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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 비파 식초를 이용하여 사염화탄소로 흰 쥐에게 간독성을 일으켰을 때 생체 내에서 간독성 보호 효과 작용 가능성을 알아보고 기초 자료로 제공하고자 한다.
- 비파 식초가 사염화탄소에 의한 간독성에 대한 보호효과를 흰 쥐를 이용하여 확인하고자 연구하였다. 4주간 SD rat 암컷을 정상군, 음성대조군, 양성대조군, 비파 식초군으로 나누어 샘플을 처리하였고, 29일째 되는 날 사염화탄소를 처리하였다.
- . 이 연구는 사염화탄소로 간 손상을 유도 하였을 때 비파 식초의 간 보호 효과에 대하여 평가하기 위하여 실시되었다.
제안 방법
- 비파 식초가 사염화탄소에 의한 간독성에 대한 보호효과를 흰 쥐를 이용하여 확인하고자 연구하였다. 4주간 SD rat 암컷을 정상군, 음성대조군, 양성대조군, 비파 식초군으로 나누어 샘플을 처리하였고, 29일째 되는 날 사염화탄소를 처리하였다. 혈청 AST 및 ALT 효소 활성 수치 변화에서 비파 식초가 사염화탄소를 단독으로 투여한 군보다 유의한 수치로 각각 49.
- vinegar)으로 나누어 실험하였다(Table 1). 4주간 비파 식초와 밀크 씨슬을 200 mg/kg의 비율로 매일 같은 시간에 주 7회로 경구투여 하였으며, 4주간 샘플 처리가 끝난 후 29일째 되는 날 실험 동물에 간 손상을 유발시키기 위해 사염화탄소와 olive oil을 1:1 비율로 혼합하여 3.3 mL/kg의 용량으로 1회 복강 투여하여 간 손상을 일으켰다. 그 후 18시간동안 절식 후 CO2로 마취하여 개복 후 하대정맥에서 혈액을 얻었으며, 4엽의 간을 전부 적출하여 식염수로 세척하였다.
- SOD 효소활성 측정은 Beauchamp와 Fridovich 법5)의 변형된 방법에 따라서 0.2 M K-phosphate buffer (pH 7.4)를 672 µL, 1 mM xanthine 100 µL, 1% sodium deoxychlorate300 µL, 1.5 mM KCN 300 µL, 0.2 mM cytochrome C 1500µL를 넣은 혼합액에 간 균질시료 80 µl를 넣고, xanthine oxidase 원액 10 µL를 넣은 후 Elisa (Microtiter plate reader, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도 변화를 2분 동안 측정하였다.
- 실험동물은 Sprague-Dawley계 암컷인 6주령 흰 쥐를 (주)샘타코 코리아(Osan, Korea)로부터 구입하여 사용하였고, 사육기간 동안에는 일반 식이와 물은 자유롭게 섭취시켰다. 각 연구에 사용되는 동물은 난괴법(Rando-mized complete block design)에 의하여 5마리씩 4군으로 나누어 분리시켰으며 각각의 그룹은 정상군(NOR, water), 음성대조군(N-CON, CCl4, water), 양성대조군(P-CON, CCl4, milk thistle), 비파식초군(EJV, CCl4,Eriobotrya japonica Lindl. vinegar)으로 나누어 실험하였다(Table 1). 4주간 비파 식초와 밀크 씨슬을 200 mg/kg의 비율로 매일 같은 시간에 주 7회로 경구투여 하였으며, 4주간 샘플 처리가 끝난 후 29일째 되는 날 실험 동물에 간 손상을 유발시키기 위해 사염화탄소와 olive oil을 1:1 비율로 혼합하여 3.
- 간 조직을 10% formaldehyde 용액에 48시간 정도 고정시킨 후, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol에서 순차적으로 각각 탈수시켰다. 탈수시킨 조직을 xylene 처리 후, paraffin으로 포매 하고 microtome을 이용하여 4 µm의 조직 절편으로 잘라서 slide glass에 올려놓았다.
- 3 mL/kg의 용량으로 1회 복강 투여하여 간 손상을 일으켰다. 그 후 18시간동안 절식 후 CO2로 마취하여 개복 후 하대정맥에서 혈액을 얻었으며, 4엽의 간을 전부 적출하여 식염수로 세척하였다. 혈청을 얻기 위해 혈액은 10분 동안 3000 rpm에서 원심 분리하여 얻었으며 적출한 간과 함께−70℃ deep freezer에 보관하였다 (신라대학교 동물윤리위원회에서 인증 받음.
- 혈액에서의 생화학적 분석은 혈청중의 Aspartate aminotransferase (AST)와 Alanine aminotransferase (ALT) 활성을 자동 생화학분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm)으로 측정하였다.
- 건조한 잎 30 kg과 열매 20 kg의 중량 비로 혼합하여 1년 동안 서늘한 곳에 숙성 시킨다. 혼합된 잎과 열매 80%와 양조 식초 20%를 혼합하여 25~28℃의 온도에서 6개월간 숙성시키며 총 용량은 1L로 기준을 두었다. 이렇게 숙성된 비파나무의 잎과 열매를 이용한 비파 식초를 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 Sprague-Dawley계 암컷인 6주령 흰 쥐를 (주)샘타코 코리아(Osan, Korea)로부터 구입하여 사용하였고, 사육기간 동안에는 일반 식이와 물은 자유롭게 섭취시켰다. 각 연구에 사용되는 동물은 난괴법(Rando-mized complete block design)에 의하여 5마리씩 4군으로 나누어 분리시켰으며 각각의 그룹은 정상군(NOR, water), 음성대조군(N-CON, CCl4, water), 양성대조군(P-CON, CCl4, milk thistle), 비파식초군(EJV, CCl4,Eriobotrya japonica Lindl.
- 실험에서 사용된 비파 식초는 최혜빈의 비파 식초에서 제공을 받았고, 비파 식초의 제조 방법은 다음과 같다. 비파나무의 잎과 열매를 깨끗하게 세척한 뒤 24시간 동안 건조 시킨다.
- 혼합된 잎과 열매 80%와 양조 식초 20%를 혼합하여 25~28℃의 온도에서 6개월간 숙성시키며 총 용량은 1L로 기준을 두었다. 이렇게 숙성된 비파나무의 잎과 열매를 이용한 비파 식초를 실험에 사용하였다.
- , Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도 변화를 2분 동안 측정하였다. 효소활성도는 Sigma사의 superoxide dismutase standard를 표준액으로 사용하여 측정하였다.
이론/모형
- CAT 효소 활성 측정은 Aebi법1)으로 측정하였다. Phospate buffer (0.
- 단백질의 정량은 간 시료를 0.5 g 취하여 2.5 mL의 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4)에 homogenation 시킨 것을 시료로 하며, Lowry 법22)에 의해서 실험을 진행하였다. D.
성능/효과
- AST 활성 수치 변화는 NOR군은 86.67 ± 6.66 mg/dL,P-CON은 72.00 ± 3.61 mg/dL, N-CON은 218.33 ± 6.11 mg/dL, EJV군은 109.67 ± 6.81 mg/dL로, N-CON이 가장 높은 수치를 나타내었고 밀크씨슬과 사염화탄소를 투여한 PCON군이 가장 낮은 수치를 나타내었다.
- 51mg/dL로, 아무것도 처리하지 않은 NOR군이 가장 높은 수치였으며 N-CON군이 가장 낮은 수치를 나타났다. EJV군은 N-CON군과 비교하였을 때 58.09%로 유의한 차이로 증가하는 경향을 보였으며, 사염화탄소와 밀크씨슬을 투여한 P-CON군과 비교했을 때 큰 차이가 없는 것으로 보아, 간 기능을 향상시키는 시중에 판매하는 밀크씨슬 만큼의 회복 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 66 mg/dL로, 사염화탄소를 단독으로 투여한 N-CON군이 가장 높은 수치를 나타내고 있으며, 아무것도 처리하지 않은 NOR군이 가장 낮은 수치를 보였다. EJV군은 N-CON군에 비하여 낮은 수치를 보이고 있으며 유의한 차이로 75.88% 감소하였다.
- NOR군은 8.62 ± 0.10 mg/dL, 사염화탄소와 밀크씨슬을 투여한 P-CON군은 6.73 ± 1.08 mg/dL, 사염화탄소를 단독 투여한 N-CON군은 1.80 ± 0.41 mg/dL, 사염화탄소와 비파식초를 투여한 EJV군은 4.77 ± 0.60 mg/dL로, NOR군이 가장 높은 수치를 나타났고, N-CON군이 가장 낮은 수치를 나타났다.
- NOR군은 9.08 ± 0.17 mg/dL, 사염화탄소와 밀크씨슬을 투여한 P-CON군은 7.08 ± 0.55mg/dL, 사염화탄소를 단독으로 투여한 N-CON군은 2.77 ±0.38 mg/dL, 사염화탄소와 비파식초를 투여한 6.61 ± 0.51mg/dL로, 아무것도 처리하지 않은 NOR군이 가장 높은 수치였으며 N-CON군이 가장 낮은 수치를 나타났다.
- 001). 간 조직에서는 CAT 및 SOD 효소 활성은 비파 식초군이 사염화탄소를 단독으로 투여한 음성대조군보다 유의한 차이로 높은 활성 수치를 보였다. 조직학적 관찰에서는 비파식초군이 사염화탄소를 단독으로 투여한 음성대조군에 비해 지방변성이 적게 분포하고, 조직의 섬유화가 진행되지 않았으며, 정상군과 비슷한 간세포의 구조가 관찰 되었다.
- 간 조직학적 병변 관찰에서 사염화탄소만 단독으로 투여한 N-CON군은 지방변성으로 인한 공포화 현상이 넓게 분포되어 있고 간세포의 구조가 일정하게 배열되어 있지 않으며 섬유화가 진행되는 것으로 나타났다. 반면 비파식초와 사염화탄소를 투여한 EJV군의 간 조직은 지방변성으로 인한 공포화 현성이 적게 분포되어 있고 정상군과 비슷한 간세포 구조로 배열되어 있으며 섬유화는 진행되지 않은 것으로 보아 간 독성 예방에 뚜렷한 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
- 따라서 본 연구에서 비파 식초는 사염화탄소로 인한 간 손상을 억제하여 간 기능을 활성화 하는 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구에서 비파 열매와 비파 잎을 이용한 비파 식초는 간에서의 SOD 활성 증가에 영향을 미쳐 간독성 예방 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구에서는 비파 식초 또한 비슷한 결과가 나타나는 것으로 보아 활성산소를 제거하여 생체 내 대사과정에서 생성되는 과산화물로부터 생체 조직을 보호하고,간 손상을 방어하는 효과가 있는 것으로 확인 되었다.
- 따라서 혈청 중 AST와 ALT의 활성도를 유의적인 감소를 나타내어 비파 식초가 간세포의 손상을 방어하며, 간 기능에 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 4C). 밀크씨슬과 사염화탄소를 투여한 P-CON군은 정상군과 비슷하게 간 조직 대부분 정상적인 결과를 보여주었으며(Fig. 4B), 비파식초와 사염화탄소를 투여한 EJV군은 부분적인 지방변성으로 인한 공포화 현상이 관찰되었고 간세포의 구조는 정상군과 비슷한 모양으로 일정하게 배열되어 있는 것으로 관찰 되었다(Fig. 4D).
- 간 조직학적 병변 관찰에서 사염화탄소만 단독으로 투여한 N-CON군은 지방변성으로 인한 공포화 현상이 넓게 분포되어 있고 간세포의 구조가 일정하게 배열되어 있지 않으며 섬유화가 진행되는 것으로 나타났다. 반면 비파식초와 사염화탄소를 투여한 EJV군의 간 조직은 지방변성으로 인한 공포화 현성이 적게 분포되어 있고 정상군과 비슷한 간세포 구조로 배열되어 있으며 섬유화는 진행되지 않은 것으로 보아 간 독성 예방에 뚜렷한 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
- 비파 식초는 혈청 AST와 ALT 활성 수치가 사염화탄소를 단독으로 투여한 음성대조군보다 유의한 차이(p < 0.001)를 보여 간 보호 효과가 있는 것으로 나타났으며, 간 질환을 예방하는 건강기능식품으로도 가능성이 있다고 사료된다.
- 4에 나타내었다. 사염화탄소를 단독으로 투여한 N-CON군의 간 조직에서는 지방변성으로 인한 간 조직의 공포화 현상이 나타났으며 간세포의 괴사로 인한 간세포 구조가 일정하게 배열되어 있지 않은 것으로 나타났다(Fig. 4C). 밀크씨슬과 사염화탄소를 투여한 P-CON군은 정상군과 비슷하게 간 조직 대부분 정상적인 결과를 보여주었으며(Fig.
- 사염화탄소만 단독으로 투여한 N-CON군은 catalase 및 SOD 효소 활성이 정상군에 비해 현저하게 감소하는 경향을 보이고 있고 비파식초와 사염화탄소를 처리한 EJV군은 catalase 및 SOD 효소 활성을 활성화 시키는 효과가 있어 N-CON군보다 유의하게 증가(p < 0.001)하는 경향을 보였다.
- 조직학적 관찰에서는 비파식초군이 사염화탄소를 단독으로 투여한 음성대조군에 비해 지방변성이 적게 분포하고, 조직의 섬유화가 진행되지 않았으며, 정상군과 비슷한 간세포의 구조가 관찰 되었다. 이와 같은 결과를 보아 비파 식초는 항산화 효소의 증가로 활성산소를 제거하여 간 손상을 억제할 뿐 아니라 혈청의 AST 및 ALT 효소 활성을 감소시켜 간 보호 효과가 있는 것으로 건강기능식품으로써 긍정적인 가능성이 있다고 사료된다.
- 혈청 AST 및 ALT 효소 활성 수치 변화에서 비파 식초가 사염화탄소를 단독으로 투여한 군보다 유의한 수치로 각각 49.77%, 75.88%로 감소하였다(p <0.001).
후속연구
- 따라서 본 연구는 비파식초를 4주간 처리하여 사염화탄소로 간독성을 유도한 흰 쥐에게 간독성 예방 효과 정도를 조사한 결과, 모든 데이터에서 사염화탄소로 간독성을 유도한 흰 쥐에서 비파식초가 간을 보호하는 예방 효과 결과를 보였으며, 이는 간독성에 대한 보호 효과를 가진 건강기능식품 소재 개발로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 더 나아가 약물 개발의 주요 소재로도 활용될 가능성이 있다고 사료된다.
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