거하였다. 그 후 상등액을 14,000 rpm에서 3분간 재원심분리하여 미생물 pellet을 침전시킨 후 상등액은 제거하였고, pellet에 sodium phosphate buffer (pH 6.5)를 1 mL 첨가하여 vortex로 교반시키는 세척 과정을 3회 반복 진행한 후 spectrophotometer (BIO-RAD Model 680)로 550 nm에서 optical density (O.D) 값을 구하여 미생물성장량을 측정하였다.
- 미생물 군집변화를 측정하기 위하여 Real-Time PCR 분석을 실시하였다. 배양액 1 mL를채취한 다음, 3,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 사료 입자를 제거한 후, NucleoSpin Soil(Macherey-Nagel, Düren, Germany)를 이용하여 DNA를 추출 후 Nano-drop (Thermo Scientific,Wilmington, Delaware USA)을 이용하여 DNA의 농도를 측정 후 10 mg/µL로 보정하여 시험에 사용하였다.
- 배양액 1 mL를채취한 다음, 3,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 사료 입자를 제거한 후, NucleoSpin Soil(Macherey-Nagel, Düren, Germany)를 이용하여 DNA를 추출 후 Nano-drop (Thermo Scientific,Wilmington, Delaware USA)을 이용하여 DNA의 농도를 측정 후 10 mg/µL로 보정하여 시험에 사용하였다.
- 본 연구는 반추동물의 메탄 감소에 효과가 있는 합성첨가제를 대체 할 수 있는 천연첨가제를 찾고자 연구를 실시하였다. 첨가제인 MRA-1(파), MRA-2 (SLS), MRA-3 (SDS),MRA-4(파+탄닌산)를 만들어 발효시간대별(3, 6, 9, 12, 24 및 48 h) in vitro 시험을 실시하였다. pH는 발효시간동안 적정범위였으며, 건물소화율은 모든 발효시간대별 모든 처리구에서 대조구와 유의적(P>0.
- 휘발성지방산은 배양액 1 mL를 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리과정으로 사료입자를 제거하고, 상등액을 0.20 µM syringe filter로 여과 후 High Performance Liquid Chromatography(HPLC; Agilent-1200, Germany)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 2 mm으로 분쇄한 티모시를 65℃ dry oven에서 24시간 건조시킨 후 공시재료로 사용하였고, 3 cm × 5.5 cm로 자체 제작한 nylon bag (Ankom Forage bag: R1020)에 공시재료 0.95 g을 모든 처리구에 일괄적으로 사용하였으며, 0.05 g은 처리구별로 메탄 저감을 위한 원료로 사용하였다.
- 연구 절차 및 공시축의 사양관리는 국립경상대학교 실험동물 복지 윤리법에 따라 수행되었으며, 반추위액은 국립경상대학교 야생동물보호센터에서 사육중인 반추위 cannula가 장착된 한우 암소(체중 450 kg ± 30 kg)로부터 채취하였다.
데이터처리
- 통계처리는 SAS package program (2002)의 General Linear Model (GLM) procedure에 따라 처리하였으며, 각 처리구간의 유의성 검증을 위해 분산분석을 실시 후, Duncan’s multiple range test (Duncan, 1955)로 5% 수준에서 유의성을 검정하였다(P<0.05).
이론/모형
- 총 가스 발생량은 Theodorou 등(1994)의 방법으로 serum bottle의 head space에 있는 가스 발생량을 detachable pressure transducer 및 digital read-out voltmeter (Laurel Electronics, Inc., CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 그 후 9 mL vacutainer에 가스를 포집하여 Gas Chromatography (GC; HP 5890 Gas Chromatography, USA)를 사용하여 메탄 및 이산화탄소 발생량을 측정하였다.
성능/효과
- 05)으로 높았다. Ciliate-associated methanogens은 발효 24시간대 MRA-1, MRA-3 및 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮게 측정되었다. 따라서 파와 탄닌산은 반추위 내 메탄 저감효과가 있는 합성첨가제를 대체 할 수 있어 반추동물용 천연 메탄 저감제로서의 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- pH는 발효시간동안 적정범위였으며, 건물소화율은 모든 발효시간대별 모든 처리구에서 대조구와 유의적(P>0.05)인 차이를 보이지 않았고, 미생물성장량에도 부정적인 영향을 미치지 않았다.
- 파 및 탄닌산이 in vitro 반추위 내 발효성상 중 pH, 건물소화율 및 미생물성장량에 미치는 영향은 Table 2와 같다. pH는 적정 수준을 유지하고 있었으며, 발효시간이 경과함에 따라 낮아지는 경향을 나타내었다. 일반적인 반추위 내 pH는 5.
- , 2015). 따라서 이번 연구에 사용된 파와 탄닌산은 합성첨가제와 유사한 메탄 저감 효과를 보였고, 특히 이산화탄소 저감 효과는 합성첨가제보다 지속성 면에서 우수한 것으로 나타났다.
- 메탄 발생량은 발효 24시간대 MRA-1구를 제외한 나머지 처리구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮게 측정되었으며, 특히 이산화탄소 발생량은 MRA-4 첨가구에서 발효 9, 24, 48시간대에서 유의적(P<0.05)으로 낮았다.
- 메탄 발생량은 발효시간이 경과함에 따라 모든 처리구에서 증가하였고, 발효 24시간대 MRA-2, MRA-3 및 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았으며, 특히 MRA-3구에서 다른 처리구들에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮게 측정되었다.
- 메탄생성량 감소에 영향이 있는 프로피온산 함량은 발효 24시간대 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 미생물 성장량은 발효 6, 9시간대 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 모든 첨가구에서 12시간대와 48시간대에서 최대치에 도달하였다.
- 이러한 결과는 파 및 탄닌산은 미생물의 성장 지연 현상은 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된 파와 탄닌산은 적정 범위의 pH 상태를 유지시키고, 건물소화율 및 미생물성장량에 부정적인 영향을 미치지 않으므로 총 가스 및 메탄을 줄일 수 있는 천연첨가제의 조건에 적합하다고 사료된다.
- 본 연구에서 발효 24시간대 MRA-2구에서 ciliate-associated methanogens이 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았고 MRA-1 및 MRA-4구에서 또한 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮은 것으로 나타나 파와 탄닌산은 합성첨가제의 메탄 저감의 대체 효능이 있는 것으로 사료된다.
- 섬유소 분해 박테리아인 Ruminococcus albus와 Fibrobacter succinogenes는 발효 12시간대 모든 처리구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았고, 발효 24시간대 Ruminococcus albus는 MRA-1, MRA-2 및 MRA-3구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았으며, Fibrobacter succinogenes는 MRA-2, MRA-3 및 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 05)으로 높았으며, 모든 첨가구에서 12시간대와 48시간대에서 최대치에 도달하였다. 이러한 결과는 파 및 탄닌산은 미생물의 성장 지연 현상은 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구에 사용된 파와 탄닌산은 적정 범위의 pH 상태를 유지시키고, 건물소화율 및 미생물성장량에 부정적인 영향을 미치지 않으므로 총 가스 및 메탄을 줄일 수 있는 천연첨가제의 조건에 적합하다고 사료된다.
- 초산(Acetic acid) 함량은 발효 6, 9시간대 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮게 측정 되었으며, 발효 48시간대 초산 함량은 MRA-1구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮았다.
- 총 가스 발생량은 발효시간이 경과함에 따라 모든 처리구에서 증가하였고, 발효 3, 9시간대 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 낮게 측정되었다.
- 총 휘발성지방산 함량은 발효 24시간대 MRA-4구에서 대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 프로피온산(propionic acid) 함량은 발효 24시간대 MRA-4구가대조구에 비해 유의적(P<0.05)으로 높았다.
후속연구
- 05)으로 낮게 측정되었다. 따라서 파와 탄닌산은 반추위 내 메탄 저감효과가 있는 합성첨가제를 대체 할 수 있어 반추동물용 천연 메탄 저감제로서의 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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