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문제 정의
- 본 연구에서는 수용액 상에서 pH에 따라 제한된 용해도를 보이는 키토산 고분자체와 음이온성 고분자 전해질인 PAA의 정전기적 상호작용을 이용한 polyplex 형성 및 이를 토대로 한 하이드로젤 입자의 합성과 특성 분석에 관하여 논의하였다. 형성된 polyplex 입자의 pH에 따른 안정성은 henderson–hasselbalch 관계식으로 계산된 표면 전하량에 따라 예측된 결과와 정확히 부합하였으며 이러한 결과는 동적 광산란 분석 및 ζ–potential 측정과 polyplex 용액의 혼탁도 분석을 통하여 확인되었다.
- 연구에서는 키토산 고분자체를 이용하여 표면전하가 제어된 콜로이드 입자를 형성할 수 있도록 상반된 전하를 지닌 음이온성 고분자 전해질인 poly(acrylic acid), PAA와의정전기적 상호작용을 통하여 polyplex 콜로이드 입자를 형성하고자 한다. 키토산 GlcN의 ammonium(pKa≈6.
제안 방법
- 3). 24 시간 반응 후, EDC의 부산물인 urea는 투석 과정을 통하여 제거하였으며, 가교화된 polyplex 입자의 amide 결합은 교차결합 반응 전, 후의 입자를 동결 건조하여 적외선 흡광 분석을 통하여 관찰하였다(Fig. 4A). 우선, 교차 결합 반응 전 polyplex 입자의 스펙트럼을 보면 (black line), 중성 pH 조건에서 이온화된 PAA의 carboxylate(COO-) 작용기의 anti-symmetric(1550 cm–1)과 symmetric(1410 cm–1) stretching peak을 확인할 수 있으며, 또한 1000–1100 cm–1에서 키토산의 C–O 작용기가 관찰되어 polyplex를 구성하는 PAA의 acrylate 작용기와 키토산의 GlcN 단량체를 확인할 수 있다.
- 균일한 크기 분포가 관찰된 PAA-키토산 polyplex 입자에 대하여 실험군에 포함된 PAA의 acrylate 작용기를 대상으로 10 mol % 의 교차 결합을 위하여 100 당량의 N-ethyl-N-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide·hydrochloride(EDC)를 첨가하였다. 24시간 동안 교반 후, 투석을 통하여 O-acyl-isourea를 포함한 부생성물을 제거하고 순수한 생성물을 동결 건조하여 얻었다. 생성물 1 g을 취하여 푸리에 변환 적외선 분광계(FT-IR)로 분석 하여 amide 결합 형성을 확인하였다.
- Polyplex 입자의 표면 전하는 pH에 따라 형성되는 키토산과 PAA의 [COO–]/[NH3+] 유효 작용기의 비율에 따라 결정되는데, 이때 전체 표면 전하가 0이 되는 화학적 환경에서 콜로이드 안정성을 유지할 수 있는 정전기적 반발력이 사라지게 되어 콜로이드입자의 응집현상(flocculation)이 나타날 것으로 예상된다. Fig. 1B에서는 이러한 과정에서 나타나는 응집된 콜로이드입자를 확인하기 위한 용액의 혼탁도를 pH 변화와 PAA 몰비율 변화에 따른 500 nm 파장에서의 빛 투과도 변화를 이용하여 관찰하였다. 12 실제로 polyplex 입자의 ζ–potential이 0이 되는 PAA의 몰 비율은 용액의 pH가 6에서 4로 감소함에 따라 ~40 mol %에서 70 mol %, 85 mol %로 증가함을 알 수 있는데, 용액의 혼탁도 또한 동일한 pH 조건에서 각각 ~50, 65, 90 mol %의 PAA의 몰 비율에서 최고치가 관찰되어 polyplex 입자의 표면 전하에 따른 콜로이드 안정성 변화를 확인할 수 있다.
- PAA의 acrylate와 키토산의 amine 작용기가 amide 결합을 통하여 고분자 하이드로젤 네트웍을 형성할 수 있도록 carbodiimide를 통한 결합 반응을 이용하였다. 균일한 크기 분포가 관찰된 PAA-키토산 polyplex 입자에 대하여 실험군에 포함된 PAA의 acrylate 작용기를 대상으로 10 mol % 의 교차 결합을 위하여 100 당량의 N-ethyl-N-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide·hydrochloride(EDC)를 첨가하였다.
- 형성된 polyplex를 동적 광산란(Dynamic light scattering, DLS) 분석을 통하여 수력학적 직경(Hydrodynamic diameter, DH)과 표면 전하(Zeta potential, ζ)를 측정한다. 같은 방법으로 pH 5, 6으로 조절된 각각의 시료를 혼합한 후, 형성된 polyplex 입자 크기 (DH)와 표면 전하를 측정하였다.
- 균일한 크기 분포가 관찰된 PAA-키토산 polyplex 입자에 대하여 실험군에 포함된 PAA의 acrylate 작용기를 대상으로 10 mol % 의 교차 결합을 위하여 100 당량의 N-ethyl-N-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide·hydrochloride(EDC)를 첨가하였다.
- 7) 작용기는 pH 4~6 화학적 환경에서 각각 양이온성, 음이온성 고분자 전해질을 주로 형성하므로 이들 단량체 사이의 정전기적 상호작용을 통하여 polyplex가 형성될 것으로 기대된다. 또한 이러한 두 가지 고분자 전해질의 단량체들 사이의 상호작용은 고분자-고분자 사이의 다가성(polyvalent) 결합을 유도하여 향상된 결합활성(avidity) 및 가역적 결합이 가능하도록 한다. 11이와 같이 형성된 polyplex 입자는 이용되는 고분자 단량체인 GlcN와 acrylate의 구성 비율에 따라 음이온성 입자와 양이온성 입자의 형성이 가능하며, 이 때 입자 표면에 나타나는 표면 전하는 콜로이드 입자 간의 정전기적 반발력을 제공하여 형성된 polyplex 입자의 콜로이드 안정성을 유지할 수 있다.
- 24시간 동안 교반 후, 투석을 통하여 O-acyl-isourea를 포함한 부생성물을 제거하고 순수한 생성물을 동결 건조하여 얻었다. 생성물 1 g을 취하여 푸리에 변환 적외선 분광계(FT-IR)로 분석 하여 amide 결합 형성을 확인하였다. 얻어진 하이드로젤 나노입자는 pH가 조절된 50 mM NaCl 용액에서 온도에 따른 수력학적 직경(DH) 변화와 표면 전하를 측정하였다.
- 생성물 1 g을 취하여 푸리에 변환 적외선 분광계(FT-IR)로 분석 하여 amide 결합 형성을 확인하였다. 얻어진 하이드로젤 나노입자는 pH가 조절된 50 mM NaCl 용액에서 온도에 따른 수력학적 직경(DH) 변화와 표면 전하를 측정하였다.
- 각 샘플의 zeta(ζ)–potential은 전기영동 이동성 값을 이용해 Smoluchowski equation을 통해 계산되었다. 콜로이드 입자 용액의 혼탁도 분석은 Lambda 35 spectrophotometer(Perkin Elmer, Waltham, MA)를이용하여 500 nm 파장에서의 투과도를 통하여 측정하였고, FT-IR 스펙트럼은 Bruker TENSOR II FTIR spectrometer를 이용하여 측정하였다.
- 형성된 polyplex 입자의 크기를 확인하기 위하여 동적 광산란 법(dynamic light scattering, DLS)을 통하여 acrylate mol % 별 pH에 따른 입자의 수력학적 직경(hydrodynamic diameter, DH)과 이를 통한 입자의 균일도를 polydispersidy index(PDI) 값을 비교하여 분석하였다(Fig. 2). Polyplex 입자의 크기는 Fig.
- 형성된 polyplex를 동적 광산란(Dynamic light scattering, DLS) 분석을 통하여 수력학적 직경(Hydrodynamic diameter, DH)과 표면 전하(Zeta potential, ζ)를 측정한다.
- 형성된 나노 사이즈 하이드로젤의 크기와 표면전하는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)에서 633 nm He−Ne laser를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 0%)는 Samchun Chemical Co.(Pyeongtaek, Korea)에서 구매하여 추가적인 정제없이 사용하였다. 모든 측정용 기기는 가톨릭대학교 공동기기원의 분석기기를 이용하였다.
- (Pyeongtaek, Korea)에서 구매하여 추가적인 정제없이 사용하였다. 모든 측정용 기기는 가톨릭대학교 공동기기원의 분석기기를 이용하였다. 형성된 나노 사이즈 하이드로젤의 크기와 표면전하는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)에서 633 nm He−Ne laser를 사용하여 측정하였다.
데이터처리
- 형성된 나노 사이즈 하이드로젤의 크기와 표면전하는 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)에서 633 nm He−Ne laser를 사용하여 측정하였다. 나노입자의 크기분포는 non-negative least-squares(NNLS) 분석을 통하여 얻었다. 각 샘플의 zeta(ζ)–potential은 전기영동 이동성 값을 이용해 Smoluchowski equation을 통해 계산되었다.
이론/모형
- 각 샘플의 zeta(ζ)–potential은 전기영동 이동성 값을 이용해 Smoluchowski equation을 통해 계산되었다.
성능/효과
- Acrylate 30 mol %로 구성된, 키토산의 함량이 더 높은 polyplex 입자의 경우, 모든 pH 조건에서 높은 양전하성 표면 전하를 지녀 용액의 혼탁도가 낮은 안정한 입자가 형성되는 것을 관찰할 수 있으나, 모든 pH 조건에서 전반적으로 0.2 이상의 PDI 값이 관찰되어 상대적으로 다소 낮은 균일도의 콜로이드 입자가 형성됨을 확인할 수 있다(Fig. 2A, Bottom). 이와 같이 키토산의 몰분율이 높은 polyplex가 상대적으로 큰 크기의 불균일한 입자를 형성하는 이유는, 중성 조건의 수용액 상에서 낮은 용해도를 지닌 키토산의 함량이 높아짐에 따라, 형성된 polyplex입자에서 수화 가능한 영역의 상대적인 비율이 감소하여 수용액 상에서 수화되지 못하고 부분적으로 석출되는 부분이 증가하여 입자의 크기 또한 커지는 것으로 예상된다.
- 교차 결합되지 않은 polyplex 입자의 온도에 따른 수력학적 직경을 측정해 보면, 25 oC와 50 oC의 두 온도 조건에서 유의미한 평균 직경의 변화가 관찰되지 않아 특징적인 온도 감응성이 나타나지 않았으며, 그에 따라 키토산과 PAA의 교차 결합 반응으로 형성된 acryl amide 작용기가 앞서 관찰된 하이드로젤의 LCST에 주요한 영향을 미침을 확인할 수 있다(Fig. 4B, bottom). 반면, 높은 온도 조건의 polyplex 입자에서 더 넓은 분포의 수력학적 직경이 관찰되었는데, 이는 고온에서 약해진 이온성 상호작용으로 인하여 나타나는 polyplex 입자의 상대적으로 낮은 콜로이드 안정성 때문으로 사료된다.
- 반면, 키토산의 함량이 낮은(acrylate 70, 90 mol %)polyplex 입자는 ζ–potential 관찰 결과, 충분한 표면 전하를 지닌 pH 조건에서 모두 낮은 PDI 값을 나타내어 입자 크기의 편차가 크지 않은, 상대적으로 균일한 입자를 형성함을 확인할 수 있다. 따라서 이러한 일련의 실험 결과를 통하여 polyplex 입자의 구성 성분에 따른 표면 전하량과 이를 통한 콜로이드 입자의 안정성 변화를 관찰할 수 있다.
- 또한 용액의 pH 변화에 따라 산성 조건에서는 높아진 H+ 이온 농도로 인하여 polyplex 입자의 ζ–potential이 전반적으로 증가하는 반면, 높은 pH 조건에서는 polyplex 입자의 표면 작용기에서 H+이 제거됨으로써 산성 조건에서 보다 상대적으로 낮아진 ζ–potential 이 관찰되었다.
- 반면, 낮은 혼탁도가 관찰된 pH 5와 6 조건에서는 각각 98 ± 18nm와 94 ± 17 nm 크기의 입자가 낮은 PDI 값으로 관찰되어 음전하로 인한 입자간 반발력으로 인하여 안정화된 콜로이드 입자가 형성되었음을 확인 할 수 있다.
- 반면, 키토산의 함량이 낮은(acrylate 70, 90 mol %)polyplex 입자는 ζ–potential 관찰 결과, 충분한 표면 전하를 지닌 pH 조건에서 모두 낮은 PDI 값을 나타내어 입자 크기의 편차가 크지 않은, 상대적으로 균일한 입자를 형성함을 확인할 수 있다.
- 우선 acrylate 90 mol %로 구성된 polyplex 입자의 경우,앞서 관찰된 바와 같이 pH 4 조건에서 높은 혼탁도를 보였으며, 또한 감소된 ζ–potential로 인하여 DLS 분석 결과, 증가된 크기(DH >1000 nm)와 높은 PDI 값을 보여서, 콜로이드 입자의 응집 현상이 확인되었다(Fig. 2A, Top).
- 우선, 교차 결합 반응 전 polyplex 입자의 스펙트럼을 보면 (black line), 중성 pH 조건에서 이온화된 PAA의 carboxylate(COO-) 작용기의 anti-symmetric(1550 cm–1)과 symmetric(1410 cm–1) stretching peak을 확인할 수 있으며, 또한 1000–1100 cm–1에서 키토산의 C–O 작용기가 관찰되어 polyplex를 구성하는 PAA의 acrylate 작용기와 키토산의 GlcN 단량체를 확인할 수 있다.
- 전반적으로 양이온성을 지닌 키토산의 몰비율이 높아짐에 따라 ζ–potential이양의 값으로 증가하는 반면, 음이온성을 지닌 PAA의 비율이 높아질수록 ζ–potential이 감소하여 음의 값을 갖는 경향성을 볼 수 있다.
- 형성된 polyplex 입자의 pH에 따른 안정성은 henderson–hasselbalch 관계식으로 계산된 표면 전하량에 따라 예측된 결과와 정확히 부합하였으며 이러한 결과는 동적 광산란 분석 및 ζ–potential 측정과 polyplex 용액의 혼탁도 분석을 통하여 확인되었다. 형성된 polyplex 입자의 표면 전하는 키토산과 PAA 고분자체의 몰비율 및 용액의 pH에 따라 조절 가능하였는데 증가된 표면 전하는 입자 간 반발력을 제공하여 균일한 입자 크기와 높은 콜로이드 안정성을 제공한 반면, 표면 전하가 감소된 입자는 응집 현상을 나타내어 크기가 불균일하고 혼탁도가 높은 용액이 형성됨을 확인할 수 있다.
후속연구
- 11이와 같이 형성된 polyplex 입자는 이용되는 고분자 단량체인 GlcN와 acrylate의 구성 비율에 따라 음이온성 입자와 양이온성 입자의 형성이 가능하며, 이 때 입자 표면에 나타나는 표면 전하는 콜로이드 입자 간의 정전기적 반발력을 제공하여 형성된 polyplex 입자의 콜로이드 안정성을 유지할 수 있다. Polyplex 입자 내부에서 형성된 ammonium-acrylate 결합은 차후 carbodiimide로 매개된 결합 반응을 통하여 amide 작용기로 결합함으로써 내부가 가교화된 키토산-PAA polyplex 기반의 하이드로젤 형성 또한 가능할 것으로 기대된다.
- 키토산 GlcN의 ammonium(pKa≈6.5) 작용기와 PAA의 acrylate(pKa≈4.7) 작용기는 pH 4~6 화학적 환경에서 각각 양이온성, 음이온성 고분자 전해질을 주로 형성하므로 이들 단량체 사이의 정전기적 상호작용을 통하여 polyplex가 형성될 것으로 기대된다.
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