Objective : Recently interest of fermented herb medicine has increased in Oriental medicine. Herb medicine fermented in a proper condition resultingly has better or new virtue by microbe. This study was designed to compare the anti-inflammatory effects of herbal decoction and fermented herbal decoct...
Objective : Recently interest of fermented herb medicine has increased in Oriental medicine. Herb medicine fermented in a proper condition resultingly has better or new virtue by microbe. This study was designed to compare the anti-inflammatory effects of herbal decoction and fermented herbal decoction in Hwangnyeonhaedok-tang (Huanglian fiedu-tang; HHT). Methods : The effects of HHT and FHHT on anti-inflammation were measured by production of NO and pro-inflammatory cytokine productions including TNF-${\alpha}$ and IL-1${\beta}$, IL-6 in LPS induced RAW 264.7 cells. Results : 1. Cell viability in three doses of HHT extract (0.01, 0.05 and 0.10 mg/ml) and two doses of FHHT extract (0.01, 0.05 mg/ml) was more than 70％ and 80％ each. 2. In RAW 264.7 cells, LPS displayed significant stimulatory effects on the production of NO. However, both HHT, FHHT showed significant inhibitory effects on the production of NO. 3. Pre-treatment by HHT in a various concentrations (0.01, 0.05, 0.10, 0.50mg/ml) reduced the elevated production of TNF-${\alpha}$, IL-1${\beta}$, IL-1${\beta}$ mRNA, IL-6 mRNA. More than 0.05mg/ml concentrations of HHT reduced the production of IL-6. And TNF-${\alpha}$, IL-1${\beta}$ level of mouse serum reduced in a various dose(0.1, 0.5, 1.0g/kg). 4. Pre-treatment by FHHT in a various concentrations (0.01, 0.05, 0.10, 0.50mg/ml) reduced the elevated production of TNF-${\alpha}$. More than 0.05mg/ml concentrations of FHHT reduced the expression of TNF-${\alpha}$ mRNA. 0.1, 0.50mg/ml concentrations of FHHT reduced the production of IL-6. And IL-1${\beta}$ level of mouse serum reduced in a various dose(0.1, 0.5, 1.0g/kg). Conclusions : These results indicated that both HHT and FHHT could have anti-inflammatory capacity by inhibiting the production of NO and cytokines in vitro. But HHT has more strong anti-inflammatory effects than that of FHHT in broad outlines.
Objective : Recently interest of fermented herb medicine has increased in Oriental medicine. Herb medicine fermented in a proper condition resultingly has better or new virtue by microbe. This study was designed to compare the anti-inflammatory effects of herbal decoction and fermented herbal decoction in Hwangnyeonhaedok-tang (Huanglian fiedu-tang; HHT). Methods : The effects of HHT and FHHT on anti-inflammation were measured by production of NO and pro-inflammatory cytokine productions including TNF-${\alpha}$ and IL-1${\beta}$, IL-6 in LPS induced RAW 264.7 cells. Results : 1. Cell viability in three doses of HHT extract (0.01, 0.05 and 0.10 mg/ml) and two doses of FHHT extract (0.01, 0.05 mg/ml) was more than 70％ and 80％ each. 2. In RAW 264.7 cells, LPS displayed significant stimulatory effects on the production of NO. However, both HHT, FHHT showed significant inhibitory effects on the production of NO. 3. Pre-treatment by HHT in a various concentrations (0.01, 0.05, 0.10, 0.50mg/ml) reduced the elevated production of TNF-${\alpha}$, IL-1${\beta}$, IL-1${\beta}$ mRNA, IL-6 mRNA. More than 0.05mg/ml concentrations of HHT reduced the production of IL-6. And TNF-${\alpha}$, IL-1${\beta}$ level of mouse serum reduced in a various dose(0.1, 0.5, 1.0g/kg). 4. Pre-treatment by FHHT in a various concentrations (0.01, 0.05, 0.10, 0.50mg/ml) reduced the elevated production of TNF-${\alpha}$. More than 0.05mg/ml concentrations of FHHT reduced the expression of TNF-${\alpha}$ mRNA. 0.1, 0.50mg/ml concentrations of FHHT reduced the production of IL-6. And IL-1${\beta}$ level of mouse serum reduced in a various dose(0.1, 0.5, 1.0g/kg). Conclusions : These results indicated that both HHT and FHHT could have anti-inflammatory capacity by inhibiting the production of NO and cytokines in vitro. But HHT has more strong anti-inflammatory effects than that of FHHT in broad outlines.
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제안 방법
24시간 동안 배양한 뒤, 세포 상층액 따서 96-well plate에 loading하였다. 100 ㎕의 그리스 시약을 첨가하고, 그 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 스펙트로 포토메터 (MD, U.
5ｇ/㎏, 1 ｇ/㎏로 경구투여 하였다. 5일째 되는 날 경구 투여 후, LPS를 복강 투여하였다. 3시간 후에 마우스로부터 혈액을 채취하였다.
Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/㎖)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다. ELISA는 BD pharmingen (USA)에서 Mouse ELISA kit for IL-1beta, IL-6, TNF-alpha를 구입하여 시행하였다.
HHT and FHHT were administered to rats at an oral dose of 0.1, 0.5 1.0 g/㎏/day for 5 days. On the 5th day, LPS was injected after oral administration.
HHT 및 FHHT의 세포독성에 관해 알아보기 위하여 RAW 264.7cell에서 HHT와 FHHT를 농도 의존적으로 처리하여 24시간 후에 MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다. HHT처리군에서는 0.
HHT 및 FHHT의 항염효과에 대한 조사를 위해 먼저 RAW 264.7cell에서 LPS에 의한 NO생성의 영향을 조사하였다. HHT와 FHHT를 다양한 농도로 전 처리하고, LPS로 처리한 후, 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정하였다.
7cell에서 LPS에 의한 NO생성의 영향을 조사하였다. HHT와 FHHT를 다양한 농도로 전 처리하고, LPS로 처리한 후, 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정하였다. LPS로 자극한 군에서는 대조군에 비하여 모두 NO 증가가 나타났다.
LPS (500ng/㎖)로 RAW 264.7 cell을 자극하기 전 HHT 및 FHHT 추출물을 1시간동안 전 처리하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/㎖)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 × 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 HHT 및 FHHT을 처리하였다.
마우스에 HHT와 FHHT를 5일간 0.1 ｇ/㎏, 0.5ｇ/㎏, 1 ｇ/㎏로 경구투여 하였다. 5일째 되는 날 경구 투여 후, LPS를 복강 투여하였다.
이에 본 연구에서는 황련해독탕 및 발효황련해독탕의 항염증효과를 비교하기 위하여 NO생성 억제효과 및 전염증성 사이토카인으로 알려진 IL-1β, TNF-α, IL-6 생성 억제 정도를 단백질, mRNA 수준에서 측정, 비교하였으며 마우스에서 serum level을 측정하였다.
저자는 황련해독탕(HHT)과 발효한 황련해독탕 (FHHT)의 항염증효과를 비교하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS의 자극에 따른 NO와 전염증성 사이토카인 (TNF-α,IL-1β, IL-6)의 발현에 대한 실험 및 마우스의 복강에 LPS 투여에 따른 마우스 serum cytokine (TNF-α,IL-1β, IL-6) level 조사를 수행하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
황련해독탕은 항염증, 항알레르기 효과가 알려져 있는 처방으로 임상에서 널리 활용되고 있는 방제로, 저자는 황련해독탕과 발효한 황련해독탕의 항염증효과를 비교하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 cell에서 LPS의 자극에 따른 NO와 전염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α, IL-6)의 발현에 대한 실험 및 마우스의 복강 내 LPS 투여에 따른 마우스 serum cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) level 조사를 수행하였다.
대상 데이터
Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning(Rochester,USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 chloroform, Tri-zol, sodium dodesyl sulfate(SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA(St.
Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning(Rochester,USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 chloroform, Tri-zol, sodium dodesyl sulfate(SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA(St. Louis,USA)사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospho-ERK1/2, anti-phospho -p38, anti-Ik-Ba, anti-phospho-JNK는 Cell signaling사에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.
청원발효한약연구소에 의뢰하여 UBO복합균주를 이용하여 제조하였다.
황련해독탕(HHT)에 사용되는 한약재는 동성약업사에서 황련, 황금, 황백, 치자를 구입하여 사용하였다.<방약합편>의 용량을 근거로 黃連解毒湯 1첩을 아래 Table 1과 같이 제조하였다(Table 1).
데이터처리
모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean±S.D. 로 나타나었으며, 실험결과에 대한 통계처리는 One way ANOVA 였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
The cells were treated with HHT and FHHT water extract as indicated concentration for 1h, and then incubated with or without 500 ng/㎖ LPS for 24 h. NO release was measured by the method of Griess.*P ⟨ 0.
7 cell을 자극하기 전 HHT 및 FHHT 추출물을 1시간동안 전 처리하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/㎖)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다. ELISA는 BD pharmingen (USA)에서 Mouse ELISA kit for IL-1beta, IL-6, TNF-alpha를 구입하여 시행하였다.
RAW 264.7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 × 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 HHT 및 FHHT을 처리하였다.
그리고 침전물에 DEPC 처리한 증류수를 15 ㎕ 씩 넣어 RNA를 용해시키고 정량한다. 추출한 RNA는 reverse transcriptase PCR 의 protocol을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 간단히 기술하자면 역전사 반응을 위하여 total RNA (1 ㎎) 에 0.
본 연구에서 LPS로 자극한 군에서는 대조군에 비하여 모두 NO 증가가 나타났다. HHT 처치군에서는 전 농도(0.01 0.05 0.10 0.50 ㎎/㎖)에서 모두 NO생성 감소가 유의하게 나타났으며, FHHT 처치군에서도 전 농도(0.01 0.05 0.10 0.50 ㎎/㎖)에서 모두 NO생성 감소가 나타났으며 0.05㎎/㎖이상 농도에서는 통계적 유의성이 있었다.
HTT 복용 마우스의 serum TNF-α level은 다양한 dose(0.1 0.5 1.0g/㎏)에서 모두 농도 감소를 나타내었으며, FHTT 복용 마우스의 serum TNF-α level은 농도증가를 나타냈다.
IL-6는 면역 반응, 염증 및 조혈작용, 신경계에 관련된 다기능의 사이토카인으로 과잉 생산 시 류마티스 관절염, systemic-onset juvenile idiopathic arthritis (soJIA), Castleman's disease 등 염증성 질환이 발생한다. HTT 처치군에서는 0.05㎎/㎖이상의 농도에서 IL-6의 분비가 감소하였으며, FHHT 처치군에서는 0.10, 0.50㎎/㎖ 농도에서 IL-6의 생성 감소가 유의하게 나타났다. HTT 처치군에서는 다양한 농도에서 (0.
HTT복용 마우스의 serum TNF-α, IL-1β level은 다양한 dose(0.1, 0.5, 1.0g/㎏)에서 감소가 있었다.
대조군의 IL-1β mRNA 발현을 1±0.1로 하였을 때 LPS처리군에서 5.56±1배 발현이 증가하였으며 HHT 0.01㎎/㎖의 농도에서는 5.36±1.1, 0.05㎎/㎖에서는 3.94±0.5, 0.10㎎/㎖에서는 2.1±0.41, 0.50㎎/㎖에서는 1.2±0.2로 농도에 따라 IL-1β mRNA 발현이 감소하였으며 0.05㎎/㎖ 이상의 농도에서 통계적 유의성이 있었다.
대조군의 IL-6 mRNA 발현을 1±0.2로 하였을 때 LPS처리군에서 IL-6 mRNA 발현이 402±23배 증가하였으며 HTT 0.01㎎/㎖의 농도에서 361±21, 0.05㎎/㎖에서는 375±14, 0.10㎎/㎖에서는 308±10, 0.50㎎/㎖에서는 238±11로 농도에 따라 IL-6 mRNA 발현이 감소하였으며 전 농도에서 통계적 유의성이 있었다.
또한 HHT군에서는 LPS 단독처리 시 18.507±0.479μⅯ의 NO생성이 측정되었으며, HHT 0.01㎎/㎖ 농도로 전처리 시17.36±2.543μⅯ, 0.05㎎/㎖에서 17.51±3.949μⅯ, 0.1㎎/㎖에서 13.72±0.403μⅯ, 0.5㎎/㎖에서 4.81±0.413μⅯ으로 전 농도에서 모두 NO생성 감소가 유의하게 나타났으며, FHHT군에서는 LPS 단독처리 시 20.02±0.234μⅯ NO생성이 측정되었으며, FHHT 0.01㎎/㎖ 농도로 전처리 시 19.83±0.239μⅯ, 0.05㎎/㎖에서 18.10±0.267μⅯ, 0.1㎎/㎖에서 15.68±0.79μⅯ, 0.5㎎/㎖에서 6.89±0.165μⅯ으로 전 농도에서 모두 NO생성 감소가 나타났으며 0.05㎎/㎖이상 농도에서는 통계적 유의성이 있었다(Fig. 2).
본 연구에서 HTT, FHHT를 다양한 농도(0.01 0.05 0.10 0.50㎎/㎖)로 전 처치하였을 때 모두 TNF-α 생성이 억제 되었으며 감소폭은 FHHT 처리군이 더 넓게 나타났다.
본 연구에서 LPS로 자극한 군에서는 대조군에 비하여 모두 NO 증가가 나타났다. HHT 처치군에서는 전 농도(0.
본 연구에서 먼저 HHT 및 FHHT의 세포 독성을 알아보기 위하여 시행한 MTT assay 에서 HHT 처리군에서는 0.01 0.05 0.1㎎/㎖ 농도에서 70％ 이상의 세포생존율을 나타냈으며, FHHT처리군에서는 0.01, 0.05 ㎎/㎖ 농도에서 80％ 이상의 세포생존율을 나타냈다.
이러한 결과로 보아, HHT 및 FHHT는 염증성질환의 치료에 모두 응용가능하나, 대체적으로 HHT의 항염증효과가 더 뛰어나다고 할 수 있다.
종합하여 보면 HHT는 NO, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-1β mRNA, IL-6 mRNA 및 마우스의 serum IL-1β level 에서 생성억제를 나타냈으며, FHHT는 NO, TNF-α, TNF-α mRNA, 마우스의 serum IL-1β level에서 생성억제를 나타내었으므로 ,HHT 및 FHHT 모두 염증성 질환의 치료에 응용 가능할 것으로 보이며, 대체적으로 HHT이 FHHT 보다 항염증 효과가 우수한 것으로 생각된다.
후속연구
향후 혼합균주가 아닌 단독 균주별 연구 및 다양한 균주선택에 따른 추가 연구가 필요하리라 사료된다. 또한 이13)의 방풍통성산 발효에 대한 연구와 같이 항염증 효과 뿐 아니라, 맛의 증진, 소화의 용이에 관한 연구 및 항산화, 미백, 체지방 축적 감소효과 등에 관한 연구도 진행되어야 할 것이라 생각된다.
향후 혼합균주가 아닌 단독 균주별 연구 및 다양한 균주선택에 따른 추가 연구가 필요하리라 사료된다. 또한 이13)의 방풍통성산 발효에 대한 연구와 같이 항염증 효과 뿐 아니라, 맛의 증진, 소화의 용이에 관한 연구 및 항산화, 미백, 체지방 축적 감소효과 등에 관한 연구도 진행되어야 할 것이라 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
黃連解毒湯에 관한 연구는 무엇이 있는가?
황련해독탕에 관한 연구로는 혈압강하작용18), 해독작용19), 신경세포 보호효과20), 저산소증에 대한 심근세포 보호효과21), 암세포 증식 억제 효과22), 스트레스로 인한 우울증 예방효과23), 중성지질 축적 억제효과24) 등이 있다. 또한 접촉성 피부염25), 알레르기 천식26), 궤양성 대장염27), 아토피 피부염28)과 관련하여 항염증효과29), 항알레르기 효과가 알려져 있다.
특히 김30)은 황련해독탕 물 추출물의 항염증효과에 대한 연구를 발표하였다.
발효 한약이란 무엇인가?
발효 한약이란 한약을 적당한 조건에서 발효시켜 원래의 性과 효능이 효소 등 미생물에 의해 변화되어 증강되거나 새로운 효능이 생겨 임상에서 변증론으로 다스릴 때 치료에 사용되는 한약을 말한다2).
발효가 이용된 분야는 무엇인가?
대사경로들은 혐기적 대사인 발효(fermentation)와 호기적 대사인 호흡(respiration)의 두 그룹으로 나뉘어 진다1). 발효는 넓은 뜻으로는 미생물에 의한 유용한 물질생산으로 볼 수 있는데, 이 현상은 예로부터 알코올음료, 빵 그 밖의 소위 양조제품 제조에 이용되어 왔다.
박수현. 黃連解毒湯과 乾薑附子湯이 Lipopolysaccharide의 뇌실 주입으로 유발된 생쥐의 혈중 IL-6와 TNF-a 변화에 미치는 영향. 경원대학교 대학원. 석사논문. 2007.
김대희. 黃連解毒湯 물추출물의 항염증효과. 대구한의대학교 대학원. 박사논문. 2009.
김호철. 한약리학. 서울:집문당. 2001:130-2, 134-5, 138-9.
이중근. 황금의 진통 및 항염증효과에 대한 연구. 경원대학교 대학원. 석사논문. 2008.
윤광로. 황련의 항염증효과. 상지대학교 대학원. 석사논문. 2009.
장종화. 黃柏 물 추출물의 항염효능에 관한 연구. 경원대학교 대학원. 박사논문. 2010.
고광묵. 치자 엑스의 가수분해에 의한 피부투과 및 항염효과. 우석대학교 대학원. 박사논문. 2002.
박영민. Anti-inflammatory Effects of Crocin,a Major Component of Chunghyul-dan,and Its Metabolite Crocetin in Rat Brain Microglial Cells. 경희대학교 대학원. 박사논문. 2010.
권종훈. 梔子抽出物이 DNCB로 誘導된 생쥐의 Allergy性 接觸皮膚炎에 미치는 影響. 동국대학교 대학원. 석사논문. 1998.
Kim, Hyun-Sung Kim, Jin-Yong Park, Myeong-Soo Zheng, Hua Ji, Geun-Eog. Cloning and Expression of $\beta$ -Glucuronidase from Lactobacillus brevis in E. coli and Application in Bioconversion of Baicalin and Wogonoside. Journal of microbiology and biotechnology. 2009;19(12):1650-5.
Kobayashi Y. The regulatory role of nitric oxide in proinflammatory cytokine expression during the induction and resolution of inflammation. J Leukoc Biol.. 2010. (Epub ahead of print).
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