[논문]인간 피부각질세포 HaCaT에서 어성초 추출물의 유전체 발현 분석 및 항산화 효과

김정민; 방인석

doi:10.5352/jls.2018.28.12.1406

[국내논문] 인간 피부각질세포 HaCaT에서 어성초 추출물의 유전체 발현 분석 및 항산화 효과
Gene Expression Profiles and Antioxidant Effects of Houttuynia cordata Thunb Extract in Human Keratinocyte HaCaT Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.12 = no.224, 2018년, pp.1406 - 1415

김정민 (제노플랜코리아(주) 유전체분석팀) , 방인석 (호서대학교 생명과학과)

초록
AI-Helper

본 연구는 어성초(Houttuynia cordata Thunb)의 메탄올 추출에 의한 유기 용매별 분획물에서 항산화 효과를 근거로 산화적 스트레스에 의한 HaCaT 세포보호 효과를 확인하였다. 용매별 분획물의 항산화 활성은 시료의 농도가 증가할수록 DPPH에 대한 전자공여능도 증가하였으며, $ED_{50}$은 ethyl acetate (EtOAc) 분획물에서 $175{\mu}g/ml$로 가장 높게 나타났다. $H_2O_2$에 의해 유도된 HaCaT 세포의 세포사멸($IC_{50}$)에 대하여 Hc-EtOAc 분획물은 농도 의존적으로 유의적인 세포 생존율과, $100{\mu}g/ml$ 농도에서 74%의 세포보호 효과를 나타내었다. 한편 $100{\mu}g/ml$의 Hc-EtOAc 분획물을 6 및 24시간 동안 HaCaT 세포에 처리하여 유전자 발현 양상을 분석하였다. 2 배 이상 발현이 증가된 유전자들은 신호전달, 세포분열, 항산화 활성, 상피세포 증식 등에 작용하는 것으로 나타났다. 특히 항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자는 전염증성 사이토카인인 IL1B, TNF, 그리고 IL6 등 이었으며, 이들 유전자의 상위 조절자로써 TLR4가 확인되었다. IL1B, TNF, 그리고 IL6 유전자의 활성을 검증하기 위하여 qRT-PCR을 수행한 결과, $100{\mu}g/ml$ 이상의 Hc-EtOAc 분획물 처리군에서 2 배 이상 발현이 증가한 것으로 나타났다. 상위 조절자 TLR4 단백질의 활성 역시 Hc-EtOAc 분획물에 의해 증가되었다. 이상의 결과, Hc-EtOAc 분획물에 의한 항산화 활성은 TLR4로부터 IL1B, TNF, IL6과 같은 사이토카인을 경유하는 것으로 예측된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Based on the antioxidative effects in organic solvent fractions obtained from the main methanolic extract of Houttuynia cordata Thunb, the cytoprotective effects by oxidative-stress were here analyzed. Regarding the antioxidant activity of organic solvent fractions, the electron-donating ability of DPPH increased in a dose-dependent manner, and $ED_{50}$ exhibited the highest concentration at $175{\mu}g/ml$ in the Hc-EtOAc fraction. The cell viability of Hc-EtOAc fractions on $H_2O_2$-induced HaCaT cell death ($IC_{50}$) increased in a concentration-dependent manner and a visible cell survival rate of 74% was observed at a concentration of $100{\mu}g/ml$. Meanwhile, the gene expression patterns in HaCaT cells treated with $100{\mu}g/ml$ of the Hc-EtOAc fraction for 6 and 24 hr were identified with microarray analysis. The genes involved in signal transduction, cell division, antioxidant activity, and epithelial cell proliferation were found to be 2-fold up-regulated genes in HaCaT cells following the Hc-EtOAc fraction treatment. Especially, proinflammatory cytokines (IL1B, TNF, and IL6) were identified as involved in antioxidant activity based on the expression patterns of the HaCaT cells, and pathway analysis indicated that TLR4 might be considered an upstream regulator of these genes. In order to verify the activity of IL1B, TNF, and IL6, qRT-PCR showed that the expression increased more than 2 times in HaCaT cells treated with at least $100{\mu}g/ml$ of the Hc-EtOAc fraction. The activity of the upstream regulator TLR4 protein was also increased by the Hc-EtOAc fraction. As a result, the antioxidative activity of the Hc-EtOAc fraction is predicted to pass from TLR4 through cytokines such as IL1B, TNF, and IL6.

Keyword

표/그림 (11)

표 Table 1. Primer sequences for qPCR
$Fig. 1. DPPH free radical scavenging activity in various solvents fraction from H. cordata extract.$ 그림 Fig. 1. DPPH free radical scavenging activity in various solvents fraction from H. cordata extract.
$Table 2. Absorbance changes for organic solvent fractions of Hc or BHT showing DPPH free-radical scavenging activity$ 표 Table 2. Absorbance changes for organic solvent fractions of Hc or BHT showing DPPH free-radical scavenging activity
그림 Fig. 2. Effects of H. cordata extract or H₂O₂ on cell viability in HaCaT cells.
$Fig. 3. Cytoprotective effects of Hc-EtOAc fraction against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>-induced oxidative stress in HaCaT cells.$ 그림 Fig. 3. Cytoprotective effects of Hc-EtOAc fraction against H₂O₂-induced oxidative stress in HaCaT cells.
$Fig. 4. Gene expression profiles of Hc-EtOAc fraction by microarray analysis.$ 그림 Fig. 4. Gene expression profiles of Hc-EtOAc fraction by microarray analysis.
$Fig. 5. Effect of Hc-EtOAc fraction by microarray analysis.$ 그림 Fig. 5. Effect of Hc-EtOAc fraction by microarray analysis.
$Fig. 6. Effect of Hc-EtOAc fraction on gene expressions of the proinflammatory cytokines IL1B (A), IL6 (B), and TNF (C) in HaCaT cells.$ 그림 Fig. 6. Effect of Hc-EtOAc fraction on gene expressions of the proinflammatory cytokines IL1B (A), IL6 (B), and TNF (C) in HaCaT cells.
$Table 3. The list of >2-fold changed genes (6 or 24 hr) and involved in antioxidant activity by Hc-EtOAc fraction in HaCaT cells$ 표 Table 3. The list of >2-fold changed genes (6 or 24 hr) and involved in antioxidant activity by Hc-EtOAc fraction in HaCaT cells
$Table 4. The 5 upstream regulators by Hc-EtOAc fraction in HaCaT cells predicted by the upstream regulator analysis in IPA$ 표 Table 4. The 5 upstream regulators by Hc-EtOAc fraction in HaCaT cells predicted by the upstream regulator analysis in IPA
$Fig. 7. Expression of up-regulator TLR4. The expression level of up-regulator TLR4 was increased in Hc-EtOAc fraction-treated HaCaT cells.$ 그림 Fig. 7. Expression of up-regulator TLR4. The expression level of up-regulator TLR4 was increased in Hc-EtOAc fraction-treated HaCaT cells.

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

또한 HaCaT 세포는 염증반응에 관여하는 주요 세포는 아니며, 염증반응을 유도한 상태 역시 아니므로, 향후 염증반응 세포에서 염증을 유도한 상태에서 Hc-EtOAc 분획물에 의한 이들 전염증성 사이토카인의 상호작용을 확인할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 Hc-EtOAc분획물에 의한 항산화 활성에 전염증성 사이토카인이 관여함만을 제시하고자 한다.

제안 방법

또한 HaCaT 세포에 10~100 μM의 H2O2를 4시간 처리하여 MTT assay로 분석하여 H2O2에 의해 50%의 세포사멸을 보이는 산화 스트레스의 조건(IC50)을 설정하였다.
HaCaT 세포를 96 well plate에 well 당 1×104 cells/ml가 되도록 100 μl씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간동안 부착시킨 다음 각 분획의 농도 별 10 μl를 첨가하여 24시간 동안 배양하여 세포의 생존율을 아래의 MTT assay 방법으로 측정하였다.
각 분획물의 EDA (%) 값을 바탕으로 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 양 ED50 (μg/ml)을 구하고, BHT와 비교하여 항산화 활성을 검정하였다.
본 연구는 어성초의 메탄올(methanol, MeOH) 추출에 의한 유기용매별 분획물의 항산화 효과를 근거로 활성산소의 산화적 스트레스에 의한 세포보호 효과를 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포로 확인하였다. 또한 항산화 활성이 높게 나타난 어성초의 ethyl acetate (EtOAc) 분획물(Hc-EtOAc)에 대한HaCaT 세포의 분자생물학적 작용기전을 microarray 분석을 통하여 항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자 및 이들의 상위 조절자(upstream regulator)에 대한 유전자의 발현 변화를 규명하였다.
본 연구는 어성초의 메탄올(methanol, MeOH) 추출에 의한 유기용매별 분획물의 항산화 효과를 근거로 활성산소의 산화적 스트레스에 의한 세포보호 효과를 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포로 확인하였다. 또한 항산화 활성이 높게 나타난 어성초의 ethyl acetate (EtOAc) 분획물(Hc-EtOAc)에 대한HaCaT 세포의 분자생물학적 작용기전을 microarray 분석을 통하여 항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자 및 이들의 상위 조절자(upstream regulator)에 대한 유전자의 발현 변화를 규명하였다.
2 mM DPPH 용액 900 μl에 메탄올에 용해시킨 각 분획의 농도별 시료 100 μl를 혼합하여 실온에서 30분 동안 암실에서 방치 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 BHT를 사용하였고, 시료의 전자공여능(electron donating ability, EDA)은 다음의 식으로 계산하였다.
DPPH 자유라디칼 소거활성이 높게 나타난 Hc-EtOAc 분획물의 H₂O₂에 대한 HaCaT 세포보호 효과를 측정하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 접종한 후, 농도 별 Hc-EtOAc분획물을 처리하고 24시간 후 설정된 IC₅₀ (500 μM) 농도의 H₂O₂를 처리하여 4시간 동안 배양하였다.
HaCaT 세포를 96 well plate에 접종한 후, 농도 별 Hc-EtOAc분획물을 처리하고 24시간 후 설정된 IC₅₀ (500 μM) 농도의 H₂O₂를 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 BHA를 세포에 동일하게 처리하였으며, MTT assay로 세포생존율을 측정하여 세포보호 효과를 확인하였다. 양성 대조군으로 BHT를 세포에 동일하게 처리하였으며 MTT assay로 세포 생존율을 control group에 대한 % 농도로 나타내어 세포보호 효과를 확인하였다.
양성 대조군으로 BHA를 세포에 동일하게 처리하였으며, MTT assay로 세포생존율을 측정하여 세포보호 효과를 확인하였다. 양성 대조군으로 BHT를 세포에 동일하게 처리하였으며 MTT assay로 세포 생존율을 control group에 대한 % 농도로 나타내어 세포보호 효과를 확인하였다.
HaCaT 세포에 대한 어성초 추출 각 분획물 및 H₂O₂의 세포독성, Hc-EtOAc 분획물의 H₂O₂로부터의 세포보호 효과를 MTT assay로 측정하였다. 시료 처리된 세포 각각의 well에 MTT 용액(5 mg/ml)을 10 μl씩 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하여 상등액을 제거하였다.
형성된 MTT formazan 결정체를 dimethyl sulfoxide (DMSO) 100 μl에 4시간 동안 용해시켜 ELISA reader (Molecular devices, USA)로 formazan의 흡광도가 최대가 되는 570 nm의 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
유전자의 발현분석은 AriaMX system (Agillent Technologies)을 이용하여 유전자 특이적인 oligo primer (Table 1) 1 pmole, cDNA5 ng, AccuPower® 2X Greenstar qPCR Master, K-6253(Bioneer) 10 ul, Rnase Free water (Sigma-aldrich) 4 ul로 각well 당 20 ul로 혼합하는 조건으로 qPCR을 수행하였다.
AccuPower® RT PreMix K-2041 (Bioneer, Korea)를 이용하여 Total RNA1 μg을 주형으로 Oligo dT (12-18) (Ordered by Bioneer,Korea) 100 pmole을 primer로 사용하였으며 MyGenie96 Thermal block (Bioneer)를 이용하여 RT-1 (Primer annealing)은 70℃에서 5분 조건으로 RT-2 (cDNA synthesis and RTaseinactivation)는 42℃ 60분 85℃ 5분 조건으로 수행하여 cDNA를 합성하였다.
이후 각 시료의 total RNA로부터 target cRNA의 합성(amplification and labeling) 및 혼성화 반응(nucleic acid hybridization)은 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS (Agilent Technology)를 이용하여 수행하였다.
직경 100 mm의 세포 배양 용기에 1×106 cells/ml의 HaCaT세포를 분주하여 24시간 동안 pre-incubation 시킨 후 100 μg/ml의 Hc-EtOAc 분획물을 처리하여 6시간 및 24시간 동안 배양하였다.
cells/ml의 HaCaT세포를 분주하여 24시간 동안 pre-incubation 시킨 후 100 μg/ml의 Hc-EtOAc 분획물을 처리하여 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. Hc-EtOAc 분획물 및 메탄올(대조군)이 처리된 HaCaT 세포를 회수하고 TRIzol를 이용하여 total RNA를 추출하였고, total RNA 정량 및 정성분석은 RNA nano kit를 사용하였다. 이후 각 시료의 total RNA로부터 target cRNA의 합성(amplification and labeling) 및 혼성화 반응(nucleic acid hybridization)은 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS (Agilent Technology)를 이용하여 수행하였다.
대조군 시료는 cyanine 3, 실험군 시료(Hc-EtOAc 분획물)는 cyanine 5로 각각을 증폭 및 라벨시켰다. 증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 정량하였다. 750 ng cRNA를 이용하여 hybridization buffer를 만들고 Agilent WholeHuman Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다.
증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 정량하였다. 750 ng cRNA를 이용하여 hybridization buffer를 만들고 Agilent WholeHuman Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다. Hybridization image는 Agilent DNA microarray scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 정량은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다.
3 (Agilent Technology)으로 수행하였다. 각 실험군에서 flag-out genes들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값으로 나누어 산출하였다. 유전자 선정(gene selection)을 위한 functional annotation은 Gene Ontology^TMConsortium (http://www.
Microarray 분석에서 선발된 유전자들에 대해 Quantitive polymerase chain reaction (qPCR)을 수행하였다. 농도별 Hc-EtOAc 분획물이 6시간 동안 처리된 HaCaT 세포로부터 TRIzol를 이용하여 제공된 매뉴얼에 따라 Total RNA를 추출하여 Epoch Microplate Spectrophotometer (Biotek, USA)로 흡광도를 측정하여 추출된 Total RNA를 정량하고 순도를 측정하였다.
Microarray 분석에서 선발된 유전자들에 대해 Quantitive polymerase chain reaction (qPCR)을 수행하였다. 농도별 Hc-EtOAc 분획물이 6시간 동안 처리된 HaCaT 세포로부터 TRIzol를 이용하여 제공된 매뉴얼에 따라 Total RNA를 추출하여 Epoch Microplate Spectrophotometer (Biotek, USA)로 흡광도를 측정하여 추출된 Total RNA를 정량하고 순도를 측정하였다. cDNA 합성은 2-step으로 진행하였다.
농도별 Hc-EtOAc 분획물이 6시간 동안 처리된 HaCaT 세포로부터 TRIzol를 이용하여 제공된 매뉴얼에 따라 Total RNA를 추출하여 Epoch Microplate Spectrophotometer (Biotek, USA)로 흡광도를 측정하여 추출된 Total RNA를 정량하고 순도를 측정하였다. cDNA 합성은 2-step으로 진행하였다. AccuPower® RT PreMix K-2041 (Bioneer, Korea)를 이용하여 Total RNA1 μg을 주형으로 Oligo dT (12-18) (Ordered by Bioneer,Korea) 100 pmole을 primer로 사용하였으며 MyGenie96 Thermal block (Bioneer)를 이용하여 RT-1 (Primer annealing)은 70℃에서 5분 조건으로 RT-2 (cDNA synthesis and RTaseinactivation)는 42℃ 60분 85℃ 5분 조건으로 수행하여 cDNA를 합성하였다.
다시 PBST로 5분 동안 3회 세척 후 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 5분 동안 3회 세척 후 Enhanced Chemiluminoescence (ECL) (ATTO, Japan) 용액으로 발광하여 X-ray 필름에 노출시켜 단백질 발현을 분석하였다.
선행실험(Fig. 2B)의 IC50 값인 500 μM의 H2O2로 배양 세포를 처리하기 1시간 전에 농도 별 Hc-EtOAc 분획물이 포함된 배양액에서 처리한 후 세포 생존율을 확인하였다(Fig. 3).
어성초에 MeOH을 가하여 얻은 추출에 이어 용매의 극성에 따른 순차 분획물에 대한 항산화 활성을 측정하였다(Table 2). 어성초의 각 분획물은 농도가 증가할수록 흡광도가 감소하여 DPPH의 자유라디칼 소거활성이 유의성 있게 증가하는 경향을 보이므로 농도 의존적으로 항산화 효과를 나타내었다(p<0.
어성초의 분획물 및 H₂O₂에 대한 HaCaT 세포의 생존율을 측정하였다. 어성초의 순차 분획물의 HaCaT 세포 생존율은 대조군을 100%(±1.
DPPH 자유라디칼 소거활성이 높게 나타난 Hc-EtOAc 분획물의 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에서 HaCaT 세포보호 효과를 측정하였다. 선행실험(Fig.
HaCaT 세포에 Hc-EtOAc 분획물을 6, 24시간 처리하여 분석한 microarray를 hierarchical clustering으로 나타내었다(Fig. 4). 6시간 대에서 변화된 유전자 발현 양상은 24시간 대에서도 유사한 양상을 보였으며, 24시간 처리군은 6시간 처리군보다 2 배 이상 발현이 증감된 유전자 수가 약 2 배 많았다.
6시간 대에서 변화된 유전자 발현 양상은 24시간 대에서도 유사한 양상을 보였으며, 24시간 처리군은 6시간 처리군보다 2 배 이상 발현이 증감된 유전자 수가 약 2 배 많았다. 따라서 이후 유전자 분석은 6 및 24시간 모두에서 2 배 이상 변화된 유전자를 대상으로 분석하였다. HaCaT 세포에서 HcEtOAc의 작용기전을 예측하기 위하여 gene ontology (GO)분석 결과, 2 배 이상 발현이 증가된 유전자들은 신호전달(signal transduction), 세포분열(cell division), 항산화 활성(antioxidant activity), 그리고 상피세포 증식(epithelial cellproliferation) 등에 작용하는 것으로 나타났다(Fig.
5B). 특히 HaCaT 세포에서 Hc-EtOAc 분획물은 DPPH 자유라디칼 소거활성 능력이 우수한 것으로 나타난 바 있으며, 이후 연구에서는 이를 설명할 수 있는 항산화 활성 관련유전자들의 작용에 집중하였다.
Hc-EtOAc 분획물에 의해 2배 이상 발현이 증가된 유전자들 중 항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자(6시간 기준)는 IL6, TNF, FANCD2, HMOX1, CXCL2, IL1B, 그리고ARNTL 등인 것으로 나타났다(Table 3). 이들 항산화 활성에 작용하는 유전자들을 이용하여 유전자 간의 상호작용 및 상위조절자를 확인하기 위하여 IPA 분석을 실시하였다. 항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자는 IL1B, IL6, 그리고TNF와 같은 대표적인 전염증성 사이토카인(proinflammatorycytokines)이었고, 이에 대한 상위 조절자로 TLR4 [31]가 예측되었다(Table 4).
항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자는 IL1B, IL6, 그리고TNF와 같은 대표적인 전염증성 사이토카인(proinflammatorycytokines)이었고, 이에 대한 상위 조절자로 TLR4 [31]가 예측되었다(Table 4). 따라서 IL1B, IL6, 그리고 TNF 유전자들의 활성을 검증하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다(Fig. 6). IL1B는 농도의존적으로 발현이 증가하였으며, 100 μg/ml 이상 처리군에서 2 배 이상 발현이 증가하였다.
HaCaT 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 항생제(penicillin-streptomycin)가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 시 주 2~3회 동일 배지로 갈아준 다음, 배양 6~7일 경과 후 PBS로 세척 및 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리 및 원심분리하여 실험에 사용하였다.

대상 데이터

Dulbecco’smodified Eagle’s medium (DMEM)은 Sigma-Aldrich (USA)에서 Minimum Essential Medium (MEM)과 Dulbecco'sPhosphate-Buffered Salines (DPBS)는 Welgen (Korea)에서 구입하였다.
TRIzol® REAGENT는 Invitrogen (USA)에서 Total RNA 정량 및 정성분석을 위한 RNA nano kit (2100 BioanalyzerSystem)는 Agilent Techologies (USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 어성초의 추출 및 분획물의 유기용매로는MeOH, n-hexane, chloroform (CHCl₃), EtOAc, n-butanol(n-BuOH)을 Duksan Co. (Korea)로부터 구입하여 사용하였다. Fetal Bovine Serum (FBS)은 Wisent (USA)에서 구입하였고, butylated hydroxyl toluene (BHT), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), hydrogen peroxide (H₂O₂) 및 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)assay 시약은 Sigma (USA)에서 구입하였다.
Dulbecco’smodified Eagle’s medium (DMEM)은 Sigma-Aldrich (USA)에서 Minimum Essential Medium (MEM)과 Dulbecco'sPhosphate-Buffered Salines (DPBS)는 Welgen (Korea)에서 구입하였다. Penicillin-streptomycin은 Gibco (USA)에서 항체는Ab frontier (Korea)와 Sigma에서 각각 구입하여 사용하였다.TRIzol® REAGENT는 Invitrogen (USA)에서 Total RNA 정량 및 정성분석을 위한 RNA nano kit (2100 BioanalyzerSystem)는 Agilent Techologies (USA)에서 구입하였다.
어성초를 전북 군산에서 생산되고 한우리 약초사(서울)에서 건조 상태로 포장된 잎과 줄기를 구입하여 실험에 사용하였다. 어성초의 메탄올 추출 이후 용매에 따른 분획물은 n-hexane, CHCl₃, EtOAc, n-BuOH, water 순으로 김 등[21]의 방법에 따라 추출하였다
인체 유래 피부각질세포인 HaCaT 세포주를 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB)으로부터 분양 받아 사용하였다. HaCaT 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 항생제(penicillin-streptomycin)가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.
인체 유래 피부각질세포인 HaCaT 세포주를 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB)으로부터 분양 받아 사용하였다. HaCaT 세포는 10% FBS와 100 units/ml의 항생제(penicillin-streptomycin)가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 시 주 2~3회 동일 배지로 갈아준 다음, 배양 6~7일 경과 후 PBS로 세척 및 0.
이후 각 시료의 total RNA로부터 target cRNA의 합성(amplification and labeling) 및 혼성화 반응(nucleic acid hybridization)은 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS (Agilent Technology)를 이용하여 수행하였다. 대조군 시료는 cyanine 3, 실험군 시료(Hc-EtOAc 분획물)는 cyanine 5로 각각을 증폭 및 라벨시켰다. 증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 정량하였다.
(Korea)로부터 구입하여 사용하였다. Fetal Bovine Serum (FBS)은 Wisent (USA)에서 구입하였고, butylated hydroxyl toluene (BHT), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), hydrogen peroxide (H₂O₂) 및 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)assay 시약은 Sigma (USA)에서 구입하였다. Dulbecco’smodified Eagle’s medium (DMEM)은 Sigma-Aldrich (USA)에서 Minimum Essential Medium (MEM)과 Dulbecco'sPhosphate-Buffered Salines (DPBS)는 Welgen (Korea)에서 구입하였다.

데이터처리

데이터의 통계처리는 SPSSprogram (ver. 12.0.01)을 이용하여 일원배치 분산분석(oneway ANOVA)을 시행하였으며, 신뢰수준 p<0.05에서 평균값들에 대한 유의성을 검증하였다.
aSignificant difference (ap<0.01) shown by One-way ANOVA test.
aSignificant differences (ap<0.01) were studied using ANOVA test.
모든 실험은 최소한 3회 이상 실험을 실시하였으며, 실험군당 평균±표준편차로 표현하였다.

이론/모형

어성초를 전북 군산에서 생산되고 한우리 약초사(서울)에서 건조 상태로 포장된 잎과 줄기를 구입하여 실험에 사용하였다. 어성초의 메탄올 추출 이후 용매에 따른 분획물은 n-hexane, CHCl₃, EtOAc, n-BuOH, water 순으로 김 등[21]의 방법에 따라 추출하였다
어성초의 용매별 분획물의 항산화 활성은 DPPH의 자유라디칼 소거효과(free radical scavenging effect)를 측정하는 방법에 따라 측정하였다[30]. MeOH에 녹인 0.
30μg의 상층액을 8% SDS-PAGE [22]로 분리시킨 후, Towbin등[35]의 방법에 따라 PVDF membrane (Bio-Rad, USA)으로 150 V에서 1시간 동안 전이 시켰다.
750 ng cRNA를 이용하여 hybridization buffer를 만들고 Agilent WholeHuman Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다. Hybridization image는 Agilent DNA microarray scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 정량은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다. 모든 데이터의 normalization (LOWESS)과 fold-changed genes의 선택은 GeneSpring GX 7.
Hybridization image는 Agilent DNA microarray scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 정량은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다. 모든 데이터의 normalization (LOWESS)과 fold-changed genes의 선택은 GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technology)으로 수행하였다. 각 실험군에서 flag-out genes들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값으로 나누어 산출하였다.
각 실험군에서 flag-out genes들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값으로 나누어 산출하였다. 유전자 선정(gene selection)을 위한 functional annotation은 Gene Ontology^TMConsortium (http://www.geneontology.org/index.shtml) DB정보를 따랐으며, IPA (ingenuity pathways analysis, http://www.ingenuity.com)를 이용하여 상위 조절자를 탐색하였다.
Cells were treated with different concentration of each solvent fraction (A) or H₂O₂ (B) as indicated in material and methods. Cell viability was analyzed using the MTT assay. Resultsare presented as mean ± SD for triplicate set of experiments.
No H₂O₂treated cells were used as negative control. Viable cellswere determined using the MTT assay. Data is represented as the mean ± SD obtained from 3 independent experiments conducted in triplicate.
TLRs는 병원균이 숙주의 몸 속에 들어왔을 때, 병원균들이 가지고 있는 독특한 구조를 인식하여 선천성 면역반응과 뒤이어 후천성 면역반응을 유도하는 중요한 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있다[33, 37]. 상기 IPA 분석에서 IL1B, IL6, 그리고 TNF 유전자의 상위 조절자인 TLR4의 활성은 Western blotting으로 검증하였다(Fig. 7). Hc-EtOAc 분획물 50, 100, 그리고 200 μg/ml이 각각 24시간 동안 처리된 HaCaT 세포와 무처리구(control)를 대조군 단백질 β-actin (loading control)의 발현 양으로 보정, 비교 시 TLR4의 단백질량이 역시 증가하는 것으로 나타남을 확인하여 TLR4의 활성을 검증하였다.
유전자 상대정량 분석은 HmGAPDH의 발현량을 기준으로 normalize를 수행하였으며 상대정량은 ΔΔCT Method (A Biosystems-Applied Biosystems, 2004) 방법을 사용하여 Excel(Microsoft, USA)에서 계산하였다.

성능/효과

H2O2 처리군의 세포 생존율은 대조군인 100%(±2.57)에 비하여 45.12%(±3.93)로 나타났다.
한편 활성산소의 세포독성을 조사하기 위하여 산화적 스트레스에 의해 세포 생존율을 감소시키는 것으로 알려져 있는 H2O2를 농도별로 HaCaT 세포에 처리한 결과, 농도 의존적인 세포독성을 나타내었으며(p<0.01) 특히, 50%의 세포사멸을 보이는 산화 스트레스의 조건(IC50) 역시 500 μM에서 나타났다(Fig. 2B).
어성초의 순차 분획물의 HaCaT 세포 생존율은 대조군을 100%(±1.04)로 설정하여 1, 10, 100 μg/ml 농도별로 처리한 결과, 모든 처리군에서 95~104%의 세포 생존율로 시료의 농도에 따른 세포 생존율에는 큰 차이가 없는 것으로 보아독성은 나타나지 않았으며, HaCaT 세포의 생장에도 어떠한 영향을 미치지 않았다(Fig. 2A).
또한 전자공여능(EDA)에 의해 얻은 ED 50은 BHT의 81.87 μg/ml 보다는 낮으나 Hc-EtOAc 분획물에서 175.08 μg/ml로 가장 높은 항산화 활성을 나타내었고, 다음으로 n-BuOH, CHCl3, n-hexane, 그리고 water 분획물 순이었다(Fig. 1).
반면 Hc-EtOAc 분획물 및 동일 농도별 BHT를 각각 HaCaT 세포에 처리하였을 때 세포 생존율은 농도의존적으로 증가한 것으로 나타났으며(p<0.01), 1, 10, 100 μg/ml의 Hc-EtOAc 분획물에서 각각 53(±1.13), 65.32(±0.52), 74.25%(±5.77)의 세포 보호 효과를 나타내었다.
4). 6시간 대에서 변화된 유전자 발현 양상은 24시간 대에서도 유사한 양상을 보였으며, 24시간 처리군은 6시간 처리군보다 2 배 이상 발현이 증감된 유전자 수가 약 2 배 많았다. 따라서 이후 유전자 분석은 6 및 24시간 모두에서 2 배 이상 변화된 유전자를 대상으로 분석하였다.
따라서 이후 유전자 분석은 6 및 24시간 모두에서 2 배 이상 변화된 유전자를 대상으로 분석하였다. HaCaT 세포에서 HcEtOAc의 작용기전을 예측하기 위하여 gene ontology (GO)분석 결과, 2 배 이상 발현이 증가된 유전자들은 신호전달(signal transduction), 세포분열(cell division), 항산화 활성(antioxidant activity), 그리고 상피세포 증식(epithelial cellproliferation) 등에 작용하는 것으로 나타났다(Fig. 5A). 2 배이상 발현이 감소된 유전자들은 분화와 관련된 세포 형태 형성(cell morphogenesis involved in differentiation), 조직 발달(tissue development), 표피 발달(epidermis development) 및 세포 발달(cell development) 등에 작용하는 것으로 나타났다(Fig.
5A). 2 배이상 발현이 감소된 유전자들은 분화와 관련된 세포 형태 형성(cell morphogenesis involved in differentiation), 조직 발달(tissue development), 표피 발달(epidermis development) 및 세포 발달(cell development) 등에 작용하는 것으로 나타났다(Fig. 5B). 특히 HaCaT 세포에서 Hc-EtOAc 분획물은 DPPH 자유라디칼 소거활성 능력이 우수한 것으로 나타난 바 있으며, 이후 연구에서는 이를 설명할 수 있는 항산화 활성 관련유전자들의 작용에 집중하였다.
Hc-EtOAc 분획물에 의해 2배 이상 발현이 증가된 유전자들 중 항산화 활성에 관여할 것으로 추정되는 유전자(6시간 기준)는 IL6, TNF, FANCD2, HMOX1, CXCL2, IL1B, 그리고ARNTL 등인 것으로 나타났다(Table 3). 이들 항산화 활성에 작용하는 유전자들을 이용하여 유전자 간의 상호작용 및 상위조절자를 확인하기 위하여 IPA 분석을 실시하였다.
Hc-EtOAc 분획물 50, 100, 그리고 200 μg/ml이 각각 24시간 동안 처리된 HaCaT 세포와 무처리구(control)를 대조군 단백질 β-actin (loading control)의 발현 양으로 보정, 비교 시 TLR4의 단백질량이 역시 증가하는 것으로 나타남을 확인하여 TLR4의 활성을 검증하였다.
이상의 결과, 어성초의 메탄올 추출에 의한 EtOAc 분획물로부터 항산화 효과와 산화적 스트레스에 의한 HaCaT 세포보호 효과를 확인하였다. 또한 Hc-EtOAc 분획물은 HaCaT 세포에서 신호전달, 세포분열, 항산화 활성, 그리고 상피세포 증식등에 작용하는 유전자들의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다.
이상의 결과, 어성초의 메탄올 추출에 의한 EtOAc 분획물로부터 항산화 효과와 산화적 스트레스에 의한 HaCaT 세포보호 효과를 확인하였다. 또한 Hc-EtOAc 분획물은 HaCaT 세포에서 신호전달, 세포분열, 항산화 활성, 그리고 상피세포 증식등에 작용하는 유전자들의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히 Hc-EtOAc 분획물에 의한 HaCaT 세포의 항산화 활성은 TLR를 경유하여 전염증성 사이토카인인 IL1B, IL6, 그리고TNF의 활성으로부터 조절된다.

후속연구

한편 어떤 메커니즘에 의해 특히 활성산소 혹은 산화적 스트레스가 염증반응의 조절에 영향을 미치는가에 대한 정확한 연구 결과는 많지 않다[11]. 또한 HaCaT 세포는 염증반응에 관여하는 주요 세포는 아니며, 염증반응을 유도한 상태 역시 아니므로, 향후 염증반응 세포에서 염증을 유도한 상태에서 Hc-EtOAc 분획물에 의한 이들 전염증성 사이토카인의 상호작용을 확인할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 Hc-EtOAc분획물에 의한 항산화 활성에 전염증성 사이토카인이 관여함만을 제시하고자 한다.

활용도 분석정보

상세보기

다운로드

내보내기

활용도 Top5 논문

해당 논문의 주제분야에서 활용도가 높은 상위 5개 콘텐츠를 보여줍니다.
더보기 버튼을 클릭하시면 더 많은 관련자료를 살펴볼 수 있습니다.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증