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문제 정의
- 또한, 비만세포에서 유도된 히스타민, TNF-α, interleukin(IL-1β, IL-6) 같은 향염증성 사이토카인은 알레르기성 가려움과 염증을 유발하여 피부질환의 발병에서 핵심적 역할을 하게되므로 사람의 피부각질세포인 HaCaT cell에 대해 선발된 3종 시료가 나타내는 세포독성 유무를 확인하기 위한 실험을 수행하였다 (Zeng et al., 2016).
- 본 연구는 먼저 랫드 호염성 류케미아 세포인 RBL-2H3 세포주에서 항알레르기 활성을 가지는 식물자원을 탐색하기 위해 수행하였다.
- 연구에서는 선발된 3 종 시료가 사람의 T림프구세포인 Jurkat T cell에 대해 나타내는 세포증식율에 대한 영향을 확 ㅈ인하기 위해 IL-2 발현정도를 실험하였다.
제안 방법
- 56 종 식물 추출물의 세포독성을 평가하기 위해 RBL-2H3 세포를 48 well plate에 1.25 × 105 cells/well이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24 시간 배양하였다.
- 4)에 BSA 1 ㎎/㎖을 첨가하여 2 회 세척한 후, 각각의 선발시료를 농도별 (2, 10, 50, 250 ㎍/㎖)로 30 분 동안 반응시켰다. DNP-BSA를 최종 농도 0.1 ㎍/㎖를 처리하여 2 시간 동안 반응시키고, 얼음위에서 10 분간 방치하여 반응을 종결시켰다.
- Human primer는 TNF-α (s 5’-CCT ACC AGA CCA AGG TCA AC-3’' as 5’-AGG GGG TAA TAA AGG GAT TG-3’), IL-2 (s 5’-CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG-3’ as 5’-GGA AAT TGG GGT AGGAAGGA3’), GAPDH sense 5’-AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA-3’ antisense 5’-GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA3'로 제작하였다. GAPDH로 정량화한 후, 처리군의 관심 있는 유전자의 mRNA 수준을 대조군과 비교하여 유전자 발현 증가 정도는 다음의 등식을 이용하여 산출하였다.
- Human primer는 TNF-α (s 5’-CCT ACC AGA CCA AGG TCA AC-3’' as 5’-AGG GGG TAA TAA AGG GAT TG-3’), IL-2 (s 5’-CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG-3’ as 5’-GGA AAT TGG GGT AGGAAGGA3’), GAPDH sense 5’-AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA-3’ antisense 5’-GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA3'로 제작하였다.
- Human의 primer TNF-α는 5’-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3’ (sense), 5’-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3’ (antisense), IL-2 (s 5′-CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG-3’ as 5’-GGA AAT TGG GGT AGGAAGGA-3’) 그리고 GAPDH의 발현은 5’-CGG AG TCA ACG GAT TTG GTC GTA T-3’ (sense)와 5- AGCTTCTCCATGGTGGT GAAGAC-3’ (antisense)를 이용하여 확인하였다.
- Jurkat T세포에는 자극제로서 200 nM PMA와 1 μM A23187를 사용하여 log-phase에 해당하는 세포를 각각의 실험에 맞게 12 well, 6 well 혹은 60 ㎜ dish에 분주하여 interleukin-2 (IL-2)의 생성량을 분석하였다.
- Jurkat T세포에서의 항알러지 효과를 확인하기 위해 3 가지 시료 추출물을 각각 처리한 후 200 nM PMA와 1 μM A23187 로 자극하여 변화되는 IL-2 mRNA 발현 정도를 측정하였다.
- PCR 장치 (Life Technology Korea, Seoul, Korea)에서 Accupower® PCR PreMix tube에 역전사된 cDNA 1 ㎍ 과 forward primer와 reverse primer 각각 1 pmol을 사용하여 (total volume 20 ㎕) 중합 반응하였다.
- RNA isolation을 위해 피부각질세포인 HaCaT 세포와 Jurkat T세포는 6 well plate에서 키운 세포 (1 × 105 cell/㎖)를 선발된 식물 추출물을 처리하여 배양시킨 후 세포 자극 유도를 위해 HaCaT 세포주에는 자극제로서 10 ng/㎖ TNF-α와 10 ng/㎖ INF-γ를 사용하여 TNF-α mRNA 분비량을 측정하였다.
- Tyrode’s buffer로 2 회 세척 후 시료 추출물의 최종농도가 20 ㎍/㎖이 되도록 30 분간 처리한 후 0.04 ㎍/㎖ DNP-BSA 를 30 분간 처리하여 탈과립시키고 ice bath에서 10 분간 방치함으로써 반응을 종결시켰다.
- Tyrode’s buffer로 2 회 세척한 후 각 시료의 최종농도가 20 ㎍/㎖이 되도록 30 분간 처리하고 DNP-BSA (0.04 ㎍/㎖)를 30 분간 처리하여 탈과립시키고 ice bath에서 10 분간 방치함으로써 반응을 종결시켰다.
- cDNA 주형 및 각각의 특이적인 primer를 2× PCR master mix에 가하여 PCR 조건에 맞추어 반응을 수행하였다.
- 역전사반응은 추출된 전체 RNA (1 ㎍)와 oligonucleotide dT primer (100 pmol)을 Accupower® RT PreMix tube에 혼합한 후, 반응 전체 용량을 20 ㎕로 하여 70℃에서 5 분 동안 전 처리하였다. cDNA합성은 42℃에서 1 시간 동안 반응시켰고, 역전사 효소를 불활성화 시키기 위해 80℃에서 15 분 동안 열처리하였다.
- cell/㎖)을 각각 48 well plate에 분주하고 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 각 well에 10% FBS와 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액을 분주하여 배양한 후 시약을 처리하였으며 음성 대조군으로는 용매인 DMSO를 첨가하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도를 MTT 분석법으로 확인하였다.
- 각 세포들은 Tyrode’s buffer (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4)에 BSA 1 ㎎/㎖을 첨가하여 2 회 세척한 후, 각각의 선발시료를 농도별 (2, 10, 50, 250 ㎍/㎖)로 30 분 동안 반응시켰다.
- 단일농도에서의 1차 활성탐색결과 선발된 3 종의 시료의 RBL-2H3 세포 (1 × 106 cell/㎖)을 96 well plate에 분주한 후 세포독성을 평가하기 위해 각 시료를 2, 10, 50, 250 ㎍/㎖로 24 시간 처리하고 MTT 분석법으로 세포독성을 확인하였다.
- 대상 식물 추출물 56 개의 항알레르기 활성을 평가하기 위한 지표로서 비만세포에서의 β-hexosaminidase 방출량을 측정하였다.
- 대상 식물 추출물 56 개의 항알레르기 활성을 평가하기 위해 탈과립된 비만세포에서 IL-4의 분비량을 측정하였다. RBL2H3 세포를 48 well plate에 1.
- 따라서 본 연구에서는 국내에서 자생되고 있는 천연식물자원에 대해 항알레르기 효과를 측정하기 위해 비만세포와 유사한 rat basophilic leukemia (RBL)-2H3 세포에서 탈과립 정도를 확인할 수 있는 β-hexosaminidase 활성 및 IL-4 생성 정도를 분석하여 항알레르기 활성을 확인한 후 선발된 자원에 아토피성 피부질환 등의 완화에 효과를 나타내는지를 확인하고자 사람의 피부각질세포인 HaCaT 세포주에서 TNF-α와 Jurkat T세포주에서 IL-2의 생성정도를 분석하였다.
- 따라서, 스크리닝 실험으로 우수한 항알레르기 활성을 가진 것으로 선발한 이들 3 종의 시료에 대해 처리농도별 또는 대상세포를 달리하여 활성을 계속하여 분석하였다.
- 먼저 RBL-2H3 세포 (1 × 106 cell/㎖)을 24 well plate에 분주한 후 감작반응을 유도하기 위해 0.05 ㎍/㎖ 농도의 anti-DNP-IgE를 함유한 MEM 배지를 사용하여 24 시간 처리하였다.
- 반응이 종료된 시료 및 대조군의 상등액을 1,000 × g에서 10 분간 원심분리한 후 IL-4 rat ELISA kit를 사용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 배지를 제거하고 식물 추출물을 각각 최종농도가 20 ㎍/㎖ 이 되도록 30 분간 처리한 후, 추출물을 제거하고 MTT 용액 250 ㎕을 넣고 37℃, 5% CO2 조건에서 1 시간 반응시켰다. MTT 용액을 제거한 후 생성된 formazan을 녹여내기 위해 1 : 1 비율로 된 DMSO와 에탄올 250 ㎕를 넣고 호일을 이용하여 빛을 차단한 채 15 분간 잘 섞어주었다.
- 본 연구에서 살펴본 바와 같이 56 개의 식물 추출물에 대하여 탈과립화된 RBL-2H3 cell에서 IL-4 분비 저해, β-hexosaminidase 방출 저해 및 세포증식율을 분석함으로써 3개의 식물 추출물 [시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root), 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf) 및 시료번호 44 (지황, R. glutinosa, root)]을 선발하였고, 이들 3 종 시료를 RBL-2H3 세포, HaCaT 세포 및 Jurkat T세포에서 여러 농도로 처리한 후, 알레르기 관련 지표(β-hexosaminidase 방출, IL-4 분비, TNF-α mRNA 발현, IL-2 mRNA 발현) 및 세포증식에 미치는 영향을 분석하였다.
- 선발된 3 종 시료의 세포독성은 human keratinocyte HaCaT cell (5 × 105 cell/㎖) 및 Jurkat T cell (5 × 105 cell/㎖)을 각각 48 well plate에 분주하고 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
- 선발된 3 종 추출물의 RBL-2H3 세포에서의 탈과립화에 대한 영향 분석하기 위해 탈과립의 바이오마커인 β-hexosaminidase 분비량을 측정하였다.
- 스크리닝 실험 및 농도별 실험에는 rat basophilic leukemia (RBL-2H3) (KCLB NO. 22486), HaCaT (ATCC CRL-2404) 와 Jurkat T (ATCC PCS-800-011) 등의 세포주를 사용하였으 며, 이 중 RBL-2H3 세포는 1% penicillin-streptomycin 및 sodium pyruvate, 0.1% antimycotic solution, 10% heatinactivated FBS가 첨가된 MEM 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건의 배양기 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에서 배양하였다. RBL-2H3 세포 (1 × 105 cells/㎖) 는 96 well plate 또는 24 well plate에 분주하고 24 시간 배양한 후 실험하였다.
- 식물 추출물 56 종에 대한 IL-4 분비에 대한 저해효과를 최종농도가 20 ㎍/㎖인 조건에서 RBL-2H3 cell에서 분석하였으며 그 결과는 Table 2에 나타낸 바와 같다.
- 실시간 정량 (real-time PCR)은 total RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후, DyNAmo SYBR Green qPCR kit와 DNA Engine Opticon을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. cDNA 주형 및 각각의 특이적인 primer를 2× PCR master mix에 가하여 PCR 조건에 맞추어 반응을 수행하였다.
- 일반적으로 세포 독성 평가를 위해 수행되어지는 MTT assay는 담황색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium이 살아있는 세포 내의 미토콘드리아와 반응하여 암청색의 formazan을 형 성하는 원리를 이용한 실험으로 RBL-2H3 세포에 대한 56 종 의 식물 추출물의 독성 정도를 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였으며 그 결과는 Table 2 에 나타내었다.
- 전체 RNA농도 측정은 RNase가 처리된 0.1% DEPC water로 용해시켜 UV spectrophotometer (Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 260 ㎚/280 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- Human의 primer TNF-α는 5’-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3’ (sense), 5’-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3’ (antisense), IL-2 (s 5′-CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG-3’ as 5’-GGA AAT TGG GGT AGGAAGGA-3’) 그리고 GAPDH의 발현은 5’-CGG AG TCA ACG GAT TTG GTC GTA T-3’ (sense)와 5- AGCTTCTCCATGGTGGT GAAGAC-3’ (antisense)를 이용하여 확인하였다. 증폭된 PCR products는 1%의 agarose gel 에서 전기영동하여 band의 정량을 ImageJ 1.44d를 사용하여 band를 정량화하였다.
- 각 well에 10% FBS와 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액을 분주하여 배양한 후 시약을 처리하였으며 음성 대조군으로는 용매인 DMSO를 첨가하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도를 MTT 분석법으로 확인하였다. 48 well 배양용기의 각 well에 0.
대상 데이터
- Monoclonal anti-dinitrophenyl immunoglobulin E (DNPIgE), thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), penicillinstreptomycin, dimethyl sulfoxide (DMSO), 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), β-hexo substrate (4-methylumbelliferly-N-acetyl-β-D-glucosaminide in 0.05 M sodium acetate buffer, pH 4.4), bovine serum albumin (BSA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, 2,4-dinitrophenyl-bovine serum albumin (DNP-BSA)는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)로부터, IL-4 rat ELISA kit는 Abcam (Cambridge, England)에서 구입하여 사용하였다.
- RNase, RNA, Accupower® RT PreMix 및 Accupower® PCR PreMix는 Bioneer (Daejeon, Korea) 제품을 사용하였고, forward primer와 reverse primer 및 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 GenoTech (Daejeon, Korea)에서, DyNAmo SYBR Green qPCR kit는 Takara Bio (Otsu, Japan)에서, DNA Engine Opticon는 MJ Research (Deltona, FL, USA)에서 구입하였다.
- RPMI 1640 배지는 iNexus (Seongnam, Korea)의 제품을 사용하였으며 그 외의 시약은 스크리닝 실험에서와 동일한 것을 사용하였으며 일반시약은 특급시약을 구입하여 사용하였다.
- TNF-α와 interferone (INF)-γ는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서, diethyl pyrocarbonate (DEPC) water는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 에서 구입하였다.
- 선발된 식물자원에 대한 활성실험에 사용된 substrate buffer (2 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide in 0.1 M sodium citrate, pH 4.5), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 및 A23187는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였으며 bovine serum albumin (BSA)는 UBS products (Cleveland, OH, USA)에서, DNP-BSA는 Alpha Diagnostic International (San Antonio, TX, USA)에서, DMEM 배양액, 1% 항생제, DNP-bovine serum albumin는 iNexus (Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 스크리닝 실험에 사용된 minimum essential medium (MEM), sodium pyruvate, antimycotic solution은 Welgene (Gyeongsan, Korea)으로부터, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone Laboratories (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. Monoclonal anti-dinitrophenyl immunoglobulin E (DNPIgE), thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), penicillinstreptomycin, dimethyl sulfoxide (DMSO), 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), β-hexo substrate (4-methylumbelliferly-N-acetyl-β-D-glucosaminide in 0.
- 실험에 사용된 식물 추출물은 국립원예특작과학원 식물 추출물은행에서 제공받아 사용하였다. 식물의 산지, 추출된 식물부위, 추출조건, 채취시기 등 자세한 시료정보는 Table 1에 명시하였다.
- 피부각질세포인 HaCaT 세포와 사람의 T세포인 Jurkat T세 포는 37℃, 5% CO2 조건의 CO2 배양기에서 소태아 혈청 (10%), 페니실린G (100 IU/㎖), 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖), 그리고 L-글루타민 (2 mM)을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차 (means ± SD)로 나타내었으며 (n = 3), Microsoft excel의 Student’s t-test에 의해 유 의성을 검정하였다.
이론/모형
- HaCaT 세포와 Jurkat T세포는 semiquantitative real time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 방 법으로 역전사반응을 이용하여 mRNA에 대한 PCR 산물을 정량하였다. 역전사반응은 추출된 전체 RNA (1 ㎍)와 oligonucleotide dT primer (100 pmol)을 Accupower® RT PreMix tube에 혼합한 후, 반응 전체 용량을 20 ㎕로 하여 70℃에서 5 분 동안 전 처리하였다.
성능/효과
- 1)Final concentration of sample for the evaluation for βhexosaminidase and IL-4 release and cell proliferation was 20 ㎍/㎖, respectively.
- 3 가지 식물추출물 중에서 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root) 은 113.6 ± 2.7% - 155.9 ± 18.2%의 세포증식율을 농도의존적으로 나타내었고, 시료번호 44 (지황, R. glutinosa, root) 는 2 - 50 ㎍/㎖에서는 111.0 ± 3.2% - 132.4 ± 14.3%의 수치를 나타내 농도-의존적으로 증가하였으나 250 ㎍/㎖에서는 72.0 ± 10.4%로 수치의 감소가 확인되었다.
- 그 결과, 2 - 250 ㎍/㎖의 처리농도에서 3 가지 시료 모두 97.7 ± 1.9 - 105.0 ± 4.0%의 비교적 높은 수치를 나타내 Jurkat T cell에 대한 세포독성이 낮은 것으로 사료되었다 (Fig. 6).
- 그 결과, RBL-2H3 세포에서는 시료번호 44 (지황, R. glutinosa, root)의 처리농도-의존적으로 활성을 저해하는 것을 알 수 있었고 HaCaT 세포 및 Jurkat T 세포에서는 모두 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf)가 가장 효과적으로 항알러지 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다.
- 그 결과, 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root) 의 relative fold change는 7,287.8 ± 616.8, 5,644.7 ± 740.8, 5,216 ± 245.8 및 2,501.8 ± 1,210.8로서 –12.8, 12.6, 19.3 및 61.3%의 저해효과를 나타내었다.
- 따라서, HaCaT에서 세포증식에 대한 효과와 TNF-α mRNA 발현 정도를 분석한 결과를 종합하면 3 가지 선발 식물 중에서 는 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf)가 가장 효과적으로 항알러지성 반응을 저해할 것으로 사료되었다.
- 3%의 가장 낮은 세포증식율을 나타내었다. 따라서, 실험된 56 종의 식물 추출물은 최종농도 20 ㎍/㎖ 수준에 서 모두 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
- 또한, β-hexosaminidase 방출에 대한 실험에서는 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 3 가지 시료 중에서 시료번호 44 (지황, R. glutinosa, root) 가 2, 10, 50, 250 ㎍/㎖에서 각각 288.4 ± 18.0, 273.0 ± 27.7, 259.4 ± 16.0 및 215.0 ± 29.6%의 수치를 보여 각각 4.2%, 9.3%, 13.8% 및 28.6%의 저해율을 나타내었으며, 처리농도-의존적이고 유의하게 활성을 저해하는 것을 알 수 있었다.
- 또한, 선발된 3 종 시료가 피부각질세포 (HaCaT)에서 TNF-α 및 INF-γ로 자극한 후 TNF-α의 mRNA 발현정도를 RT-PCR로 분석한 결과, 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root)의 relative fold change가 각각 18.4 ± 1.4, 19.4 ± 1.4, 17.6 ± 2.1 및 9.6 ± 1.2로서 각각 10.3, 5.2, 14.1 및 53.0%의 저해효과를 나타내었다.
- 선발된 3 종 식물추출물에 대한 IL-4 방출 저해효과를 실험 한 결과, 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root) 는 20, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 75.4, 22.1 및 8.0 pg/㎖ 의 IL-4를 분비하였으며, 시료번호 44 (지황, R. glutinosa, root)는 30.3, 22.6 및 14.9 pg/㎖의 IL-4를 분비한 것을 확인할 수 있어 농도-의존적으로 IL-4의 감소효과를 보 인 것을 알 수 있었다. 하지만, 시료번호 42 (배나무, P.
- 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf)는 19.6 ± 1.2, 18.1 ± 1.6, 13.7 ± 0.3 및 5.5 ± 2.6의 relative fold change를 나타내 각각 10.2, 17.0, 37.3 및 74.7%의 저해효과 를 나타내었고, 시료번호 44 (지황, R. glutinosa, root)는 19.6 ± 2.1, 18.4 ± 1.4, 22.3 ± 2.9 및 8.7 ± 1.5의 값을 나타내 각각 11.5, 17.0, −0.6 및 60.6%의 저해효과를 나타내었다.
- 실험 결과, 56 종의 식물 추출물 중 최종농도 20 ㎍/㎖에 서 10% 이상의 저해효과를 나타낸 시료로는 시료번호 41 (층 층갈고리둥굴레, Polygonatum sibiricum F. Delaroche, root) 이 27.3 ± 5.6%, 시료번호 1 (복자기, Acer triflorum Kom., aerial part)이 22.1 ± 0.3%, 시료번호 44 [지황, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Steud., root]가 16.8 ± 5.6%, 시 료번호 9 (쑥, Artemisia princeps Pamp., root)가 14.9 ± 3.6%, 시료번호 45 (복분자, Rubus coreanus Miq., aerial part)가 13.5 ± 0.8%, 시료번호 42 [배나무, Pyrus pyrifolia var. culta (Makino) Nakai, leaf]가 12.9 ± 4.8%, 및 시료번호 5 [바디나 물, Angelica decursiva (Miq.) Franch. & Sav.]: 11.2 ± 7.7% 의 순으로 우수한 저해효과를 나타내었다 (Table 2).
- 실험결과, 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root), 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf) 및 시 료번호 44 (지황, R. glutinosa, root)는 2 - 250㎍/㎖의 농도에서 각각 91.8 ± 2.4% - 100.7 ± 3.6%, 96.9 ± 0.6% - 102.3 ± 2.4% 및 95.9 ± 2.8%에서 102.6 ± 2.4%의 수치를 나타내었으며 이는 각 추출물의 처리 농도 의존적으로 세포증식율이 감소하였으나 3 가지 시료 모두 비교적 독성이 낮은 것으로 사료되었다 (Fig. 4).
- 실험된 56 종의 식물 추출물은 DMSO를 처리한 대조군과 비교하였을 때 시료번호 25 [하수오, Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, root]가 135.3 ± 16.7%로 가장 높은 수치를 나타내었 고 시료번호 28 (선이질풀, Geranium krameri Franch. & Sav., stem)이 101.4 ± 8.3%의 가장 낮은 세포증식율을 나타내었다.
- 실험에 사용된 식물 추출물 중 35 개의 시료가 25.5 ± 2.8% 에서 0.0 ± 4.8%까지의 IL-4 분비에 대한 저해효과를 나타내었으며, 10% 이상의 저해효과를 나타낸 것으로는 시료번호 34 (인삼, Panax ginseng C. A. Meyer, leaf)가 25.5 ± 2.8%, 시 료번호 35 (인삼, P. ginseng, seed)가 25.5 ± 5.2%, 시료번호 39 (식방풍, Peucedanum japonicum Thunberg, root)이 24.6 ± 7.3%, 시료번호 37 (소엽, Perilla frutescens var. acuta Kudo, whole plant)이 24.4 ± 6.3%, 시료번호 43 (배나무, P. pyrifolia var. culta, branch)이 24.0 ± 5.0%, 시료번호 38 (식방풍, Peucedanum japonicum Thunberg, aerial part)이 23.1 ± 3.4%, 시료번호 36 (인삼, P. ginseng, root)이 22.4 ± 3.8%, 시료번호 40 (반하, Pinellia ternata Breit, root) 이 17.6 ± 4.0%, 44 (지황, R glutinosa, root)이 15.6 ± 4.0%, 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum F. Delaroche, root)이 15.1 ± 0.7% 그리고 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf)가 15.0 ± 8.3%의 순으로 11 개의 시료가 비교적 우수한 것으로 확인되었다.
- 0%의 저해율을 보였 다. 이러한 결과를 살펴볼 때 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf)는 처리농도에 비례하여 IL-2 mRNA 발현이 감소한 것으로 확인되었다.
- 이러한 수치는 양성대조물질로 사용한 R406 (1 μM)이 254.7 ± 31.9%의 β-hexosaminidase 활성을 보여 15.4%의 저 해효과를 보인 것을 감안할 때, 매우 우수한 효과임을 나타내 는 결과이다.
- 이와 같이 Jurkat T세포에서의 세포증식율 및 IL-2 mRNA 발현 감소 효과를 종합하여 볼 때 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf)가 가장 효과적으로 Jurkat T세포에 서의 과민반응을 완화하는 효과를 나타낼 것으로 사료되었다 (Fig. 7).
- 한편, 이렇게 최종농도 20 ㎍/㎖에서 스크리닝된 56 개의 식물 추출물 중에서 β-hexosaminidase 방출 저해효과 및 IL-4 분비에 대한 저해효과에서 모두 10% 이상으로 우수한 것은 시료번호 41 (층층갈고리둥굴레, P. sibiricum, root), 시료번호 42 (배나무, P. pyrifolia var. culta, leaf) 및 시료번호 44 (지 황, R. glutinosa, root)의 3 개 시료가 확인되었다.
후속연구
- 이처럼 세포주에 따라 선발한 식물추출물의 효과가 다른 것은 각 시료가 효과를 발휘하는 target 세포의 차이에 따른 것으로 사료되는 바, 추후 보다 상세한 연구가 진행될 필요가 있다고 사료되었다.
- 한편, 알레르기 반응에서 트리거 (trigger)가 되는 비만세포의 탈과립을 억제하는 물질은 제I 형 알레르기 반응을 억제할 수 있음을 시사하므로 항알레르기 소재로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
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