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문제 정의
- 그리하여 액상 형태로 되어있어 체내 흡수가 용이한 전통적인 한약탕제가 가지는 장점에도 불구하고, 함량의 표준화가 어렵고, 오래 보관할 수 없으며, 맛과 향이 강하여 다양한 계층에 대한 복약순응도가 낮은 단점을 해결하고자 과립제, 정제 그리고 캡슐제 등의 여러 형태의 현대적인 제형으로 제형개발연구를 하고자 한다.
- 더욱이 전탕액을 제형화한 산제 또는 과립제에 함유된 부형제 양이 전체 중량의 40 ~ 60%를 차지하고 있어 불필요한 1회 복용량을 높이고 있고, 가루형태의 제제특성 때문에 복용 편리성이 떨어져 소비자들에게 기피되어 지고 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 부형제 함량을 줄여 1회 복용량을 낮추고, 소비자들이 선호하는 현대적인 제형인 정제로의 제형화 연구를 수행하여, 전탕액과의 동등성 확보를 위한 성분분석과 시판되고 있는 2종의 일본제품과의 약효 동등성을 확인하기 위한 항산화, 항염증 실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 황련해독탕(HRHDT)을 현대적 제형인 정제로 제형 개발하였고, 전탕액과 정제간의 성분분석을 통하여 화학적 동등성과 시판제제 2종(HJP1 및 HJP-2)과의 항산화 및 항염증 효능 비교실험을 통한 약리활성에 대하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 또는 약리 연구가 보고된 바 있으나, 현대적인 제형으로의 제형개선 연구는 전무한 실정이다. 이에 본 연구는 황련해독탕 전탕액을 이용하여 보관이 용이하고, 복약순응도가 높은 현대적인 제형인 정제로의 제형개발를 실시하였고, 전탕액과 개발된 황련해독탕 정제의 성분프로파일 분석을 통하여 동등성을 평가하였으며, 항산화, 항염증 활성평가를 통하여 개발된 황련해독탕 정제와 2종의 일본 시판제품간(HJP-1, HJP-2)의 약효 동등성을 보았다.
제안 방법
- 7개의 주요 peak는 치자의 geniposide, 황련 유래의 Peak A, 황련·황백의 palmatine, berverine 및 황금의 baicalin, baicalein 그리고 황금 유래의 Peak B이며, 이들의 동시분석을 위해 이동상은 water와 acetonitrile을 시간대별로 구성 비율을 달리하였다.
- DPPH radical 소거활성은 Shahidi DPPH 방법26)을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 100, 500 및 1000 ㎍/㎖에 0.
- 01 mM의 DPPH 용액을 가하여 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 516 ㎚에서 흡광도를 측정하여 다음의 계산식으로 산출하였다. DPPH radical 소거활성은 시료용액의 무첨가군에 대한 시료첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 대조군으로는 Butylated hydroxyanisole (BHA) 0.1 ㎎/㎖ 를 사용하여 비교하였다.
- 0 ㎎/㎖의 농도로 조제한 후 4℃에 보관하였다. HPLC 분석을 위하여 HRHDT 전탕액 시료 및 HRHDT 정제를 5.28 ㎎/㎖로 정확히 조제한 후 0.2 ㎛ membrane filter 여과 후 검액으로 사용하였다.
- HRHDT F3과 2종의 일본 시판제품 HJP-1, HJP-2의 대식세포 (Raw 264.7) cell line에 대한 세포독성을 알아보기 위해 MTS assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. HRHDT F3, HJP-1 및 HJP-2을 200 및 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포의 생존율을 측정한 결과, 세 그룹 모두 200 및 500 ㎍/㎖ 의 농도에서 모두 95% 이상의 생존율을 보여주었다 (Fig.
- HRHDT F3와 2종의 일본 시판제품 HJP-1과 HJP-2의 항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH radical 소거활성을 확인하였다 (Fig. 6). HRHDT F3은 100, 500 및 1000 ㎍/㎖농도에서 각각 18, 30 및 47%로 농도 의존적인 항산화 효능을 확인하였다.
- 6). HRHDT F3은 100, 500 및 1000 ㎍/㎖농도에서 각각 18, 30 및 47%로 농도 의존적인 항산화 효능을 확인하였다. 또한 HJP-1, HJP-2 역시 100, 500 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 HJP-1은 18, 31 및 41%, HJP-2는 16, 36 및 51%로 농도 의존적으로 효과를 보였다.
- HRHDT 단미엑스산은 구성약재인 치자, 황금, 황련 및 황백을 각각 칭량한 후, 약재별 중량의 10배에 해당하는 정제수를 넣고, 100℃에서 3시간 동안 개별 추출하였다(Hanmoru, Korea). 추출액은 filter paper (Advantec No.
- HRHDT 전탕액 및 정제의 성분분석을 위해 HRHDT 구성약재의 주요성분으로 7개의 성분을 분리하여 선정하였다. 7개의 주요 peak는 치자의 geniposide, 황련 유래의 Peak A, 황련·황백의 palmatine, berverine 및 황금의 baicalin, baicalein 그리고 황금 유래의 Peak B이며, 이들의 동시분석을 위해 이동상은 water와 acetonitrile을 시간대별로 구성 비율을 달리하였다.
- 혼합물은 단발타정기 (TRB 16, Erweka, Heusenstamm, Germany)를 사용하여 추가적인 다른 과정 없이 바로 타정하였고, 데시케이터에 보관 후 본 실험에 사용하였다. HRHDT 정제의 무게, 지름, 두께 및 경도는 hardness tester (TBH 325, Ereweka, Heusenstamm, Germany)로 측정되었으며, 이때 모든 물성평가는 3회 측정값의 평균으로 계산되었다. 붕해도 시험은 disintegration tester (Disintegration 3100, DISTEK, NJ, USA)를 사용하여 37± 0.
- HRHDT 제제들의 염증억제효과를 확인하기 위해 세포배양액 내 Nitric oxide (NO)의 양을 측정하였다. RAW264.
- HRHDT 주요성분인 geniposide, baicalin, baicalein, palmatine 및 berberine의 분리를 위하여 YMC C18 (5㎛, 4.6×250 ㎜, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼 온도는 35℃로 유지하였다.
- HRHDT의 단미엑스는 40 mesh sieve로 체과하여 입도를 균일화 시켰으며, 여기에 부형제로서 미결정셀루로오스와 이산화규소가 혼합된 Prosolve, 미결정셀루로오스인 Avicel101 및 Ludipress를, 붕해제로서 Croscamellose sodium을, 유동성 개선 부형제로 Aerosil® 200를 각각 칭량한 후 플라스틱 백에서 10분간 균일하게 혼합하였다.
- Hausner ratio는 Excellent(1.00~1.11), Good (1.12~1.18), Fair (1.19~1.25), Passable(1.26~1.34), poor (1.35~1.45), very poor (1.46~1.59) 및 very very poor ( >1.60)의 총 7개의 등급으로 나누어 흐름성을 평가하였다.
- RAW264.7 세포 (5×104 cell/12well)에 각각의 HRHDT 제제를 200, 500 ㎍/㎖로 2시간 동안 전처리 하였다.
- 각 사이토카인의 농도는 TNF-α와 IL-6의 standard curve와 비교하여 계산하였다.
- 을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 100, 500 및 1000 ㎍/㎖에 0.01 mM의 DPPH 용액을 가하여 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 516 ㎚에서 흡광도를 측정하여 다음의 계산식으로 산출하였다. DPPH radical 소거활성은 시료용액의 무첨가군에 대한 시료첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었으며, 대조군으로는 Butylated hydroxyanisole (BHA) 0.
- PDA 검출기 파장 254 nm에서 geniposide, Peak A, baicalin, palmatine, berverine, Peak B 및 baicalein 순으로 각각 검출되었으며, 다른 성분들의 피크에 간섭 없이 분리됨을 확인하였다. 검액은 설정된 동시분석 조건에서 분석을 실시하였으며, 검액에서의 피크는 주요성분 피크의 retention time과 UV 스펙트럼이 일치함을 확인한 후 각 성분에 대한 peak area을 분석하였다 (Fig. 1).
- 혼합물의 물성평가를 위해 겉보기 밀도 (Bulk density)와 탭 밀도 (Tap density)를 측정하였다. 겉보기 밀도는 혼합물을 메스실런더에 넣어 부피를 측정하였고, 탭 밀도는 혼합물이 들어있는 메스실런더를 200회 tapping 한 후 측정하여 아래의 수식에 의해 값을 구하였다.
- 겉보기밀도와 탭밀도의 측정값은 다음의 수식을 사용하여 Hausner ration 값을 구하여 흐름성을 평가하였다27).
- 이상의 결과로부터 황련해독탕(HRHDT)을 기존 시판제제들보다 부형제의 함유량을 감소시켜 1회 복용량을 줄이고, 복용 편의성이 높은 현대적인 제형인 정제로 제형을 개발 하였다. 더욱이 황련해독탕(HRHDT) 정제와 전탕액간의 성분분석과 2종의 일본 시판제제인 HJP-1와 HJP-2와의 항산화, 항염증 실험을 통하여 구성약재의 동등성과 약효에 대한 동등성을 확보하였다. 이는 황련해독탕 정제가 전탕액과 동일한 성분임을 나타내며, 2종의 일본 시판제제와의 약효 비교에 있어 차이가 없음을 말한다.
- 7 cell과 같은 대식세포에 작용하여 여러 종류의 염증 cytokine의 유발과 함께 NO의 생성을 촉진시킨다30). 따라서 HRHDT 제품들의 NO 생성 저해 실험은 LAW 264.7 cell에 LPS를 처리하여 실험하였다. HRHDT F3과 2종의 일본 시판제품 HJP-1, HJP-2의 항염증 효과를 확인하기 위해 LAW 264.
- 2). 따라서 이후 실험에서는 이 결과를 바탕으로 세포생존에 영향을 주지 않는 범위 내에서 모든 실험을 수행하였다.
- 먼저 RAW 264.7 세포 (5×104 cell/12well)에 각각의 HRHDT 제제를 200 및 500 ㎍/㎖로 2시간 동안 전처리를 하였다.
- 먼저, RAW 264.7 세포(5×103 cell/96well)에 각각의 HRHDT 제제를 200 및 500 ㎍/㎖ 농도별로 처리하여 24시간 배양 후, 20 ㎕의 MTS 시약을 첨가한 다음 1시간 동안 반응하고, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 앞의 성분분석과 더불어 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 2종의 일본 시판제품인 HJP-1과 HJP-2의 항산화 및 항염증 효능실험을 통해 약효동등성을 확인하였다. 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 HJP-1 및 HJP-2의 항산화 활성을 비교하기 위하여 DPPH radical 소거활성과 항산화 물질인 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다.
- 붕해도 시험은 disintegration tester (Disintegration 3100, DISTEK, NJ, USA)를 사용하여 37± 0.5 ℃의 정제수에서 시험하였다.
- 즉, 세포배양액 100 ㎕에 동량의 Griess reagent (Sigma, USA)를 넣고 교반기에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader (Tecan Infinite M200, Untersbergstrasse, Austria)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite의 standard curve와 비교하여 계산하였다.
- 7 세포(5×103 cell/96well)에 각각의 HRHDT 제제를 200 및 500 ㎍/㎖ 농도별로 처리하여 24시간 배양 후, 20 ㎕의 MTS 시약을 첨가한 다음 1시간 동안 반응하고, 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 정도는 시료를 처리하지 않은 대조군과 약물 처리군의 비율로 계산하였다.
- 이 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양한 후 세포배양액으로부터 TNF-α와 IL-6의 농도를 ELISA kit(R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 일반적으로 시중 판매되고 있는 한약제제의 부형제로 유당과 전분이 많이 사용되어 왔으며, 40 ~ 60%로 높은 함유량을 보이고 있다. 이에 부형제의 함유량을 20% 이하로 낮추고, 쉽게 습윤되는 한약재 건조엑스의 특성을 고려하여, 부형제로 미결정셀룰로오스 계열과 유당이 함유된 Ludipress 그리고 결합제로 PVP-K30 등을 이용하여 황련해독탕 정제를 제조하였다. 타정에 앞서 배합된 황련해독탕 F1, F2 및 F3 혼합물의 겉보기 밀도 및 탭 밀도를 바탕으로 한 Hausner ratio에 의해 흐름성을 판정하고, 단발 타정기로 타정한 뒤, 경도, 마손도 및 붕해도 등을 실험하여 황련해독탕 정제의 물성을 평가하였다.
- 붕해시간은 검체의 잔여물이 유리관 안에 존재하지 않거나 남아있더라도 원형을 나타내지 않는 연질의 물질이 존재할 때까지의 시간으로 하였다. 정제의 마손도는 10개의 정제를 friability tester(TAR 120, Ereweka, Heusenstamm, Germany)에서 25 rpm으로 4분 동안 회전시킨 후, 손실된 무게를 측정하여 다음의 수식으로 계산하였다.
- 08(Excellent)로 가장 좋았다. 정제의 물성평가에 있어서 F1은 결합력이 떨어져 경도를 측정할 수 없었고, F2 및 F3은 경우 각각 4와 7 KP의 경도를 나타내어 두 정제에 대한 붕해도를 측정하였다. 그 결과 F2은 39분, F3은 29분으로 대한민국약전내 붕해도 시험 중 나정의 붕해기준에 적합한 F3를 최종 배합비율로 선택하여 시제품을 제조하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 표준물질로 gallic acid (Sigma, USA)를 이용하여 검량선을 작성하여 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등29)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma, USA)를 이용하여 총 플라보노이드 함량 검량선을 작성하였다.
- 이에 부형제의 함유량을 20% 이하로 낮추고, 쉽게 습윤되는 한약재 건조엑스의 특성을 고려하여, 부형제로 미결정셀룰로오스 계열과 유당이 함유된 Ludipress 그리고 결합제로 PVP-K30 등을 이용하여 황련해독탕 정제를 제조하였다. 타정에 앞서 배합된 황련해독탕 F1, F2 및 F3 혼합물의 겉보기 밀도 및 탭 밀도를 바탕으로 한 Hausner ratio에 의해 흐름성을 판정하고, 단발 타정기로 타정한 뒤, 경도, 마손도 및 붕해도 등을 실험하여 황련해독탕 정제의 물성을 평가하였다. 황련해독탕 F1, F2 그리고 F3 혼합물의 흐름성은 타정하기 적합하였으며, 특히 F3의 흐름성이 1.
- 총 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등29)의 방법을 일부 변경하여 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma, USA)를 이용하여 총 플라보노이드 함량 검량선을 작성하였다.
- 항염증 효능실험은 대표적인 면역세포인 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증매개물질인 Nitric oxide (NO)의 생성과 염증관련 cytokine인 TNF-α와 IL-6의 발현정도를 측정하여 평가하였다.
- 이후에 활택제로서 Magnesium Stearate를 추가하여 5분간 균일하게 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 혼합물의 물성평가를 위해 겉보기 밀도 (Bulk density)와 탭 밀도 (Tap density)를 측정하였다. 겉보기 밀도는 혼합물을 메스실런더에 넣어 부피를 측정하였고, 탭 밀도는 혼합물이 들어있는 메스실런더를 200회 tapping 한 후 측정하여 아래의 수식에 의해 값을 구하였다.
- 본 연구에서는 앞의 성분분석과 더불어 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 2종의 일본 시판제품인 HJP-1과 HJP-2의 항산화 및 항염증 효능실험을 통해 약효동등성을 확인하였다. 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 HJP-1 및 HJP-2의 항산화 활성을 비교하기 위하여 DPPH radical 소거활성과 항산화 물질인 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다. 그 결과DPPH radical 소거활성은 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와HJP-1 및 HJP-2 모두 농도 의존적으로 항산화 효과가 높아짐을 확인하였고, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에 있어 HJP-1 > HRHDT F3 > HJP-2 순으로 높게 측정되었다.
- 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 전탕액간의 동등성 확보를 위해 구성약재의 주요성분인 geniposide, Peak A, baicalin, palmatine, berverine, Peak B 및 baicalein에 대하여 동시분석을 실시하였다. 그 결과 전탕액과 황련해독탕 정제(HRHDT F3) 모두 7종의 성분이 검출 되었으며, 동등상관계수가 0.
대상 데이터
- HRHDT 정제의 제조에 앞서 Table 2의 배합비율대로 HRHDT 단미엑스와 각각의 첨가제들을 혼합하여 HRHDT F1, F2 및 F3를 제조하였다. HRHDT의 단미엑스는 40 mesh sieve로 체과하여 입도를 균일화 시켰으며, 여기에 부형제로서 미결정셀루로오스와 이산화규소가 혼합된 Prosolve, 미결정셀루로오스인 Avicel101 및 Ludipress를, 붕해제로서 Croscamellose sodium을, 유동성 개선 부형제로 Aerosil® 200를 각각 칭량한 후 플라스틱 백에서 10분간 균일하게 혼합하였다.
- 정제의 물성평가에 있어서 F1은 결합력이 떨어져 경도를 측정할 수 없었고, F2 및 F3은 경우 각각 4와 7 KP의 경도를 나타내어 두 정제에 대한 붕해도를 측정하였다. 그 결과 F2은 39분, F3은 29분으로 대한민국약전내 붕해도 시험 중 나정의 붕해기준에 적합한 F3를 최종 배합비율로 선택하여 시제품을 제조하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. 세포배양을 위해 항생제 및 항균제인 1% Penicillin-streptomucin, 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 황련해독탕(HRHDT)의 구성 한약재인 치차(Gardenia jasminoides Ellis), 황금(Scutellaria baicalensis Georgi), 황련(Coptis chinensis Franchet) 및 황백(Phellodendron amurense Ruprecht) 은 ㈜휴먼허브(Gyeongsan, Korea)에서 각각 구입하여 전문가 감별 후 사용하였다. 각각의 구성 한약재들의 표본은 한약진흥재단 한약 제제팀의 한약재보관실에 보관하였다.
- 정제 제조를 위한 첨가물인 Prosolv, Avicel 101, Ludipress, Croscamellose sodium, Aerosil® 200 및 Magnesium Stearate은 ㈜화원약품 (seoul, Korea)에 구입하여 사용하였다. 성분프로파일 분석을 위해 5종의 표준물질인 baicalein는 식품의약품안전처 (Osong, Korea)로부터, baicalin, berberin, geniposide는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서, palmatine은 Avachem scientific(San Antonio, TX, USA)에서 각각 구입하였으며, 각 표준물질의 순도는 95.0% 이상이었다. 시료 전처리 및 HPLC 분석을 위한 acetonitrile과 methanol은 J.
- 0% 이상이었다. 시료 전처리 및 HPLC 분석을 위한 acetonitrile과 methanol은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였고, formic acid는 Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 약리 활성 평가를 위해 Fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), Penicillin-streptomucin, Phosphate buffered saline(PBS)는 Hyclone (USA)제품, lipopolysaccharide (LPS), Griess reagent, Ethanol, Chloroform, 2,2-diphenyl-1-picrylhygrazyl (DPPH)은 Sigma (USA) 제품, MTS 시약 및 Agarose는 Promega (USA) 제품, TNF-α, IL-6 Enzyme Linked Immunosorbent (ELISA) assay kit를 R&D System(USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
- 실험에서 사용된 대식세포는 마우스의 대식세포인(mouse macrophage line) RAW 264.7 세포로서 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 약리 활성 평가를 위해 Fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), Penicillin-streptomucin, Phosphate buffered saline(PBS)는 Hyclone (USA)제품, lipopolysaccharide (LPS), Griess reagent, Ethanol, Chloroform, 2,2-diphenyl-1-picrylhygrazyl (DPPH)은 Sigma (USA) 제품, MTS 시약 및 Agarose는 Promega (USA) 제품, TNF-α, IL-6 Enzyme Linked Immunosorbent (ELISA) assay kit를 R&D System(USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
- 0 ㎖/min으로 흘려주었으며 시료 주입량은 10 ㎕이었다. 이동상은 (A) 0.1% formic acid가 함유된 H2O와 (B) 0.1%formica acid가 함유된 acetonitrile를 사용하였고, Table 3과 같이 흘려주었다. 검출파장은 254 nm에서 확인하였다.
- 하지만, 붕해도 시험 결과 HRHDT F2는 완전히 붕해되기까지 30분 이상의시간이 소요되어 대한민국약전 일반시험법내 나정의 붕해도 기준에 부적합 하였고, F3의 경우 30분 이내에 붕해되어 기준적합을 확인하였다. 이후 실험에서 HRHDT F3를 시제품으로 제조하여 사용하였다.
- 정제 제조를 위한 첨가물인 Prosolv, Avicel 101, Ludipress, Croscamellose sodium, Aerosil® 200 및 Magnesium Stearate은 ㈜화원약품 (seoul, Korea)에 구입하여 사용하였다.
- 황련해독탕은 대한민국약전외한약(생약)규격집 의약품각조 3부에 수록된 황련해독탕 혼합단미엑스산의 구성약재 비율로 제조하여 각 구성 단미엑스산 기준에 따라 건조엑스를 혼합하여 사용하였다. 일반적으로 시중 판매되고 있는 한약제제의 부형제로 유당과 전분이 많이 사용되어 왔으며, 40 ~ 60%로 높은 함유량을 보이고 있다.
데이터처리
- Each value represents the mean ± SEM (n=3).Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA. p < 0.
- Each value represents the mean ± SEM (n=3). Statistical analysis was performed using the t -test. p < 0.
- 모든 실험결과는 mean± SEM (n=3)로 나타내었으며, 유의성 검사는 SAS (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 one way ANOVA test를 실시한 후 Tukey test로 사후 검증하였다.
이론/모형
- 7 cell. Cell viability was determined using MTS assay. Each value represents the mean ± SEM (n=3).
- 7 cell에 LPS를 처리하여 실험하였다. HRHDT F3과 2종의 일본 시판제품 HJP-1, HJP-2의 항염증 효과를 확인하기 위해 LAW 264.7 cellㅣ에 각각 200, 500 ㎍/㎖ 농도로 2시간 전처리한 후, LPS를 24시간 처리하여 세포로부터 생성되는 NO 생성량을 Griess assay방법으로 측정하였다 (Fig. 3). 그 결과 세 그룹 모두 200 ㎍/㎖에서 LPS 단독 처리그룹과 그 차이를 보이지 않았으나, 500 ㎍/㎖에서 약 80%이상 NO 생성량이 감소됨을 확인하였다.
- RAW 264.7 세포에 대한 독성정도를 알아보기 위하여3-(4,5-dime thylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraz olium (MTS) assay를 수행하였다. 먼저, RAW 264.
- 7 cells were pre-treated different concentraions of HRHDT F3, HJP-1 and HJP-2 for 2 hr, and then stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) for 24 hr. The IL-6 concentration in the medium were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Each value represents the mean ± SEM (n=3).
- Table 2의 배합비율로 혼합한 HRHDT 혼합물 F1, F2 및 F3의 기초 물성을 측정한 값은 Table 4에 나타내었다. 각 HRHDT 혼합물의 흐름성은 겉보기 밀도, 탭 밀도를 측정하여 Hausner ratio에 의해 평가되었다. Hausner ratio는 Excellent(1.
- 이 농축액을 진공건조기(Hanmoru, Korea)로 진공건조 하여 단미엑스산을 얻었다. 건조된 각각의 단미엑스는 대한민국약전외한약(생약) 규격집(KHP) 기준에 따라 혼합하여 사용하였다.
- 7 세포 (5×104 cell/12well)에 각각의 HRHDT 제제를 200, 500 ㎍/㎖로 2시간 동안 전처리 하였다. 이 후 LPS (1 ㎍/㎖)를 처리한 후, 24시간 배양하고 Griess assay 방법으로 NO의 농도를 측정하였다28). 즉, 세포배양액 100 ㎕에 동량의 Griess reagent (Sigma, USA)를 넣고 교반기에서 10분간 반응시킨 후 microplate reader (Tecan Infinite M200, Untersbergstrasse, Austria)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 1. 황련해독탕(HRHDT)을 기존 40∼60%의 부형제 함유량에서 20%로 줄여 1회 복용량을 최소화 하고, 복약순응도와 휴대성을 높인 정제로 개발하였다.
- 2. 개발된 황련해독탕 정제(HRHDT F3)는 전탕액과의 화학적 동등성 평가를 위해 7종의 성분에 대하여 비교분석한 결과 동등상관계수 0.9722로서 동등성이 97% 이상임을 확인하였다.
- 3. 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 2종의 일본 시판제품 HJP-1와 HJP-2간의 항산화 및 항염증에 대한 약리 효능 비교시험 결과 서로 간에 유의적인 차이가 없음을 확인하였다.
- 60)의 총 7개의 등급으로 나누어 흐름성을 평가하였다. HRHDT F1, F2 그리고 F3 혼합물의 Hausner ration 값은 각각 1.16, 1.12 그리고 1.08로써 HRHDT F3의 흐름성이 Excellent로 가장 좋았음을 확인하였고, F1, F2 그리고 F3 모두 타정하기에 적합한 흐름성을 보유하고 있었다.
- HRHDT F1의 경우 흐름성은 좋았으나, 실제 타정한 결과 정제의 경도가 매우 낮아 마손도와 붕해도 시험의 진행에 부적합 하였다. HRHDT F2와 F3은 각각 4 및 7 KP의 경도를 나타내었고, 마손도 측정결과 각각 0.5 및 0.2%의 우수한 결과를 보여주었다. 하지만, 붕해도 시험 결과 HRHDT F2는 완전히 붕해되기까지 30분 이상의시간이 소요되어 대한민국약전 일반시험법내 나정의 붕해도 기준에 부적합 하였고, F3의 경우 30분 이내에 붕해되어 기준적합을 확인하였다.
- 7) cell line에 대한 세포독성을 알아보기 위해 MTS assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. HRHDT F3, HJP-1 및 HJP-2을 200 및 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 세포의 생존율을 측정한 결과, 세 그룹 모두 200 및 500 ㎍/㎖ 의 농도에서 모두 95% 이상의 생존율을 보여주었다 (Fig. 2). 따라서 이후 실험에서는 이 결과를 바탕으로 세포생존에 영향을 주지 않는 범위 내에서 모든 실험을 수행하였다.
- HRHDT F3, HJP-1 및 HJP-2의 플라보노이드 함량은 각각 21.92, 20.30 및 24.23 ㎍/㎖으로 세 그룹간의 차이를 보이지 않으나, 폴리페놀 함량은 HJP-2가 31.20 ㎍/㎎으로 가장 높았으며, HJP-1이 19.41㎍/㎎ 가장 낮음을 확인하였다.
- 7개의 주요 peak는 치자의 geniposide, 황련 유래의 Peak A, 황련·황백의 palmatine, berverine 및 황금의 baicalin, baicalein 그리고 황금 유래의 Peak B이며, 이들의 동시분석을 위해 이동상은 water와 acetonitrile을 시간대별로 구성 비율을 달리하였다. PDA 검출기 파장 254 nm에서 geniposide, Peak A, baicalin, palmatine, berverine, Peak B 및 baicalein 순으로 각각 검출되었으며, 다른 성분들의 피크에 간섭 없이 분리됨을 확인하였다. 검액은 설정된 동시분석 조건에서 분석을 실시하였으며, 검액에서의 피크는 주요성분 피크의 retention time과 UV 스펙트럼이 일치함을 확인한 후 각 성분에 대한 peak area을 분석하였다 (Fig.
- TNF-α와 IL-6의 합성과 분비에 있어 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 HJP-1 및 HP-2의 비교실험 결과 TNF-α와 IL-6의 합성과 분비를 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였고, IL-6의 발현 억제에 있어 HJP-1이 가장 좋음을 확인하였다.
- 3). 그 결과 세 그룹 모두 200 ㎍/㎖에서 LPS 단독 처리그룹과 그 차이를 보이지 않았으나, 500 ㎍/㎖에서 약 80%이상 NO 생성량이 감소됨을 확인하였다. 또한 500 ㎍/㎖에서 NO 생성량 감소에 대한 세 그룹간의 유의적인 차이도 보이지 않았다.
- 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 전탕액간의 동등성 확보를 위해 구성약재의 주요성분인 geniposide, Peak A, baicalin, palmatine, berverine, Peak B 및 baicalein에 대하여 동시분석을 실시하였다. 그 결과 전탕액과 황련해독탕 정제(HRHDT F3) 모두 7종의 성분이 검출 되었으며, 동등상관계수가 0.9722로 전탕액과 황련해독탕 정제(HRHDT F3)가 97% 이상 동등함을 확인하였다.
- 그 결과DPPH radical 소거활성은 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와HJP-1 및 HJP-2 모두 농도 의존적으로 항산화 효과가 높아짐을 확인하였고, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에 있어 HJP-1 > HRHDT F3 > HJP-2 순으로 높게 측정되었다.
- 더욱이 세 그룹 모두 농도 500 ㎍/㎖에서 강력한 항산화제로 알려진 BHA보다 높은 효과를 보임을 확인하였다. 그리고 100, 500 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 HRHDT F3, HJP-1 및 HJP-2간의 통계적으로 유의적인 DPPH radical 소거활성의 차이는 확인되지 않았다.
- 또한 HJP-1, HJP-2 역시 100, 500 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 HJP-1은 18, 31 및 41%, HJP-2는 16, 36 및 51%로 농도 의존적으로 효과를 보였다. 더욱이 세 그룹 모두 농도 500 ㎍/㎖에서 강력한 항산화제로 알려진 BHA보다 높은 효과를 보임을 확인하였다. 그리고 100, 500 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 HRHDT F3, HJP-1 및 HJP-2간의 통계적으로 유의적인 DPPH radical 소거활성의 차이는 확인되지 않았다.
- HRHDT F3은 100, 500 및 1000 ㎍/㎖농도에서 각각 18, 30 및 47%로 농도 의존적인 항산화 효능을 확인하였다. 또한 HJP-1, HJP-2 역시 100, 500 및 1000 ㎍/㎖ 농도에서 HJP-1은 18, 31 및 41%, HJP-2는 16, 36 및 51%로 농도 의존적으로 효과를 보였다. 더욱이 세 그룹 모두 농도 500 ㎍/㎖에서 강력한 항산화제로 알려진 BHA보다 높은 효과를 보임을 확인하였다.
- 본 연구에서 LPS를 RAW 264.7 cell에 처리하여 TNF-α 및 IL-6의 생성을 유도함을 확인하였고, HRHDT F3와 2종의 일본 시판제품인 HJP-1, HJP-2를 농도 200, 500 ㎍/㎖ 처리시 TNF-α의 발현이 농도 의존적으로 감소됨을 보았다 (Fig. 4).
- 김 등19)의 연구결과에 따르면 황련해독탕은 대식세포에서 LPS로 인한 NO와 TNF-α 생성을 억제한다고 보고하였고, 기 등18)의 연구결과에서는 LPS 유도된 염증 마우스 모델에서 염증성 cytokine인 IL-6와 IFN-γ의 발현을 억제한다고 보고하였다. 본 연구에서 역시 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 2종의 일본 시판제제 HJP-1과 HJP-2의 NO 생성 억제능은 500 ㎍/㎖에서 80% 이상의 억제를 보였으며, 세 그룹에 대한 유의적인 차이는 나타나지 않았다. TNF-α와 IL-6의 합성과 분비에 있어 황련해독탕 정제(HRHDT F3)와 HJP-1 및 HP-2의 비교실험 결과 TNF-α와 IL-6의 합성과 분비를 농도 의존적으로 감소시킴을 확인하였고, IL-6의 발현 억제에 있어 HJP-1이 가장 좋음을 확인하였다.
- 이상의 결과로부터 황련해독탕(HRHDT)을 기존 시판제제들보다 부형제의 함유량을 감소시켜 1회 복용량을 줄이고, 복용 편의성이 높은 현대적인 제형인 정제로 제형을 개발 하였다. 더욱이 황련해독탕(HRHDT) 정제와 전탕액간의 성분분석과 2종의 일본 시판제제인 HJP-1와 HJP-2와의 항산화, 항염증 실험을 통하여 구성약재의 동등성과 약효에 대한 동등성을 확보하였다.
- 2%의 우수한 결과를 보여주었다. 하지만, 붕해도 시험 결과 HRHDT F2는 완전히 붕해되기까지 30분 이상의시간이 소요되어 대한민국약전 일반시험법내 나정의 붕해도 기준에 부적합 하였고, F3의 경우 30분 이내에 붕해되어 기준적합을 확인하였다. 이후 실험에서 HRHDT F3를 시제품으로 제조하여 사용하였다.
- 타정에 앞서 배합된 황련해독탕 F1, F2 및 F3 혼합물의 겉보기 밀도 및 탭 밀도를 바탕으로 한 Hausner ratio에 의해 흐름성을 판정하고, 단발 타정기로 타정한 뒤, 경도, 마손도 및 붕해도 등을 실험하여 황련해독탕 정제의 물성을 평가하였다. 황련해독탕 F1, F2 그리고 F3 혼합물의 흐름성은 타정하기 적합하였으며, 특히 F3의 흐름성이 1.08(Excellent)로 가장 좋았다. 정제의 물성평가에 있어서 F1은 결합력이 떨어져 경도를 측정할 수 없었고, F2 및 F3은 경우 각각 4와 7 KP의 경도를 나타내어 두 정제에 대한 붕해도를 측정하였다.
후속연구
- 이는 황련해독탕 정제가 전탕액과 동일한 성분임을 나타내며, 2종의 일본 시판제제와의 약효 비교에 있어 차이가 없음을 말한다. 따라서 본 연구의 결과물이 향후, 한약제제전탕액의 제형개선 연구에 도움이 될 것이라 사료된다.
- 따라서 황련해독탕(HRHDT) 전탕액과 화학적으로 동등하며, 우수한 일본 제품들과의 품질의 차이가 없는 황련해독탕 정제(HRHDT F3)를 개발하였으며, 향후 이를 바탕으로 다양한 처방에 대하여 정제와 캡슐제 같은 현대적인 제형개발로 한약제제 제품에 대한 우수성 및 품질향상을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
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