황금작약탕(黃芩芍藥湯)을 함유하는 정제 개발과 성분분석 및 약리효능 평가 Evaluation on Pharmacological Effects and Component Analysis of Hwanggeumjakyak-tang Formulation for Tablet원문보기
Hwanggeumjackyak-tang (HJT) composed of Scatellaria baicalensis Georgi, Paeonia Lactiflora and Glycyrrhizae uralensis Fischer is a traditional Korean herbal medicine widely used for acute enteritis. In order to develop the tablet formulation of HJT, evaluation of the flow properties, thickness, diam...
Hwanggeumjackyak-tang (HJT) composed of Scatellaria baicalensis Georgi, Paeonia Lactiflora and Glycyrrhizae uralensis Fischer is a traditional Korean herbal medicine widely used for acute enteritis. In order to develop the tablet formulation of HJT, evaluation of the flow properties, thickness, diameter, hardness, friability and disintegration was carried out on four HJT granules according to mixed content of seven additives. Simultaneous analysis used HPLC method was performed of HJT tablet and was determined of the seven marker components; Albiflorin, Paeoniflorin, Liquiritin, Baicalin, Baicalein, Glycyrrhizic acid and Wogonin. The biological activities were examined the effect of HJT on anti-oxidation and pro-inflammation mediated by LPS-stimulation. We confirmed that both of HJT-Decoction (HJT-D) and HJT-Formulation (HJT-F) have the similar contents on total polyphenol and flavonoid and inhibited the secretion of nitro oxide (NO), interleukin $(IL)-1{\beta}$,interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor $(TNF)-{\alpha}$ and the expression of nitric oxide synthase (iNOS), $IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha}$. Therefore, the developed formulation for tablet of HJT would provide chemically and biologically the same effect compared with decoction of HJT.
Hwanggeumjackyak-tang (HJT) composed of Scatellaria baicalensis Georgi, Paeonia Lactiflora and Glycyrrhizae uralensis Fischer is a traditional Korean herbal medicine widely used for acute enteritis. In order to develop the tablet formulation of HJT, evaluation of the flow properties, thickness, diameter, hardness, friability and disintegration was carried out on four HJT granules according to mixed content of seven additives. Simultaneous analysis used HPLC method was performed of HJT tablet and was determined of the seven marker components; Albiflorin, Paeoniflorin, Liquiritin, Baicalin, Baicalein, Glycyrrhizic acid and Wogonin. The biological activities were examined the effect of HJT on anti-oxidation and pro-inflammation mediated by LPS-stimulation. We confirmed that both of HJT-Decoction (HJT-D) and HJT-Formulation (HJT-F) have the similar contents on total polyphenol and flavonoid and inhibited the secretion of nitro oxide (NO), interleukin $(IL)-1{\beta}$,interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor $(TNF)-{\alpha}$ and the expression of nitric oxide synthase (iNOS), $IL-1{\beta}$, IL-6, $TNF-{\alpha}$. Therefore, the developed formulation for tablet of HJT would provide chemically and biologically the same effect compared with decoction of HJT.
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문제 정의
본 연구에서는 이러한 문제를 해결하고자 부형제의 함량을 줄이고 순응도가 높은 제형의 개발과 품질확보 및 효능의 동등성을 확인하고자 하였다. 제형 개발을 위해서 겉보기 밀도, 탭 밀도 등을 측정하여 흐름성을 판정하고 타정한정제를 이용하여 경도, 마손도, 붕해도 등의 확인을 통해 물성평가를 한 결과, Hausner ratio 값이 HJT-F1과 F2은 1.
제제연구를 통해 제형의 변화를 가져온 황금작약탕의 품질검사를 위해 7종 표준물질에 대해 HPLC-DAD를 통한 최적의 동시분석법을 확립하고자 하였다. HJT-F2의 동시분석법을 적용하여 HJT-F2의 7가지 생리활성 물질인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid 및 wogonin을 시료 내 다른 성분에 영향을 받지 않으면서 동시에 효과적으로 분석이 가능함을 보여주었다.
− DPPH(1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma Aldrich, USA) radical 소거능 측정은 Biosis의 방법을 변형하여 측정하였다.
− HPLC-PDA를 이용하여 용매의 구성 및 검출 파장에 대한 분석 조건을 검토하여 HJTF2를 구성하는 3종의 한약재 중 황금의 baicalin, baicalein 및 wogonin, 작약의 paeoniflorin, albiflorin 및 감초의 glycyrrhizic acid, liquiritin 등 7종 표준물질에 대한 동시분석법을 확립하였다(Fig. 1).
− RAW 264.7 cell에 대한 HJT-D와 HJT-F2의 독성을 확인한 결과, 두 시료에서 모두 1000 μg/mL 농도에서 독성이 나타나지 않았고, 따라서 1000 μg/mL 이하의 농도에서 유효활성을 나타내는 낮은 농도를 실험농도로 결정하여 실험에 진행하였다(Fig. 3).
− RAW 264.7 세포주를 12 well plate에 5×104 cell/well로 분주하고 HJTD과 HJT-F를 50, 100, 200 μg/mL로 2시간 전처리를 하였다.
− RNA 분리를 위해 RAW 264.7 세포는 12 well plate에 5×104 cells/mL 세포로 분주한 다음, 세포에 HJT-D와 HJT-F를 50, 100, 200 μg/mL씩 처리한 후, LPS로 처리하고 RNAiso reagent를 이용해 제조사의 방법에 따라 total RNA를 취하였다.
− 세포독성을 확인하기 위해 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt, Promega, USA) assay를 실시하였다.
− 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu reagent(Sigma Aldrich, USA)가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다.
− 항염증 사이토카인 중 대표 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β, IL-6에 대한 유전자 발현과 생성 억제 효과를 확인하였다(Fig. 5).
− 황금작약탕 단미건조엑스제와 첨가제들의 혼합물의 물성평가를 위해 겉보기 밀도(Bulk density)와 탭 밀도(Tap density)를 측정하였고 이를 이용하여 흐름성을 평가하였다.
1. 부형제의 함량을 줄이고 순응도가 높은 제형 개발을 위하여 겉보기 밀도, 탭 밀도 등을 측정하여 흐름성을 판정하고, 경도, 마손도, 붕해도 등의 확인을 통해 물성평가를 하여 높은 경도와 가장 빠른 붕해도를 나타낸 제형을 선정하였다.
10-13) 이에 본 연구는 황금작약탕의 정제로 제형변화를 실시하여 보관이 용이하고, 복약 순응도가 높은 현대적인 제형에 대한 연구를 실시하였고, 동시분석법 확립을 통해 개선된 황금작약탕 정제의 품질관리 방법을 확보하였으며, 항산화, 항염증 실험을 통하여 약효 동등성을 확인하였다.
14) 각 시료를 100, 200, 500, 1000 μg/mL로 희석하여 96 well plate에 100 μL를 주입하고 0.2 mM DPPH 50 μL를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2. 황금작약탕 정제의 품질검사를 위해 HPLC-DAD를 통한 황금작약탕의 7가지 생리활성물질인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid, wogonin의 동시분석법을 확립하였다.
HPLC system은 Dionex-300 system(DIONEX, CA, USA)를 사용하였고, YMC C18(5 μm, 4.6×250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼으로 분리하였다.
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5×103 cell/well로 분주하고, HJT-D과 HJT-F를 2배수 희석법으로 희석하여 농도별로 처리하였다.
NO 측정을 위해서 배양액 100 μL에 동량의 Griess reagent(Sigma, USA)를 넣고 10분간 반응시킨 후 microplate reader(Tecan Infinite M200)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 standard curve와 비교해 계산하였다. 사이토카인 분비 측정을 위해 ELISA kit를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다.
7 세포는 12 well plate에 5×104 cells/mL 세포로 분주한 다음, 세포에 HJT-D와 HJT-F를 50, 100, 200 μg/mL씩 처리한 후, LPS로 처리하고 RNAiso reagent를 이용해 제조사의 방법에 따라 total RNA를 취하였다. Total RNA는 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 유전자 증폭을 위해 특정 primer를 넣고 각 primer에 따른 PCR 조건에 따라 실시하였다. 이때 iNOS(F: 5'-CCTCCTCCACCCTACCAAGT-3', R: 5'-CACCCAAAGTGCTTCAGTCA-3')와 IL-6(F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG -3', R: 5'- GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3')는 94oC에서 30초, 60o C에서 30초, 72oC에서 30초 동안 40 cycle로 반응시켰고, COX-2(F: 5'-GAGGCCACTGATACCTATTG-3', R: 5'-ACAAAGAAGGGTTCCCAATT-3')는 94oC에서 30초, 58oC 에서 30초, 72oC에서 30초 동안 40 cycle로 반응시켰으며, TNF-α(F: 5'-GGCAGGTCTACTTTGGAGTC-3', R: 5'-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3')는 94oC에서 1분, 55oC에서 20초, 72oC에서 30초 동안 35 cycle로, GAPDH(F: 5’-CAACTCCCACTCTTCCACCT-3', R: 5'-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3')는 94oC에서 20초, 60oC 에서 20초, 72oC에서 20초 동안 30 cycle로 반응시켰다.
iNOS, β-actin 등 primary antibody는 4oC에서 overnight 반응시킨 후, 1×PBS-T로 세 번 세척하고, secondary antibody는 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 1×PBS-T로 세 번 세척하고 ECL 기질로 발색시킨 후 ChemiDoc-It Imaging System(UVP, Canada)로 감광하였다.
이때 iNOS(F: 5'-CCTCCTCCACCCTACCAAGT-3', R: 5'-CACCCAAAGTGCTTCAGTCA-3')와 IL-6(F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG -3', R: 5'- GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3')는 94oC에서 30초, 60o C에서 30초, 72oC에서 30초 동안 40 cycle로 반응시켰고, COX-2(F: 5'-GAGGCCACTGATACCTATTG-3', R: 5'-ACAAAGAAGGGTTCCCAATT-3')는 94oC에서 30초, 58oC 에서 30초, 72oC에서 30초 동안 40 cycle로 반응시켰으며, TNF-α(F: 5'-GGCAGGTCTACTTTGGAGTC-3', R: 5'-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3')는 94oC에서 1분, 55oC에서 20초, 72oC에서 30초 동안 35 cycle로, GAPDH(F: 5’-CAACTCCCACTCTTCCACCT-3', R: 5'-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3')는 94oC에서 20초, 60oC 에서 20초, 72oC에서 20초 동안 30 cycle로 반응시켰다. 각 DNA는 1.5% agarose gel에 전기영동시킨 후 UV 검출기로 확인하였다.
− 황금작약탕 단미건조엑스제와 첨가제들의 혼합물의 물성평가를 위해 겉보기 밀도(Bulk density)와 탭 밀도(Tap density)를 측정하였고 이를 이용하여 흐름성을 평가하였다. 겉보기 밀도는 혼합물을 메스실린더에 넣어 부피측정으로, 탭 밀도는 혼합물이 들어있는 메스실린더를 200회 tapping한 후 측정하여 아래의 수식에 의해 값을 구하였고 그 측정값으로 Hausner ration 값을 구하여 흐름성을 평가하였다.
5oC의 정제수에서 시험하였고, 붕해시간은 검체의 잔여물이 유리관 안에 존재하지 않거나 남아있더라도 원형을 나타내지 않는 연질의 물질이 존재할 때까지의 시간으로 하였다. 마손도는 10개의 정제를 Friability Tester(TAR 120, Ereweka, Germany)에서 25 rpm으로 4분동안 회전시킨 후, 손실된 무게를 측정하여 다음의 수식으로 계산하였다.
붕해도 시험은 Disintegration Tester(Disintegration 3100, DISTEK, USA)를 사용하여 37 ± 0.5oC의 정제수에서 시험하였고, 붕해시간은 검체의 잔여물이 유리관 안에 존재하지 않거나 남아있더라도 원형을 나타내지 않는 연질의 물질이 존재할 때까지의 시간으로 하였다.
Sodium nitrite의 standard curve와 비교해 계산하였다. 사이토카인 분비 측정을 위해 ELISA kit를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다. 양성 대조군으로 Dexamethasone을 사용하였다.
상층액을 따로 분리한 후 BCA Protein Assay Kit(Thermo, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였고, 20~30μg의 lysate를 8~12% gel을 사용하여 SDS-PAGE system으로 분리하였다.
생물학적 동등성을 확인하기 위해 항산화, 항염증 효능 평가를 진행하였다. 인체는 다양한 항산화 효소와 산화물질을 제거 혹은 중화시키는 방어 시스템을 갖추고 있지만 세균이나 외부 침입으로 유해한 환경 등에 노출되었을 때 방어시스템이 무너져 불균형이 발생하고 과도한 산화를 일으켜 질병의 직간접적인 요인이 될 수 있다.
7 세포주를 12 well plate에 5×104 cell/well로 분주하고 HJTD과 HJT-F를 50, 100, 200 μg/mL로 2시간 전처리를 하였다. 이 후 LPS를 100 ng/mL로 처리한 후 24시간 동안 배양하고 배양 상층액을 취해 각 실험에 사용하고 세포는 cell extraction을 위하여 사용하였다. NO 측정을 위해서 배양액 100 μL에 동량의 Griess reagent(Sigma, USA)를 넣고 10분간 반응시킨 후 microplate reader(Tecan Infinite M200)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1). 이동상인 water와 acetonitrile에 0.05% phosphoric acid를 첨가함으로써 분리능을 높였다. 각 표준물질의 최대 UV spectrum 탐색 결과, 최대 UV 흡수 파장이 paeoniflorin, albiflorin, liquiritin은 230 nm, glycyrrizic acid는 250 nm, baicalin, baicalein, wogonin은 275 nm로 측정되었으며 전반적으로 가장 적절한 230 nm로 검출기 파장을 설정하였다.
이를 PVDF(polyvinylidene difluoride) membrane (Millipore, Germany)에 100 V로 1시간 동안 transfer한 후, blocking을 5% BSA가 함유된 1×PBS-T(1×PBS, 0.1% Tween-20) 용액으로 상온에서 1시간 동안 실시하였다.
15) 표준물질로는 tannic acid(Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 검량선을 작성하였다. 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등의 방법16)]을 변형하여 측정하였고, 표준물질로 quercetin(Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 검량선을 작성하였다.
2 mM DPPH 50 μL를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 희석 용매인 정제수를 대조군으로 하고, 활성비교를 위하여 양성대조군으로 Butylated hydroxyanisole(BHA)를 사용하였다.
대상 데이터
− 실험에 사용된 황금작약탕의 구성 한약재인 황금, 작약, 감초는 ㈜휴먼허브(Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 전문가의 감별 후 사용하였다.
− 정제 제조를 위한 첨가물은 microcrystalline cellulose(Avicel 101 and Ludipress)와 magnesium stearate, VIVASOL, SiO2, lactose, starch로 ㈜화원약품(Korea)에서 구입하여 사용하였다.
동시분석을 위한 7가지 표준품인 baicalin, baicalein, liquiritin 및 glycyrrhizic acid은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, albiflorin과 paeoniflorin은 ChemFace(Wuhan, China)에서, wogonin은 식품의약품안전처(Osong, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 각 표준물질은 95.
단백질 분석을 위해 사용한 1차 항체인 iNOS는 BD Bioscience(USA), β-actin과 2차 항체인 goat anti-Mouse IgG-HRP는 Santa Cruze(USA)에서 구입하였다. Total RNA extraction을 위해 사용한 RNAiso는 TaKaRa(Japan)에서, cDNA 합성과 PCR에 사용한 모든 시약은 Intron(Korea)에서 구입하여 사용하였다.
단백질 분석을 위해 사용한 1차 항체인 iNOS는 BD Bioscience(USA), β-actin과 2차 항체인 goat anti-Mouse IgG-HRP는 Santa Cruze(USA)에서 구입하였다.
30%를 나타내며, F1과 F2에 비해 낮은 결과를 보였다. 붕해도 결과에서 HJT-F2는 완전히 붕해되기까지 17분이내의 사간이 소요되었지만, 나머지 HJT-F1, F3, F4는 20분 이상의 시간이 소요되는 것을 확인하여 흐름성뿐만 아니라 경도와 마손도, 붕해도에서 모두 뛰어난 결과를 보인 HJT-F2를 이후 실험의 시제품으로 사용하였다.
0% 이상의 순도를 가진 제품으로 사용하였다. 시료 전처리와 HPLC 분석에 사용한 methanol, acetonitrile은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. HPLC system은 Dionex-300 system(DIONEX, CA, USA)를 사용하였고, YMC C18(5 μm, 4.
실험에 사용한 RAW 264.7(Mouse macrophage cell line) 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 구입하였고, 세포 배양을 위해 10% FBS, 1% penicillinstreptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
사이토카인 분비 측정을 위해 ELISA kit를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다. 양성 대조군으로 Dexamethasone을 사용하였다.
첨가제로 사용된 부형제로는 미결정셀룰로오스인 Avicel 101 및 Ludipress와 이산화규소(SiO2)가 혼합된 Prosolve를, 붕해제로는 Croscamellose sodium을, 유동선 개선제로는 Aerosil® 200을 사용하였다.
데이터처리
− 모든 실험결과는 「평균±표준편차」로 나타내었으며, 유의성 검사는 one way ANOVA test를 실시한 후 Turkey test로 사후 검증하였다.
HJT-F의 물성평가는 정제의 무게, 지름, 두께, 경도는 Hardness Tester(TBH 325, Ereweka, Germany)로 측정되었으며, 이때 모든 평가는 3회 측정값의 평균으로 계산되었다. 붕해도 시험은 Disintegration Tester(Disintegration 3100, DISTEK, USA)를 사용하여 37 ± 0.
이론/모형
5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL) of HJT-D and HJT-F for 24 hrs. Cell viability was measured using MTT assay. *: significantly different from HJT-D and HJT-F2, p<0.
− 황금작약탕(HJT) 정제 제조를 위하여 Table II의 배율로 배합한 혼합물들의 기초 물성을 측정한 값을 Table III에 나타냈다. 각 HJT 혼합물의 흐름성을 겉보기 밀도, 탭 밀도를 측정하여 Hausner ratio에 의해 평가하였다. Hausner ratio는 Excellent(1.
C에서 3시간 동안 개별 추출한 후 적정 농도로 농축한 뒤, 진공건조하여 단미건조엑스산을 얻었다. 건조된 각각의 단미건조엑스산을 대한민국약전외 한약(생약) 규격집(KHP, The Korean Herbal Pharmacopoeia) 기준에 따라 혼합하여 사용하였다.
성능/효과
21-24) HJT-D와 HJT-F2의 라디칼 소거능은 시료 1000 μg/mL에서 HJT-D은 89.4%, HJT-F2은 95.2%으로 높은 효능을 나타냈고, HJT-F2의 효능이 다소 높은 편으로 확인되었다.
3. 항산화 실험결과 HJT-D와 HJT-F2 모두 높은 효능을 나타냈고, HJT-F2의 라디칼 소거능과 flavonoide 함량이 비교적 높았지만 유의적 차이는 보이지 않았다.
4. 항염증 실험에서 NO와 IL-6 분비 및 발현이 Dexamethasone과 비교하여 높은 효능을 나타냈고, TNF-α와 IL-1β의 분비 및 발현에서는 Dexamethasone과 비교하여 미미한 효능이지만 농도의존적 억제효능을 나타냈다.
Fig. 3(A)에서 나타나는 것과 같이 HJTD와 HJT-F2는 농도의존적으로 NO의 생성은 감소하였고, 200 μg/mL에서 HJT-D은 81.7%, HJT-F2는 81.4%의 감소를 보였으며, 이것은 DEX가 33%의 억제률을 나타낸 것보다 높은 수치였다.
4가지 혼합물을 대상으로 타정한 각 정제의 물성평가 결과는 Table IV와 같이 나타났다. HJT-F1과 F2는 경도는 17.61, 19.93 KP로 15이상의 값을 보였고, 마손도 역시 0.15, 0.14%로 나타나 좋은 결과를 보였다. 상대적으로 HJT-F3과 F4는 14.
각 표준물질의 최대 UV spectrum 탐색 결과, 최대 UV 흡수 파장이 paeoniflorin, albiflorin, liquiritin은 230 nm, glycyrrizic acid는 250 nm, baicalin, baicalein, wogonin은 275 nm로 측정되었으며 전반적으로 가장 적절한 230 nm로 검출기 파장을 설정하였다. HJT-F2에 대한 본 연구의 동시분석법을 적용하여 분석한 결과, HJT-F에서 표준물질 피크가 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid 및 wogonin의 순으로 검출되었다. HJT-F와 표준액 7종 피크의 UV spectrum 탐색 결과, 모두 동일 스펙트럼으로 각기 다른 성분들의 피크에 간섭 없이 분리되었다.
제제연구를 통해 제형의 변화를 가져온 황금작약탕의 품질검사를 위해 7종 표준물질에 대해 HPLC-DAD를 통한 최적의 동시분석법을 확립하고자 하였다. HJT-F2의 동시분석법을 적용하여 HJT-F2의 7가지 생리활성 물질인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid 및 wogonin을 시료 내 다른 성분에 영향을 받지 않으면서 동시에 효과적으로 분석이 가능함을 보여주었다. 이는 제형 개발한 HJT-F2에 대하여 기존의 표준물질들에 대한 개별적인 분석법보다 효율적인 품질관리방안에 대한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
HJT-F2에 대한 본 연구의 동시분석법을 적용하여 분석한 결과, HJT-F에서 표준물질 피크가 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid 및 wogonin의 순으로 검출되었다. HJT-F와 표준액 7종 피크의 UV spectrum 탐색 결과, 모두 동일 스펙트럼으로 각기 다른 성분들의 피크에 간섭 없이 분리되었다.
Hausner ratio는 Excellent(1.00-1.11), Good(1.12-1.18), Fair(1.19-1.1.25), Passable(1.26-1.34), Poor(1.35-1.45), Very poor(1.46-1.59), Very verypoor(>1.60)의 총 7개 등급으로 나누어 흐름성을 평가하였고, HJT-F1, F2, F3 및 F4 혼합물의 Hausner ratio 값은 각각 1.16, 1.02, 1.07, 1.25로 확인하였고, 그 중 HJT-F2의 흐름성이 Excellent로 가장 좋은 것으로 나타났다.
IL-1β의 유전자 발현 확인결과 200 μg/mL에서 강한 억 제능이 나타났고, HJT-D가 HJT-F2보다 더 낮은 농도에서 유전자 발현 억제능이 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 5D, E).
IL-6의 경우 사이토카인 분비에 있어서 HJT-D과 HJTF2 모두 실험 최저 농도인 50 μg/mL에서 대조군인 DEX와 유사하게 강한 억제능이 나타나고, 유전자 발현은 200 μg/mL에서 강한 억제능이 나타남을 확인하였다(Fig. 5C, E).
5). RAW 264.7 cell에 LPS 처리 후, HJT-D와 HJT-F2 모두 농도의존적으로 사이토카인 분비를 감소시키는 경향이 나타났다. TNF-α는 HJT-D의 경우 100 μg/mL에서 사이토카인의 분비가 급격히 감소하고 HJT-F2는 50 μg/mL에서사이토카인 분비가 급격히 감소하였다(Fig.
TNF-α와 IL-1β 분비와 발현 억제능을 살펴본 결과 실험최고농도인 200 μg/mL에서 HJT-F2는 Dexamethasone과 유사한 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
05% phosphoric acid를 첨가함으로써 분리능을 높였다. 각 표준물질의 최대 UV spectrum 탐색 결과, 최대 UV 흡수 파장이 paeoniflorin, albiflorin, liquiritin은 230 nm, glycyrrizic acid는 250 nm, baicalin, baicalein, wogonin은 275 nm로 측정되었으며 전반적으로 가장 적절한 230 nm로 검출기 파장을 설정하였다. HJT-F2에 대한 본 연구의 동시분석법을 적용하여 분석한 결과, HJT-F에서 표준물질 피크가 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid 및 wogonin의 순으로 검출되었다.
4%의 감소를 보였으며, 이것은 DEX가 33%의 억제률을 나타낸 것보다 높은 수치였다. 또한 NO 생성과 유사한 양상으로 NO 합성 효소인 iNOS의 mRNA와 단백질 발현에서도 농도의존적인 감소양상을 보였다(Fig. 4(B)).
라디칼 소거능은 HJT-D과 HJT-F2의 농도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였고, 시료농도 1000 μg/mL에서 HJT-D은 89.4%, HJT-F2은 95.2%로 대조군인 Butylated hydroxyanisole (BHA) 100 μg/mL과 유사한 값을 나타냈다(Fig. 2).
14%로 나타나 좋은 결과를 보였다. 상대적으로 HJT-F3과 F4는 14.93, 14.76 KP의 경도값을 나타냈으며, 마손도는 0.42, 0.30%를 나타내며, F1과 F2에 비해 낮은 결과를 보였다. 붕해도 결과에서 HJT-F2는 완전히 붕해되기까지 17분이내의 사간이 소요되었지만, 나머지 HJT-F1, F3, F4는 20분 이상의 시간이 소요되는 것을 확인하여 흐름성뿐만 아니라 경도와 마손도, 붕해도에서 모두 뛰어난 결과를 보인 HJT-F2를 이후 실험의 시제품으로 사용하였다.
5A). 유전자 발 역시 HJT-F2가 HJT-D과 비교하여 더 낮은 농도에서 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5B). IL-1β의 경우 HJT-D은 200 μg/mL에서 사이토카인 분비 억제를 나타내는 반면, HJTF2는 100 μg/mL에서 사이토카인 분비 억제를 보이고 200 μg/mL에서 대조군인 DEX와 유사하게 강한 억제능이 나타났다.
25,26) Kim 등의 보고6)에 따르면 황금작약탕 물 추출물은 LPS에 의해 유도된 NO, PGE2, IL-6의 생성 및 iNOS, COX-2의 발현을 강하게 억제하는 효과를 가지고 있다. 이와 동일하게 HJT-D 및 HJT-F2의 항염증 효능을 확인한 결과 NO 분비가 대조군으로 사용한 Dexamethasone보다 높은 억제효능을 나타냈으며, IL-6 분비 또한 Dexamethasone보다 높은 효과를 나타냄을 확인하였다. TNF-α와 IL-1β 분비와 발현 억제능을 살펴본 결과 실험최고농도인 200 μg/mL에서 HJT-F2는 Dexamethasone과 유사한 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 연구에서는 이러한 문제를 해결하고자 부형제의 함량을 줄이고 순응도가 높은 제형의 개발과 품질확보 및 효능의 동등성을 확인하고자 하였다. 제형 개발을 위해서 겉보기 밀도, 탭 밀도 등을 측정하여 흐름성을 판정하고 타정한정제를 이용하여 경도, 마손도, 붕해도 등의 확인을 통해 물성평가를 한 결과, Hausner ratio 값이 HJT-F1과 F2은 1.16, 1.02로 F3와 F4의 1.17, 1.25보다 비교적 흐름성이 좋았고 그 중 F2는 Excellent였으며, 물성평가에 있어서 HJT-F2가 높은 경도와 가장 빠른 붕해도를 나타내어 최종적 선택이 되었다. 결합제로 사용한 미결정셀룰로오스인 Avicel 101은 Battista & Smith에 의해 1955년에 처음 발견되었고 1964년 이후 약 50년 이상 제약산업에서 direct compression으로 주로 사용되어 온 결합제18)로 wood에서 유래된 cellulose chain의 구조적 특성과 높은 입자 안 공극을 가짐으로 인한 swelling과 붕해도에 영향을 미치는 것18)으로 이를 첨가한 HJT-F1과 HJT-F2가 상대적으로 높은 경도값을 가지고, 흐름성이 좋은 것으로 사료된다.
황금작약탕 전탕액과 개발제형의 효능비교 결과, 일부 활성평가와 실험농도에서의 개발제형의 효능이 비교적 높게 나타났으나, 유의적 차이는 없는 것으로 나타났다.
후속연구
12-13,27-28) 한약제제는 제조사마다 사용하는 원료, 추출법, 제형화 등의 제조방식의 차이가 있어 전탕액과의 동등성 및 제제의 품질에 대한 논란이 빈번하게 제기되어 왔다. 본 연구 결과, 한약제제에 대한 제조방법의 연구와 표준화 연구, 품질관리 등의 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
HJT-F2의 동시분석법을 적용하여 HJT-F2의 7가지 생리활성 물질인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid 및 wogonin을 시료 내 다른 성분에 영향을 받지 않으면서 동시에 효과적으로 분석이 가능함을 보여주었다. 이는 제형 개발한 HJT-F2에 대하여 기존의 표준물질들에 대한 개별적인 분석법보다 효율적인 품질관리방안에 대한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
황금작약탕이란 무엇인가?
황금작약탕은 중국 고서인 상한론에 처음 기록된 이래로 1,700년 동안 사용해 왔고, 동의보감에 따르면 급성, 만성 장염, 급성 이질 등에 사용하여 왔다고 알려져 있다.5) 황금작약탕은 3가지 구성 약재, 즉 황금과 작약, 감초로 구성되어 있다.
황금작약탕의 3가지 구성 약재별 특징은 무엇인가?
5) 황금작약탕은 3가지 구성 약재, 즉 황금과 작약, 감초로 구성되어 있다. 황금(Scatellaria baicalensis Georgi)은 NO, iNOS, COX2, PGE2, NF-κB, 염증성 사이토카인 생성, MAPK 신호분자의 발현 등을 억제함으로써 항염증 효과가 있고, 작약(Paeonia Lactiflora)은 toll-like receptor(TLR) 매개성 염증효과를 가지고 있으며, 감초(Glycyrrhiza uralensis)의 생물 활성 성분인 triterpenes, flavonoid, polysaccharide 중에서 3가지의 triterpenes과 13가지의 flavonoid가 TNF-α와 MMPs, PGEs, 자유 라디칼의 감소를 유도해 항염증 효과가 있음을 보고하였다.6-9) 또한 이들로 구성된 황금작약탕의 항균효과와 항염증효과 등에 대한 효능연구가 보고되었다.
황금작약탕의 효능은 무엇인가?
황금(Scatellaria baicalensis Georgi)은 NO, iNOS, COX2, PGE2, NF-κB, 염증성 사이토카인 생성, MAPK 신호분자의 발현 등을 억제함으로써 항염증 효과가 있고, 작약(Paeonia Lactiflora)은 toll-like receptor(TLR) 매개성 염증효과를 가지고 있으며, 감초(Glycyrrhiza uralensis)의 생물 활성 성분인 triterpenes, flavonoid, polysaccharide 중에서 3가지의 triterpenes과 13가지의 flavonoid가 TNF-α와 MMPs, PGEs, 자유 라디칼의 감소를 유도해 항염증 효과가 있음을 보고하였다.6-9) 또한 이들로 구성된 황금작약탕의 항균효과와 항염증효과 등에 대한 효능연구가 보고되었다. 병원감염을 일으키는 가장 흔한 균으로 알려진 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 중에서 항생제 내성을 가진 methicillinresistant Staphylococcus aureus(MRSA)의 치료에 있어 후보 물질이 될 수 있음을 검증하였고,5) lpopolysaccharide(LPS)로 자극된 RAW264.
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