[논문]국내 여윔 넙치에서 검출된 점액포자충 Parvicapsula sp.의 정량적 분석

김승민; 정준범

doi:10.7847/jfp.2018.31.2.101

국내 여윔 넙치에서 검출된 점액포자충 Parvicapsula sp.의 정량적 분석
Quantitative analysis of a myxosporean parasite, Parvicapsula sp. detected from emaciated olive flounder, Paralichthys olivaceus in Korea 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.31 no.2, 2018년, pp.101 - 107

초록
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여윔증상이 나타난 양식장(farm-B 및 farm-C)의 넙치 및 여윔증상이 나타나지 않은 양식장(farm-A) 넙치의 각 내부 장기(신장, 장, 비장, 뇌 및 간)를 대상으로 점액포자충 Parvicapsula sp.의 양적 분석을 real-time PCR 방법을 사용하여 각각 실시하였다. 여윔증상을 보였던 farm-C의 넙치 신장에서 가장 높은 DNA copy number ($1.7{\times}10^7copies/mg$ tissue)를 보였고, farm-B의 넙치에서는 모든 내부 장기에서 낮은 수치가 나타났으며, farm-A의 넙치에서는 모든 내부 장기에서 음성 결과를 나타내었다. 동일한 시료를 사용한 PCR 및 병리조직학적 분석에서도 real-time PCR에서의 결과와 같은 양상을 보였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Quantitative analysis of a myxosporean parasite, Parvicapsula sp. in internal organs (kidney, intestine, spleen, brain and liver) from non-emaciated (farm-A) or emaciated (farm-B and farm-C) olive flounder Paralichthys olivaceus were performed by real-time PCR. The highest DNA copy number ($1.7{\times}10^7copies/mg$ tissue) was detected in kidney of the emaciated olive flounder from farm-C, while the DNA copy number was below detection limit in all the organs of the olive flounder from farm-B. There was not positive result in all of organs from olive flounder in farm-A. PCR and histopathological analysis were also performed using the same specimen and showed same results as those by real-time PCR.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. Primers used in this study
그림 Fig. 1. PCR amplification using the EM-F/EM-R primer set from total nucleic acids of each internal organ from nonemaciated (farm-A) or emaciated (farm-B and farm-C) olive flounder Paralichthys olivaceus. Lanes 1, 6 and 11, kidney; lane 2, 7 and 12, intestine; lanes 3, 8 and 13, spleen; lanes 4, 9 and 14, brain; lanes 5, 10 and 15, liver; N, negative control; M, 1 kb DNA ladder.
표 Table 2. Comparison of the DNA copy numbers of Parvicapsula sp. in each internal organ from non-emaciated (farm-A) or emaciated (farm-B and farm-C) olive flounder Paralichthys olivaceus by real-time PCR
그림 Fig. 2. Histopathological findings in internal organs from non-emaciated or emaciated olive flounder Paralichthys olivaceus. (1), farm-A; (2), farm-B; (3), farm-C; (A), kidney; (B), intestine; (C), spleen; (D), liver. H&E stain, Bar=20 μm.

AI 본문요약
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제안 방법

Column을 새로운 tube로 옮긴 후 AW1 buffer 500 μl와 AW2 buffer 500 μl를 이용하여 세척과 정을 거친 후, AE buffer 30 μl를 첨가하여 최종적으로 DNA를 분리하였다.
Microtube에 SensiMixPlus SYBR (Roche, USA) 10 μl, forward와 reverse primer 각각 1 μM, 주형 DNA로서 plasmid DNA 또는 추출된 핵산을 첨가한 후 증류수로 PCR 혼합물의 최종 량이 20 μl가 되도록 하였다.
PCR 후 증폭된 산물은 1 × TAE buffer를 전기영동을 위한 완충액으로 하여, 0.5 μg/μl EtBr이 첨가된 1% agarose gel 상에서 전기영동한후, UV 검출기를 이용하여 PCR 생성물을 관찰하였다.
동일한 DNA 시료를 사용한 PCR 및 real-time PCR의 결과를 볼 때, 일반적인 PCR 방법에 비하여 real-time PCR 방법의 검출 감도는 상대적으로 매우 높은 것으로 나타났다(Table 2). 동일한 조직 장기들을 대상으로 병리조직학적 분석도 동시에 수행하였 으며, 뇌 조직은 분자생물학적 분석을 위하여 모두 사용되어 이를 제외한 신장, 장, 비장 및 간 조직을 대상으로 분석이 이루어졌다. 그 결과, 여윔증상을 보이는 넙치의 모든 조사 대상 장기에서 다수의 포자가 관찰되었다(Fig.
실험실로 이송한 모든 개체의 Parvicapsula sp. 및 E. leei에 의한 감염유무를 PCR 방법으로 확인하였다. EM-F/EM-R primer set (Kim et al.
분리된 plasmid DNA 는 절대표준농도(absolute standard concentration)를계산하여, 유전자의 클론으로부터 1.6 × 10 11 copies/g 농도의 plasmid DNA를 확보하였고, 확보된 plasmid를 10배씩 단계 희석하여 real-time PCR 분석을 위한 표준검량곡선을 구하는데 사용하였다.
본 연구에서는 여윔증상을 보이는 넙치를 대상으로 각 장기 별 Parvicapsula sp.에 의한 감염정도를 real-time PCR 방법을 통하여 분석하고 주요 감염 표적장기를 밝히고자 하였으며, 일반적인 PCR 법 및 병리조직학적인 분석법을 동일한 장기 조직을 대상으로 동시에 실시하여 3가지 진단법에서 동일한 결과가 나타나는지를 확인하고, 여윔증 진단을 위하여 가장 효율적인 방법을 제시하고자 하였다.
본 연구에서는 여윔증상을 보이는 넙치로부터 주요감염 표적장기를 포함하여 Parvicapsula sp.에의한 각 장기 별 감염 정도를 분석하고자 하였고, 이를 위하여, 동일한 감염 조직을 대상으로 real-time PCR법, PCR법 및 병리조직학적 분석 방법을 적용하여, 각각의 진단 방법에 의한 결과들을 비교 분석하였다.
병원체에 의한 각 장기 별 감염 정도를 분석하기 위하여 real-time PCR 방법을 실시하였다. 여윔증상을 보이는 넙치로부터 검출된 812 bp의 PCR 생성물을 클로닝시킨 후, plasmid DNA를 분리하여 real-time PCR 실험에서의 standard curve 제작을 위한 표준시료로 사용하였다. 각 장기 별 감염 정도를 real-time PCR법으로 확인한 결과, PCR 법에 의한 결과와 마찬가지로 Parvicapsula sp.
여윔증상을 보이지 않는 양식장(farm-A), 그리고 여윔증상을 보이는 양식장(farm-B 및 farm-C)의 넙치로부터 적출된 신장, 장, 비장 및 간 조직을 고정하였고, H&E 염색을 통한 병리조직학적 분석 P, positive; N, negative; NT, not tested을 실시하였다.
의 Genomic DNA 를 주형으로 하여 EM-F/EM-R primer set를 사용해 PCR을 실시하였고, 생성된 PCR 결과물을 pGEMT Easy vector (promega, USA)에 cloning하여, competent cell DH5α 균주에 transformation시킨 후, plasmid DNA를 분리하였다.
의 28S rDNA부위로부터 RTEM-F (5‘-GGATACATGT TGGTCGAC-3’) / RTEM-R (5‘-CGAATCGCATTA ATTATC-3’) primer set를 제작하였고(Table 1), DNA 의 정량을 위해 LightCycler ® Nano SW1.0 (Roche, USA)을 사용하였다.
적출한 신장, 장, 비장, 뇌 및 간 조직으로부터 각각의 DNA를 분리하기 위하여, DNeasyⓇ Blood & Tissue Kit (Qiagen Hilden, Germany)를 사용하였다.
제작된 조직표본은 hae-matoxylin과 eosin (H&E)으로 염색시킨 후, 광학현미경(Zeiss LT60, Germany)으로 검경하였다.

대상 데이터

(2015a)이 Parvicapsula sp. 검출을 위하여 제시한 primer set (Table 1), 그리고 E. leei 검출을 위한 primer set (Yasuda et al., 2005)를 각각 사용하였다. Microtube에 1μM 의 각 primer, 2.
, 2015a). 국내의 넙치양식장을 대상으로 2010년부터 2013 년까지 여윔증 모니터링을 실시하였고, 여윔증상 넙치와 점액포자충의 검출률 사이의 상관관계를 분석하였다(Kim et al., 2015b). 여윔증상을 보이는 넙치를 대상으로 혈액학적인 감염 특성이 분석되었고(Kim et al.
적출한 신장, 장, 비장 및 간 조직을 Bouin’s solution에 24시간 동안 고정한 후 70% EtOH를 사용하여 탈수하였다. 이후 파라핀 침투를 시키고(Leica EG 1150HC, Germany), 포매기(Leica Jung 820, Germany)를 사용하여 포매시켰다. 그 후, 마이크로 톰으로 4-5 μm 두께의 절편을 잘라 유리슬라이드에 부착시켜 건조시켰다.

이론/모형

, 2015a). 병원체에 의한 각 장기 별 감염 정도를 분석하기 위하여 real-time PCR 방법을 실시하였다. 여윔증상을 보이는 넙치로부터 검출된 812 bp의 PCR 생성물을 클로닝시킨 후, plasmid DNA를 분리하여 real-time PCR 실험에서의 standard curve 제작을 위한 표준시료로 사용하였다.
leei에 의한 감염유무를 PCR 방법으로 확인하였으며, 그 중 각 양식장 별로 한 마리씩의 넙치를 대상으로 신장, 장, 비장, 뇌 및 간 조직을 적출하여 각 장기 별 Parvicapsula sp.의 감염정도 분석을 위한 실험(PCR, Real-time PCR 및 병리조직학적 검사)에 사용하였다.
여윔증상이 나타난 양식장(farm-B 및 farm-C)의 넙치 및 여윔증상이 나타나지 않은 양식장(farmA) 넙치의 각 내부 장기(신장, 장, 비장, 뇌 및 간)를 대상으로 점액포자충 Parvicapsula sp.의 양적 분석 을 real-time PCR 방법을 사용하여 각각 실시하였 다. 여윔증상을 보였던 farm-C의 넙치 신장에서 가장 높은 DNA copy number (1.

성능/효과

먼저 넙치의 여윔증 진단을 위하여, Kim et al.(2015a)이 보고한 EM-F/EM-R primer set를 사용한 PCR 방법을 통하여(Table 1), 각 양식장들의 넙치를 대상으로 여윔증 진단을 실시하였고, PCR 양성 반응을 보인 넙치 양식장들에서는 전형적인 여윔 증상이 나타났으며, PCR 음성 반응을 보인 넙치 양식장에서는 여윔증상이 없는 것을 확인하였다. 여윔증상을 보이는 넙치의 신장에서 다른 장기들에 비하여 PCR band가 상대적으로 가장 진하게 나타났으며, 감염 정도에 따라 차이는 있지만, 장, 비장, 뇌 및 간에서도 Parvicapsula sp.
2, (1)), 여윔증상을 보였던 양식장의 넙치에서는 모든 조사대상 장기에서 4∼9 μm 크기의 원형 또는 난원형의 포자가 관찰되었다(Fig.
여윔증상을 보이지 않는 양식장(farm-A), 그리고 여윔증상을 보이는 양식장(farm-B 및 farm-C)의 넙치로부터 적출된 신장, 장, 비장, 뇌 및 간 조직을 사용하여, 각 장기 별 Parvicapsula sp. DNA의 양적 분석을 real-time PCR 방법으로 실시한 결과, 가장 많은 병원체의 DNA가 검출된 장기는 신장이었으며, 그 다음 장, 비장, 뇌 및 간 등의 순서로 나타났다(Table 2). 여윔증상을 보이지 않았던 farm-A의 넙치에서는 모든 장기에서 음성 결과를 보였고, 여윔증상을 보였던 farm-B의 넙치에서는 8.
leei에 의한 감염유무를 PCR 방법으로 확인하였다. EM-F/EM-R primer set (Kim et al., 2015a)를 사용한 PCR 결과, farm-B 및 farm-C의 넙치 모두에서 양성반응을 보였고, farm-A의 넙치에서는 모두 음성반응이 나타났으며, E. leei 검출을 위하여 보고된 primer set (Yasuda et al., 2005)를 사용한 PCR 에서는 모든 양식장의 넙치에서 음성반응을 보였다(data not shown). 여윔증상을 보이지 않는 양식장(farm-A), 그리고 여윔증상을 보이는 양식장 (farm-B 및 farm-C)의 넙치 한 마리씩을 대상으로 신장, 장, 비장, 뇌 및 간 조직을 각각 적출하여 EM-F/EM-R primer set를 이용하여 PCR을 실시한 결과, farm-A의 넙치에서는 검사한 모든 장기에서 음성 결과를 보였고, farm-B의 넙치에서는 간을 제외한 모든 장기에서 양성 결과를 보였으며, 가장 심각한 여윔증상을 보였던 farm-C의 넙치에서는 모든 장기에서 양성 결과를 나타내었다(Table 1 & Fig.
여윔증상을 보이지 않는 양식장(farm-A), 그리고 여윔증상을 보이는 양식장(farm-B 및 farm-C)의 넙치로부터 적출된 신장, 장, 비장 및 간 조직을 고정하였고, H&E 염색을 통한 병리조직학적 분석 P, positive; N, negative; NT, not tested을 실시하였다. 그 결과, farm-A의 넙치에서는 모든 장기에서 정상적인 형태가 확인되었고(Fig. 2, (1)), 여윔증상을 보였던 양식장의 넙치에서는 모든 조사대상 장기에서 4∼9 μm 크기의 원형 또는 난원형의 포자가 관찰되었다(Fig.
의 감염을 확인하기 위해서는 일정량 이상의 병원체 DNA가 존재해야 되는 것으로 판단된다. 동일한 DNA 시료를 사용한 PCR 및 real-time PCR의 결과를 볼 때, 일반적인 PCR 방법에 비하여 real-time PCR 방법의 검출 감도는 상대적으로 매우 높은 것으로 나타났다(Table 2). 동일한 조직 장기들을 대상으로 병리조직학적 분석도 동시에 수행하였 으며, 뇌 조직은 분자생물학적 분석을 위하여 모두 사용되어 이를 제외한 신장, 장, 비장 및 간 조직을 대상으로 분석이 이루어졌다.
2, (2)&(3)). 또한, 신장 부위에서는 기부골절, 사구체, 핵의 파괴와 일부 변형체(plasmodia)가 관찰되었으며, 장에서는 장 상피세포와 상피세포를 지지하는 결합조직, 비장에서는 동맥이 분지된 모세혈관과 혈구세포들의 변형체, 간 부위에서는 담관공 및 세동맥에서 포자가 형성되어 있는 것을 관찰하였고, 심한 경우 조직의 탈락 및 파괴가 관찰되었다(Fig. 2, (2)&(3)).
본 연구를 통하여 분석대상 부위 중 넙치의 신장이 Parvicapsula sp.에 의하여 감염되는 가장 주요한 부위라는 것이 밝혀졌고, 그 외 장, 비장, 뇌 및간에서도 감염이 이루어진다는 것이 확인되었으며, 이것은 PCR, real-time PCR 및 병리조직학적 분석에서 모두 동일한 결과로 나타났다. 특히, 진단에 있어서 가장 민감성이 높게 나타난 real-time PCR 방법은 향후 넙치에서의 여윔증 조기진단 및여윔증 관련 연구에 있어서 유용하게 사용될 수있을 것으로 사료된다.
여윔증상을 보였던 farm-C의 넙치 신장에서 가장 높은 DNA copy number (1.7×107 copies/mg tis- sue)를 보였고, farm-B의 넙치에서는 모든 내부 장기에서 낮은 수치가 나타났으며, farm-A의 넙치에 서는 모든 내부 장기에서 음성 결과를 나타내었다.
여윔증상을 보이지 않는 양식장(farm-A), 그리고 여윔증상을 보이는 양식장 (farm-B 및 farm-C)의 넙치 한 마리씩을 대상으로 신장, 장, 비장, 뇌 및 간 조직을 각각 적출하여 EM-F/EM-R primer set를 이용하여 PCR을 실시한 결과, farm-A의 넙치에서는 검사한 모든 장기에서 음성 결과를 보였고, farm-B의 넙치에서는 간을 제외한 모든 장기에서 양성 결과를 보였으며, 가장 심각한 여윔증상을 보였던 farm-C의 넙치에서는 모든 장기에서 양성 결과를 나타내었다(Table 1 & Fig. 1).

후속연구

에 의하여 감염되는 가장 주요한 부위라는 것이 밝혀졌고, 그 외 장, 비장, 뇌 및간에서도 감염이 이루어진다는 것이 확인되었으며, 이것은 PCR, real-time PCR 및 병리조직학적 분석에서 모두 동일한 결과로 나타났다. 특히, 진단에 있어서 가장 민감성이 높게 나타난 real-time PCR 방법은 향후 넙치에서의 여윔증 조기진단 및여윔증 관련 연구에 있어서 유용하게 사용될 수있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	양식 해산어의 여윔증 발생은?	양식 해산어에서의 여윔증 발생은 일본의 자주복(Takifugu rubripes)에서 처음 보고되었으며(Tun et al., 2000, 2002), 이후 넙치(Paralichthys olivaceus), 참돔(Pagrus major), 강담돔(Oplegnathus punctatus) 등을 포함한 다양한 어종에서 여윔증 발생이 보고되어 왔다(Yasuda et al., 2005; Yanagida et al.
	기생충 검출 방법인 microscopy, immunoassay 및 western blotting 시험법의 단점을 보안한 PCR법이란?	, 2005). 일반적인 PCR법은 주로 PCR 반응 후 agarose gel 상에서 전기영동을 통한 확인 과정이 필요하고, 감염 정도를 조사할 수 있는 양적 분석이 어렵기 때문에, 신속하면서 병원체의 정량적인 검출이 가능한 real-time PCR 방법이 어류 질병 진단을 위하여 종종 사용되고 있다(OIE, 2018).
	여윔증에 걸린 병어는 어떤증상을 보였는가?	, 2008). 병어는 안구함몰, 두부돌출 및 체중 감소 등의 증상을 나타내다가 폐사하는 것으로 보고되었으며, 일본에서는 여윔증의 원인체로서 점액포 자충류에 속하는 Enteromyxum leei가 제시되고 있다(Yasuda et al., 2005; Ishimatsu et al.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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