[논문]화종에 따른 국내산 벌꿀 에틸 아세테이트 분획물의 산화방지능 및 멜라닌 생성 억제 효과

정하람; 백영수; 김대옥; 이형재

doi:10.9721/kjfst.2018.50.6.660

화종에 따른 국내산 벌꿀 에틸 아세테이트 분획물의 산화방지능 및 멜라닌 생성 억제 효과
Antioxidative and antimelanogenic effects of ethyl acetate fractions of Korean domestic honeys from different floral sources 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.50 no.6, 2018년, pp.660 - 664

정하람 (경희대학교 식품생명공학과) , 백영수 (경희대학교 식품생명공학과) , 김대옥 (경희대학교 식품생명공학과) , 이형재 (단국대학교 식품공학과)

초록
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본 연구에서 이용한 피나무 꿀, 헛개나무 꿀, 밤나무 꿀의 EAF는 마누카 꿀 EAF 보다 높은 산화방지능 및 타이로시네이스 억제능을 보였다. 특히 밤나무 꿀의 EAF는 양성대조군인 고지산에 버금가는 타이로시네이스 억제능을 보였다. 5가지 화종 유래 꿀의 EAF ($100{\mu}g/mL$) 처리시 B16F1 세포에서 멜라닌 생성 억제능은 밤나무 꿀>헛개나무 꿀>마누카 꿀>피나무 꿀>아카시아 꿀의 순서대로 낮아졌다. B16F1 세포 내 타이로시네이스의 효소활성 억제의 경우 5종류 꿀 EAF 중에서 밤나무 꿀 EAF ($100{\mu}g/mL$) 처리시 가장 높았다. 본 연구에서는 다양한 화종의 국내산 꿀에 대한 생리활성소재 탐색을 통하여 산화방지능 및 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였으며, 이를 통해 미백활성 소재로서 기능성 식품 및 화장품 산업으로의 적용 가능성을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Honey is known to have a variety of health-promoting effects. Ethyl acetate fractions (EAFs) of four Korean domestic honeys from basswood, Korean raisin, chestnut, and acacia as well as a New Zealand manuka honey were analyzed comparatively to evaluate their antioxidative and antimelanogenic effects. The EAFs of basswood, Korean raisin, and chestnut honey had higher antioxidant capacities and tyrosinase inhibition activities than those of manuka honey. Pretreatment of B16F1 melanoma cells with EAFs at $100{\mu}g/mL$ resulted in relative retention of melanin contents as follows: acacia honey (141.0%)>basswood honey (134.3%)>manuka honey (131.5%)>Korean raisin honey (107.3%)>chestnut honey (88.0%). Intracellular tyrosinase activities of B16F1 melanoma cells were significantly (p<0.05) lowered by EAFs of Korean raisin and chestnut honey than by EAF of manuka honey. Consequently, these results suggest that Korean domestic honeys from different floral sources serve as good sources of antioxidative and antimelanogenic agents.

주제어

표/그림 (5)

$Fig. 1. Antioxidant capacities of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey using oxygen radical absorbance capacity assay.$ 그림 Fig. 1. Antioxidant capacities of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey using oxygen radical absorbance capacity assay.
$Fig. 2. Tyrosinase inhibition of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey.$ 그림 Fig. 2. Tyrosinase inhibition of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey.
$Fig. 3. Cytotoxic effects of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey on B16F1 melanoma cells.$ 그림 Fig. 3. Cytotoxic effects of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey on B16F1 melanoma cells.
$Fig. 4. Antimelanogenic effects of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey on B16F1 melanoma cells.$ 그림 Fig. 4. Antimelanogenic effects of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey on B16F1 melanoma cells.
$Fig. 5. Effects of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey on intracellular tyrosinase activity in B16F1 melanoma cells.$ 그림 Fig. 5. Effects of the ethyl acetate fractions from five different varieties of honey on intracellular tyrosinase activity in B16F1 melanoma cells.

AI 본문요약
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문제 정의

B16F1 세포 내 타이로시네이스의 효소활성 억제의 경우 5종류 꿀 EAF 중에서 밤나무 꿀 EAF (100 μg/ mL) 처리시 가장 높았다. 본 연구에서는 다양한 화종의 국내산 꿀에 대한 생리활성소재 탐색을 통하여 산화방지능 및 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였으며, 이를 통해 미백활성 소재로서 기능성 식품 및 화장품 산업으로의 적용 가능성을 제시하였다.
본 연구의 목적은 국내에서 생산된 4가지 화종 유래 꿀(피나무 꿀, 헛개나무 꿀, 밤나무 꿀, 아카시아 꿀)과 뉴질랜드에서 생산된 마누카 꿀의 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획물의 산화 방지능, 타이로시네이스 억제능, 마우스 흑색종인 B16F1 세포 내 멜라닌 합성 억제능과 타이로시네이스 억제능을 비교 평가하였다.

제안 방법

5가지 화종별 EAF 모두 100 μg/mL 농도까지 80% 이상의 세포 생존율을 보였으며, 이후 실험은 각 EAF의 최대 무독성 농도인 100 μg/mL를 최대 농도로 하여 진행하였다.
꿀 40 g과 무수 메탄올(absolute methanol) 300 mL을 혼합하여, 2분간 균질기(Polytron RT-2100; Kinematica AG, Littau-Luzern, Switzerland)로 15,000rpm으로 균질화 후 Whatman No. 1 거름종이(Whatman International Limited, Kent, UK)를 이용하여 여과하였다. 여과된 추출물을 진공감압회전농축기(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 통해 항온수조 40 ℃에서 농축하였다.
배양을 마친 후 4℃ DPBS로 2회 세척 후 80℃의 1 N 수산화 소듐을 이용하여 30분 동안 용해시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 405 nm에서 용해된 멜라닌의 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량은 대조군(control) 대비 백분율(%)로 나타내었다.
세포 내 멜라닌 함량 측정은 Chung 등(2009)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. B16F1 세포를 6-well plate에 1×10⁵cells/ well로 분주하고 24시간 배양하였다.
세포 배양을 위하여 DMEM 배지에 10% FBS, 페니실린(100 units/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 첨가하였으며, 37oC, 5% CO2를 유지하는 배양기(CO2, incubator, BB 15; Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Germany)를 이용하여 배양하였다.
타이로시네이스 억제능 평가는 L-DOPA를 기질로 이용하였으며 Masamoto 등(2003)의 방법을 수정하여 실험하였다. 먼저 EAF 40 μL와 증류수에 용해된 8.

대상 데이터

노말-헥세인(n-hexane, 95%), 클로로폼(chloroform, 99.5%), 에틸 아세테이트(ethyl acetate, 99%), 노말-뷰탄올(n-butanol, 99%), 수산화 소듐(sodium hydroxide)은 Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Siheung, Korea)에서 구입하였다.
바이타민 C (vitamin C), 플루오레세인 소듐(fluorescein sodium salt), 2,2'-아조바이스(2-메틸프로피온아마이딘) 다이하이드로클로라이드(2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride, AAPH), 고지산(kojic acid), 레보-도파(L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA), 버섯 타이로시네이스(mushroom tyrosinase), 3-(4,5-다이메틸싸이아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT), 멜라닌세포 자극 호르몬(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH), 트리톤 X-100 (Triton X-100), 페닐메탄설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA) 로부터 구입하였다.
본 연구에 사용한 꿀들은 2011년에 구입하였다. 피나무(basswood) 꿀, 헛개나무(Korean raisin) 꿀, 밤나무(chestnut) 꿀, 아카시아(acacia) 꿀은 강원도 양양에서 생산되었고, 마누카(manuka) 꿀은 뉴질랜드에서 생산되었다.
생쥐의 악성 흑색종 세포주인 B16F1 멜라노마 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포 배양을 위하여 DMEM 배지에 10% FBS, 페니실린(100 units/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 첨가하였으며, 37^oC, 5% CO₂를 유지하는 배양기(CO_2,incubator, BB 15; Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Germany)를 이용하여 배양하였다.
소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 둘베코의 인산완충 식염수(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS), 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin)은 Welgene Inc. (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.
농축된 추출물에 증류수 1L를 가한 후, 1:1 비율로 노말-헥세인, 클로로폼, 에틸 아세테이트, 노말-뷰탄올, 물 순으로 섞어 액체-액체 추출(liquidliquid extraction)법을 이용하여 분획물을 얻었다. 이 분획물 중에 서 에틸 아세테이트 분획물(ethyl acetate fraction, EAF)을 본 실험에 이용하였다.
Louis, MO, USA) 로부터 구입하였다. 인산 수소 다이포타슘(potassium phosphate dibasic), 인산 이수소 포타슘(potassium phosphate monobasic)은 Duksan Pure Chemicals Co., Ltd. (Ansan, Korea)에서 구입하였다. 노말-헥세인(n-hexane, 95%), 클로로폼(chloroform, 99.

데이터처리

본 실험은 모두 3회 반복한 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. SAS 프로그램(version 9.3; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 일원분산분석법(one-way ANOVA)을 통해 통계학적 분석을 실시하였다. 각 평균값의 유의적 차이는 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple range test)을 통해 95%의 신뢰구간에서 사후 검증하였다.
각 평균값의 유의적 차이는 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple range test)을 통해 95%의 신뢰구간에서 사후 검증하였다.
본 실험은 모두 3회 반복한 결과를 평균±표준편차로 나타내었다.

이론/모형

B16F1 세포에 대한 EAF의 최대 무독성 농도를 확인하기 위해 Heo 등(2001)의 방법에 근거하여 MTT법을 실행하였다. B16F1 세포를 96-well plate에 1×10⁴cells/well로 분주하여 24시간 배양하였으며, EAF로 세포를 전처리 후 다시 24시간 동안 배양하였다.
여과된 추출물을 진공감압회전농축기(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 통해 항온수조 40 ℃에서 농축하였다. 농축된 추출물에 증류수 1L를 가한 후, 1:1 비율로 노말-헥세인, 클로로폼, 에틸 아세테이트, 노말-뷰탄올, 물 순으로 섞어 액체-액체 추출(liquidliquid extraction)법을 이용하여 분획물을 얻었다. 이 분획물 중에 서 에틸 아세테이트 분획물(ethyl acetate fraction, EAF)을 본 실험에 이용하였다.
산화방지능은 페록실(peroxyl) 라디칼의 생성과 소멸 과정을 통해 나온 형광의 감소율을 측정하는 산소라디칼 흡수능(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)법을 사용하였다(Huang 등, 2002). ORAC법에 이용된 시약은 인산 수소 다이포타슘과 인산 이수소 포타슘을 혼합하여 만든 75 mM 인산 완충용액(pH 7.

성능/효과

5가지 화종 유래 꿀의 EAF (100 μg/mL) 처리시 B16F1 세포에서 멜라닌 생성 억제 능은 밤나무 꿀>헛개나무 꿀>마누카 꿀>피나무 꿀>아카시아 꿀의 순서대로 낮아졌다.
3%를 보였다. 5가지 화종별 EAF를 처리하였을 때 세포 내 타이로시네이스 활성은 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 5). EAF 100 μg/mL 농도에서 밤나무 꿀(72.
B16F1 세포 내 타이로시네이스의 효소활성 억제의 경우 5종류 꿀 EAF 중에서 밤나무 꿀 EAF (100 μg/ mL) 처리시 가장 높았다.
B16F1 세포를 5종류 꿀의 EAF 100 μg/mL 농도로 전처리 하였을 때, 멜라닌 함량은 아카시아 꿀(141.0%)>피나무 꿀(134.3%)>마누카 꿀 (131.5%)>헛개나무 꿀(107.3%)>밤나무 꿀(88.0%) 순으로 감소하 였다.
EAF 100 μg/mL 농도에서 밤나무 꿀(72.9%)과 헛개나무 꿀(87.0%)이 양성대조군인 동일 농도의 고지산(99.6%)보다 더 높은 세포 내 타이로시네이스 억제능을 보였다.
각 화종별 EAF의 산화방지능은 밤나무 꿀(335.5 mg VCE/g)>헛개나무 꿀(326.2 mg VCE/g)>피나무 꿀(296.8 mg VCE/g)>마누카 꿀(174.6 mg VCE/g)>아카시아 꿀(67.3 mg VCE/g) 순으로 낮아졌다.
2와 같다. 각 화종별 EAF의 타이로 시네이스 억제능은 모두 농도 의존적으로 증가하였다. 양성대조군인 고지산(100 μg/mL)은 73.
밤나무 꿀 EAF 100 μg/mL 농도로 전처리한 B16F1 세포에서 멜라닌 생성 억제는 양성대조군인 고지산 100 μg/mL 전처리의 결과와 유의적 차이를 보이지 않았다(Fig. 4).
Baek 등(2015)은 여러 분획물 중에서 총페놀 함량및 산화방지능은 EAF가 가장 높았으며, 여러 종류의 꿀 중에서 헛개나무 꿀에서 얻어진 EAF가 ABTS법과 DPPH법을 이용하여 측정한 산화방지능은 가장 높게 나왔다고 보고하였다. 본 연구 에서 ORAC법을 이용하여 측정한 산화방지능은 국외산 마누카꿀 및 국내산 아카시아 꿀과 유의적인 차이를 보이며, 밤나무 꿀의 EAF에서 가장 높게 나왔다. 이와같이 각 꿀간의 상이한 산화방지능은 서로 다른 산화방지능 측정법의 차이에 기인한 것으로 생각된다.
본 연구에서 이용한 피나무 꿀, 헛개나무 꿀, 밤나무 꿀의 EAF는 마누카 꿀 EAF 보다 높은 산화방지능 및 타이로시네이스 억제능을 보였다. 특히 밤나무 꿀의 EAF는 양성대조군인 고지산에버금가는 타이로시네이스 억제능을 보였다.
페놀 화합물은 타이로신 및 L-DOPA와 구조가 유사하여 기질 유사체의 역할을 하여 타이로시네이스 활성을 억제하거나, 초기 멜라닌 생합성의 가역적 산화반응에서 페놀 화합물이 산화방지제로 작용하여 멜라닌 생성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Chang, 2009). 본 연구에서의 타이로시네이스 억제능 또한 EAF에 존재하는 생리활성 페놀 화합물에 의해서 가역적 산화반응 산물의 환원 또는 효소활성 억제 등에 의한 것으로 판단된다.
양성대조군인 고지산(100 μg/mL)은 73.3%의 타이로시네이스 억제능을 보였으며, 화종별 꿀 EAF의 100 μg/mL 농도에서 타이로시네이스 억제능은 밤나무 꿀(67.7%)>헛개나무 꿀(64.9%)>피나무 꿀(56.6%) >마누카 꿀(22.2%)>아카시아 꿀(15.4%) 순으로 낮아졌다.
본 연구에서 이용한 피나무 꿀, 헛개나무 꿀, 밤나무 꿀의 EAF는 마누카 꿀 EAF 보다 높은 산화방지능 및 타이로시네이스 억제능을 보였다. 특히 밤나무 꿀의 EAF는 양성대조군인 고지산에버금가는 타이로시네이스 억제능을 보였다. 5가지 화종 유래 꿀의 EAF (100 μg/mL) 처리시 B16F1 세포에서 멜라닌 생성 억제 능은 밤나무 꿀>헛개나무 꿀>마누카 꿀>피나무 꿀>아카시아 꿀의 순서대로 낮아졌다.

후속연구

향후 꿀의 미백활성 효과를 보다 명확하게 밝히기 위해서 꿀에 존재하는 개별 생리활성물질들의 정량적 분석이 요구된다. 또한 세포 내에서 각 생리활성물질들의 미백활성 효과에 대한 분자생물학적 메커니즘 규명 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
향후 꿀의 미백활성 효과를 보다 명확하게 밝히기 위해서 꿀에 존재하는 개별 생리활성물질들의 정량적 분석이 요구된다. 또한 세포 내에서 각 생리활성물질들의 미백활성 효과에 대한 분자생물학적 메커니즘 규명 연구가 더 필요할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	타이로시네이스를 이용한 화장품 연구에는 어떤 것이 있는가?	이런 이유로 타이로시네이스 억제를 위한 연구는 식품, 화장품 등 다양한 분야에서 진행되고 있다. 또한 자외선에 의해 발생되는 활성산소(reactive oxygen species)를 제거하는 산화방지제를 이용한 미백 연구가 이루어지고 있다.
	자외선 노출에 의한 과도한 멜라닌 형성이 주는 부작용은?	멜라닌은 진피의 기저층에 있는 멜라닌세포(melanocyte)에 의해 분비되며, 이는 포유류의 머리카락, 눈, 피부의 색소를 결정하거나 태양 광선으로부터 발생되는 자외선을 차단하여 피부를 보호하는 역할을 한다(Brenner와 Hearing, 2008). 그러나 장기간 자외선 노출에 의한 과도한 멜라닌 형성은 기미, 주근깨, 노인성 흑색점 등 피부의 색소침착을 유발할 뿐만 아니라(Breathnach와 Wyllie, 1964; Rigopoulos 등, 2007; Ünver 등, 2006), DNA 손상에 의한 흑색종(melanoma) 형성 및 비정상적 증식으로 인한 피부암을 유발한다고 알려져 있다(Pfeifer와 Besaratinia, 2012). 타이로시네이스(tyrosinase)는 아미노산인 타이로신(L-tyrosine)을 기질로 사용하여 L-DOPA, 도파퀴논(dopaquinone)을 생성하는 멜라닌 생합성 초기 단계인 가역적 산화반응에 관여한다(Sánchez-Ferrer 등, 1995).
	멜라닌의 역할은?	멜라닌은 진피의 기저층에 있는 멜라닌세포(melanocyte)에 의해 분비되며, 이는 포유류의 머리카락, 눈, 피부의 색소를 결정하거나 태양 광선으로부터 발생되는 자외선을 차단하여 피부를 보호하는 역할을 한다(Brenner와 Hearing, 2008). 그러나 장기간 자외선 노출에 의한 과도한 멜라닌 형성은 기미, 주근깨, 노인성 흑색점 등 피부의 색소침착을 유발할 뿐만 아니라(Breathnach와 Wyllie, 1964; Rigopoulos 등, 2007; Ünver 등, 2006), DNA 손상에 의한 흑색종(melanoma) 형성 및 비정상적 증식으로 인한 피부암을 유발한다고 알려져 있다(Pfeifer와 Besaratinia, 2012).

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Yoshioka S, Terashita T, Yoshizumi H, Shirasaka N. Inhibitory effects of whisky polyphenols on melanogenesis in mouse B16 melanoma cells. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75: 2278-2282 (2011)

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Zumla A, Lulat A. Honey-a remedy rediscovered. J. R. Soc. Med. 82: 384-385 (1989)

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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