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문제 정의
- 지속적이고 반복된 염증은 급성 간질환을 간섬유화, 간경화 및 간암을 포함한 만성 간질환으로 이행시키는 핵심 병리기전의 하나이므로, 질병 초기에 수반되는 염증 반응의 조절은 다양한 급만성 간질환을 제어하는 핵심적인 치료법의 하나로 인식되고 있다1). 따라서, 본 연구에서는 lipopolysaccharide (LPS)로 활성화된 RAW 264.7 세포를 이용하여 淫羊藿 물 추출물의 염증 억제 효능을 연구하고 이와 관련된 약리 기전을 규명하고자 하였다.
- 1B). EWE에 의한 NO 생성 억제가 NO 생성에 관여하는 iNOS의 전사조절을 통하여 일어나는 현상인지 연구하기 위하여 iNOS 단백질 및 mRNA를 immunoblot과 real-time PCR 분석에 의해 확인하였다. LPS는 iNOS 단백질과 mRNA를 무처치 대조세포와 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다.
- . EWE가 prostaglandin 생합성에 미치는 영향을 연구하기 위하여 prostaglandin 생합성 과정의 율속 단계인 COX-2 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 이를 위해 30-100 ㎍/㎖의 EWE를 1시간 동안 전처치한 후, 1 ㎍/㎖의 LPS를 18시간 (COX-2 단백질) 또는 6시간 (COX-2 mRNA)를 처치하였다.
- 따라서 이들 선행 연구들은 대식세포의 활성을 淫羊藿 또는 특정 생리 활성 성분들이 조절할 수 있는 가능성을 제시하나, 한의학에서 활용 가능성이 높은 淫羊藿 전탕 물추출물이 직접적으로 대식세포의 활성을 조절할 수 있는지 여부와 이와 관련된 약리 기전과 활성성분에 대한 연구는 상대적으로 부족하였다. 따라서 본 연구에서는 淫羊藿 물 추출물이 마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 염증 방응의 활성화에 미치는 영향과 이와 관련된 약리 기전을 연구하고자 하였다.
제안 방법
- 80% 정도 성장한 세포는 8시간 동안 FBS가 없는 Dulbecco's modified Eagle's medium에서 추가 배양한 후, 10-100 ug/mL의 EWE를 1시간 동안 전처치한 후 1 ㎍/㎖의 LPS를 실험 목적에 따라 15분에서 18시간 동안 처치하였다.
- 처치가 완료된 세포로부터 회수한 배양액과 동량의 Griess reagent를 첨가하여 10분간 실온에서 반응시킨 후, microplate reader (Infinite M200 pro, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양액 중 유리된 NO의 양은 무처치 대조세포에서 측정된 흡광도와의 비를 계산하여 상대 정량하였다.
- 동량의 단백질에 대한 확인은 β-actin (전세포 추출액) 또는 lamin A/C (핵 분획 추출액)에 대한 immunoblot 분석을 통하여 검증하였으며, ImageJ 프로그램(http://imagej.nih.gov/ij)을 이용하여 단백질의 상대적 발현량을 정량하였다.
- IL-6, IL-1β 및 TNF-α는 OptEIATM kit (BD Bioscience) 를 이용하여 제조사의 방법에 따라 분석하였으며, 재조합 cytokine 단백질들의 표준검량곡선을 이용하여 배양액 내 유리된 cytokine의 절대 농도를 측정하였다.
- Real-time PCR 분석을 위한 primer로 iNOS (forward, 5’-GACAAGCTGCATGTGACATC-3’; backward, 5’-GCTGGTAGGTTCCTGTTGTT-3’), COX-2 (forward, 5’-TCCAGATCACATTTGATTGA-3’; backward, 5’-TCTTTGACTGTGGGAGGATA-3’), IL-6 (forward, 5’-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3’; backward, 5’-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3’), IL-1β (forward, 5’-ATGGCAACTGTTCCTGAACT-3’; backward, 5’-CAGGACAGGTATAGATTCTT-3’), TNF-α (forward, 5’-ATGAGCACAGAAAGCATGAT-3’; backward, 5’-TACAGGCTTGTCACTCGAAT-3’), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)(forward, 5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’; backward, 5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’)를 Bioneer에서 합성하였다.
- 처치가 완료된 세포에서 배양액을 제거한 후, 1 ㎎/㎖의 MTT 용액을 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응으로 생성된 formazan을 dimethylsulfoxide로 용해하여 570 ㎚에서 microplate reader (Infinite M200 pro)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 무처치 대조세포에서 측정된 흡광도와의 비를 백분율로 계산하여 나타내었다.
- 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에서 분자량에 따라 분리한 후, nitrocellulose membrane으로 전이하여 1차 항체 및 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. Membrane을 enhanced chemiluminesece detection reagent (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)와 반응시켜 관심 단백질의 발현 정도를 Imager 600 (Amersham Biosciences)에서 관찰하였다. 동량의 단백질에 대한 확인은 β-actin (전세포 추출액) 또는 lamin A/C (핵 분획 추출액)에 대한 immunoblot 분석을 통하여 검증하였으며, ImageJ 프로그램(http://imagej.
- Total RNA는 처치된 세포로부터 Tri-solution (Bioscience technology, Daegu, Korea)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. cDNA는 total RNA, d(T)16 프라이머와 Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 역전사하여 제조하였으며, real-time PCR은 SYBR green premix (Takara, Shiga, Japan)와 CFX96 Thermal cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. Real-time PCR 분석을 위한 primer로 iNOS (forward, 5’-GACAAGCTGCATGTGACATC-3’; backward, 5’-GCTGGTAGGTTCCTGTTGTT-3’), COX-2 (forward, 5’-TCCAGATCACATTTGATTGA-3’; backward, 5’-TCTTTGACTGTGGGAGGATA-3’), IL-6 (forward, 5’-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3’; backward, 5’-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3’), IL-1β (forward, 5’-ATGGCAACTGTTCCTGAACT-3’; backward, 5’-CAGGACAGGTATAGATTCTT-3’), TNF-α (forward, 5’-ATGAGCACAGAAAGCATGAT-3’; backward, 5’-TACAGGCTTGTCACTCGAAT-3’), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)(forward, 5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’; backward, 5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’)를 Bioneer에서 합성하였다.
- 각 유전자의 발현량은 GAPDH 유전자의 발현량을 기준으로 2 -DDCT법에 의해 정량하였으며14), LPS 단독 처치 세포의 상대 발현량을 100%로 계산하였다. 또한 PCR 산물의 특이성은 melting curve 분석으로 확인하였다.
- RAW 264.7 세포에서 EWE가 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 10-100 ㎍/㎖의 EWE를 1시간 동안 전처치한 후, 1 ㎍/㎖의 LPS를 18시간 동안 처치하였다. 처치가 완료된 세포의 배양액과 Griess reagent를 반응시켜 배양액 내 유리된 NO를 측정한 결과, LPS는 무처치 대조세포와 비교하여 NO 생성을 2.
- 1A). EWE에 의한 NO 생성 억제가 EWE의 세포 독성에 기인한 것이 아님을 확인하기 위하여 처치가 완료된 세포의 세포 생존율을 측정하였다. 선행 연구결과와 유사하게 18시간 동안의 LPS 처치는 RAW 264.
- EWE가 prostaglandin 생합성에 미치는 영향을 연구하기 위하여 prostaglandin 생합성 과정의 율속 단계인 COX-2 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 이를 위해 30-100 ㎍/㎖의 EWE를 1시간 동안 전처치한 후, 1 ㎍/㎖의 LPS를 18시간 (COX-2 단백질) 또는 6시간 (COX-2 mRNA)를 처치하였다. RAW 264.
- 2B)를 무처치 대조세포와 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다. 30와 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치는 LPS에 의해 증가한 COX-2 단백질과 mRNA를 감소하는 경향을 나타내었으며, 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 COX-2 단백질과 mRNA의 감소만이 LPS 처치 세포와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 100 ㎍/㎖의 EWE 단독 처치는 무처치 대조세포와 비교하여 COX-2 단백질과 mRNA 양을 변화시키지 않았다 (Fig.
- . EWE가 전염증성 cytokine 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 EWE가 전처치된 RAW 264.7 세포에 LPS를 18시간 (단백질) 또는 6시간 (mRNA) 동안 처치하였다. 100 ㎍/㎖의 EWE 단독 처치는 전염증성 cytokine의 유리와 mRNA를 변화시키지 못하였고, LPS 처치는 세포 배양액 중 전염증성 cytokine의 유리 (Fig.
- EWE가 NF-κB 신호 분자에 미치는 영향을 알아보기 위하여 immunoblot 분석을 수행하였다.
- 선행 연구를 통하여 보고한 EWE 내 함유된 3종의 지표성분 icariin, icaritin, quercetin이 EWE에 의한 염증 억제 효능에 기여하는지 여부를 확인하기 위하여, 3-30 μM의 지표성분을 1시간 동안 전처치한 후 LPS를 처치하여 세포 배양액에 유리된 NO를 측정하였다9).
- 7 세포에서 LPS에 의하여 증가된 NO 생성을 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었으나, 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 NO 생성의 감소만이 LPS 처치세포와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 또한 100 ㎍/㎖의 EWE에 의한 NO 생성의 억제가 EWE의 세포 독성이나 iNOS 단백질 차원의 효소 활성 저해가 아닌 iNOS의 전사 조절에 기인함을 MTT 분석, immunoblot 분석 및 real-time PCR 분석을 통해 확인하였다. 본 연구에서 100 ㎍/㎖의 농도에서 EWE가 iNOS 이외에 LPS에 의하여 증가한 COX-2, IL-6, IL-1β와 TNF-α의 전사를 억제하였다.
대상 데이터
- Anti-phospho-inhibitory κBα (IκBα ), Anti-IκBα, anti-phospho-p38, anti-p38, anti-phospho-extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2, anti-ERK1/2, anti-phospho-c-Jun N-terminal kinase (JNK) 1/2, anti-JNK1/2 항체와 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 마우스 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 10% FBS (Gibco, Rockville, MD, USA)와 1% penicillin-streptomycin (Gibco)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)를 이용하여 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다.
- Griess reagent, LPS (Escherichia coli 055:B5), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), icariin, icaritin, quercetin, anti-β-actin 항체와 그 외 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Anti-NF-κB (p65) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santacruz, CA, USA)에서 구입하였다.
- Anti-inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 anti-cyclooxygenase (COX)-2 항체는 BD Bioscience (San Diego, CA, USA)와 Cayman (Ann Arbor, MI, USA)에서 각각 구입하였다. Anti-phospho-inhibitory κBα (IκBα ), Anti-IκBα, anti-phospho-p38, anti-p38, anti-phospho-extracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2, anti-ERK1/2, anti-phospho-c-Jun N-terminal kinase (JNK) 1/2, anti-JNK1/2 항체와 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 淫羊藿 (나눔제약; 원산지, 중국; 규격, 대한약전; 수입원, 미륭생약; 품질검사연원일, 2011년 7월 18일; 품질검사기관, 나눔제약(주)부설실험실; 제조번호, NA1101030101)은 대원약업사 (Daegu, Korea)에서 구입하였으며, 선행 보고된 방법에 따라 淫羊藿 100 g에 1.2 L의 물을 넣어 3시간 동안 전탕 추출한 후, 여과, 농축 및 동결 건조하여 淫羊藿 물 추출물 (Epimedii Herba water extract, EWE)을 제조하여 -20℃에 보관하며 실험에 이용하였다9). EWE의 최종수율은 11.
데이터처리
- 모든 데이터는 3회 반복 시행 후 mean ± SD로 표기하였으며, 각 그룹간 통계적 유의성은 one way analysis of variance로 분석한 후, 등분산 가정의 성립 여부에 따라 Tukey’s honestly significant difference 또는 Dunnett T3 분석으로 사후 검정하였다.
이론/모형
- NF-κB-DNA 결합능 분석은 NF-κB transcription factor assay kit (Cayman Chemical)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 처치가 완료된 RAW 264.7 세포로부터 전세포 추출액 및 핵 분획 추출액은 기 확립된 방법에 따라 제조하였으며9), 추출액 내 총 단백질 함량은 bicinchoninic acid assay (Thermo-Fischer Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 정량하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에서 분자량에 따라 분리한 후, nitrocellulose membrane으로 전이하여 1차 항체 및 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체와 반응시켰다.
- Total RNA는 처치된 세포로부터 Tri-solution (Bioscience technology, Daegu, Korea)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. cDNA는 total RNA, d(T)16 프라이머와 Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 역전사하여 제조하였으며, real-time PCR은 SYBR green premix (Takara, Shiga, Japan)와 CFX96 Thermal cycler (BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
- Real-time PCR 분석을 위한 primer로 iNOS (forward, 5’-GACAAGCTGCATGTGACATC-3’; backward, 5’-GCTGGTAGGTTCCTGTTGTT-3’), COX-2 (forward, 5’-TCCAGATCACATTTGATTGA-3’; backward, 5’-TCTTTGACTGTGGGAGGATA-3’), IL-6 (forward, 5’-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3’; backward, 5’-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3’), IL-1β (forward, 5’-ATGGCAACTGTTCCTGAACT-3’; backward, 5’-CAGGACAGGTATAGATTCTT-3’), TNF-α (forward, 5’-ATGAGCACAGAAAGCATGAT-3’; backward, 5’-TACAGGCTTGTCACTCGAAT-3’), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)(forward, 5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’; backward, 5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’)를 Bioneer에서 합성하였다. 각 유전자의 발현량은 GAPDH 유전자의 발현량을 기준으로 2 -DDCT법에 의해 정량하였으며14), LPS 단독 처치 세포의 상대 발현량을 100%로 계산하였다. 또한 PCR 산물의 특이성은 melting curve 분석으로 확인하였다.
성능/효과
- 처치가 완료된 세포의 배양액과 Griess reagent를 반응시켜 배양액 내 유리된 NO를 측정한 결과, LPS는 무처치 대조세포와 비교하여 NO 생성을 2.72 ± 0.09배 통계적으로 유의하게 증가시켰다.
- 09배 통계적으로 유의하게 증가시켰다. 그러나 10-100 ㎍/㎖의 EWE의 전처치는 LPS에 의해 증가한 NO 생성을 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었으며, 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 NO 생성은 LPS 처치 세포와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 10, 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE의 전처치에 의한 NO 생성은 각각 2.
- 10, 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 세포 생존율은 무처치 대조세포와 비교하여 66.30 ± 2.60, 65.06 ± 3.83, 및 64.83 ± 1.60%였으며, LPS와 비교하여 통계적으로 유의한 변화가 관찰되지 않았다 (Fig. 1B).
- 1C and 1D). 이상의 결과는 100 ㎍/㎖의 EWE가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 iNOS mRNA의 전사 조절을 통하여 NO 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
- 2). 이상의 결과는 100 ㎍/㎖의 EWE가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 COX-2 mRNA의 전사 조절을 통하여 prostaglandin 생성을 억제할수 있음을 시사한다.
- 7 세포에 LPS를 18시간 (단백질) 또는 6시간 (mRNA) 동안 처치하였다. 100 ㎍/㎖의 EWE 단독 처치는 전염증성 cytokine의 유리와 mRNA를 변화시키지 못하였고, LPS 처치는 세포 배양액 중 전염증성 cytokine의 유리 (Fig. 3A)와 세포 내 전염증성 cytokine mRNA의 전사 (Fig. 3B)를 모두 통계적으로 유의하게 증가시켰다. 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치는 LPS에 의해 증가한 전염증성 cytokine의 유리와 mRNA 생성을 감소시키는 경향을 나타내었다.
- 3B)를 모두 통계적으로 유의하게 증가시켰다. 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치는 LPS에 의해 증가한 전염증성 cytokine의 유리와 mRNA 생성을 감소시키는 경향을 나타내었다. 배양액 내 유리된 IL-1β의 경우, LPS 단독 처치세포와 비교시 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 변화가 모두 통계적으로 유의하였으며, 나머지 전염증성 cytokine의 경우 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 변화만이 LPS 단독 처치세포와 비교하여 통계적으로 유의하였다 (Fig.
- RAW 264.7 세포에서 15분 동안의 LPS 자극은 IκBα의 인산화를 무처치 대조세포와 비교하여 3.74 ± 0.45배 통계적으로 유의하게 증가시켰으며, 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE의 전처치는 LPS에 의해 증가한 IκBα의 인산화를 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었다.
- 더불어 EWE는 LPS에 의하여 증가되는 IκBα의 분해를 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었으며, 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 IκBα의 발현은 LPS 처치 세포와 비교하여 통계적으로 유의하였다 (Fig. 4B).
- LPS는 핵 분획 내 NF-κB (p65 subunit)의 발현을 무처치 대조세포와 비교하여 1.84 ± 0.50배로 통계적으로 유의하게 증가시켰으며, 30 및 100 ㎍/㎖의 EWE의 전처치는 무처치 대조세포와 비교하여 각각 0.66 ± 0.14 및 0.46 ± 0.26배로서 핵 분획 내 NF-κB (p65 subunit)의 발현을 통계적으로 유의하게 감소시켰다 (Fig. 4C).
- 또한 LPS는 NF-κB response element에 대한 NF-κB의 결합을 통계적으로 유의하게 증가시켰으나, 30 및 100 ㎍/㎖ EWE의 전처치는 NF-κB 특이적 DNA 결합능을 통계적으로 유의하게 억제하였다 (Fig. 4D).
- 이상의 결과는 EWE가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의하여 활성화된 NF-κB 관련 신호 분자를 억제할 수 있음을 나타낸다.
- RAW 264.7 세포에서 3-30 μM의 icariin, icaritin 또는 quercetin의 전처치는 LPS에 의하여 증가한 NO 생성을 통계적으로 유의하게 억제하였다 (Fig. 6A).
- 5). 이상의 결과는 MAPK 신호와 독립적으로 EWE가 염증 억제 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다.
- 6B). 따라서, 이상의 연구결과는 EWE에 의한 염증 억제 효능에 3종의 지표 성분이 기여함을 나타낸다.
- 본 연구에서 100 ㎍/㎖의 농도에서 EWE가 iNOS 이외에 LPS에 의하여 증가한 COX-2, IL-6, IL-1β와 TNF-α의 전사를 억제하였다.
- 본 연구에 사용된 淫羊藿 물추출물은 본 연구실의 선행 연구에서 추출, 보관된 동일한 시료를 사용하였으며9), 선행연구에서 ultra-performance liquid chromatography 분석을 통하여 EWE에 icariin, icaritin 및 quercetin이 각각 83.64 ± 4.17, 20.41 ± 0.03 및 1.83 ± 0.08 ppm 함유되어 있음을 확인하였으며 (data not shown), icaritin과 quercetin이 아라키돈산과 철에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 nuclear factor erythroid 2-related factor 2의 활성화를 통하여 세포를 보호하는데 기여함을 규명하였다9).
- 본 연구에서도 LPS가 IκBα의 인산화, IκBα의 분해, NF-κB의 핵 내 축적 및 NF-κB의 DNA 결합능을 증가시켰으며, 100 ㎍/㎖의 농도에서 EWE의 전처치는 LPS에 의한 NF-κB 관련 신호 분자들의 활성화를 모두 억제하였다.
- 더불어 비교적 간단한 실험에 의하여 NO 생성 유무를 분석할 수 있어, 대식세포를 활용한 다양한 연구에서 후보소재의 염증 제어 유무를 검색하는데 활용되어 왔다 14,15). 본 연구에서도 淫羊藿 물 추출물, EWE의 전처치는 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의하여 증가된 NO 생성을 농도 의존적으로 억제하는 경향을 나타내었으나, 100 ㎍/㎖의 EWE 전처치에 의한 NO 생성의 감소만이 LPS 처치세포와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 또한 100 ㎍/㎖의 EWE에 의한 NO 생성의 억제가 EWE의 세포 독성이나 iNOS 단백질 차원의 효소 활성 저해가 아닌 iNOS의 전사 조절에 기인함을 MTT 분석, immunoblot 분석 및 real-time PCR 분석을 통해 확인하였다.
- 이와 같은 결과의 차이는 淫羊藿의 산지, 추출물 제조법에 따른 활성성 분들의 용해도, LPS 농도 및 처치 시간과 전염증성 cytokine 정량법이 상이하여 다른 결과를 도출한 것으로 추정되며 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다. 이상의 결과는 EWE가 RAW 264.7 세포에서 다양한 염증 매개 인자들의 생성에 관여하는 공통 전사인자의 조절을 통하여 염증 억제 효능이 있음을 나타낸다.
- 또한 LPS는 TLR4를 통한 신호 전달 과정을 통하여 MAPK kinase kinase인 TAK1을 활성화시켜 MAPK의 인산화를 촉진하고, MAPK 의존적 전사인자들의 활성화 (예, activating protein-1) 를 통하여 염증 반응을 촉진한다3). 그러나, 본 연구에서 EWE가 MAPK 신호 분자의 인산화에 미치는 영향을 연구한 결과, EWE의 전처치는 LPS에 의하여 증가한 p38, ERK1/2, JNK1/2의 인산화를 변화시키지 못하였다. 따라서 EWE는 IKK의 활성화 단계를 조절하여 NF-κB 신호 분자만을 선택적으로 억제하였을 것으로 추정된다.
- 본 연구에서도 EWE에 함유된 3종의 지표 성분의 염증 억제 효능을 연구한 결과, 3-30 μM의 지표성분의 전처치가 LPS에 의하여 증가한 NO 생성을 통계적으로 유의하게 억제할 수 있음을 규명하였다.
- 4. RAW 264.7 세포에서 淫羊藿 물 추출물의 전처치는 LPS에 의한 IκBα의 인산화, IκBα의 분해, NF-κB의핵 내 축적과 NF-κB의 DNA 결합을 억제하였다.
- 3. LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 淫羊藿 물 추출물의 전처치는 IL-6, IL-1β , 및 TNF-α의 전사를 억제하였다.
- 1. LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 淫羊藿 물 추출물의 전처치는 iNOS의 전사 조절을 통하여 NO 생성을 억제하였다.
- 2. LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 淫羊藿 물 추출물의 전처치는 COX-2의 전사를 억제하였다.
- 5. 淫羊藿의 지표 성분인 icariin, icaritin, quercetin은 LPS에 의한 NO 생성을 억제하였다.
후속연구
- 그러나, 육 (2009)은 환류추출에 의해 제조한 淫羊藿 물 추출물이 LPS에 의하여 유도된 NO, IL-1β의 유리를 감소시켰으나, TNF-α의 유리는 억제하지 못함을 보고하였다13). 이와 같은 결과의 차이는 淫羊藿의 산지, 추출물 제조법에 따른 활성성 분들의 용해도, LPS 농도 및 처치 시간과 전염증성 cytokine 정량법이 상이하여 다른 결과를 도출한 것으로 추정되며 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다. 이상의 결과는 EWE가 RAW 264.
- 본 연구에서도 EWE에 함유된 3종의 지표 성분의 염증 억제 효능을 연구한 결과, 3-30 μM의 지표성분의 전처치가 LPS에 의하여 증가한 NO 생성을 통계적으로 유의하게 억제할 수 있음을 규명하였다. 그러나 본 연구에서 염증 억제 효능을 나타내었던 100 ㎍/㎖의 EWE에 함유된 3종의 지표성분의 실제 농도는 매우 적으므로, EWE에 의한 염증 억제 효능은 3종의 지표성분과 선행 문헌에서 규명되었던 2-phenoxychromone, prenylflavonoid, ikarisoside A를 포함한 다양한 화합물들이 복합적으로 작용하였을 것으로 추정되며 이에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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