[논문]혼효림으로부터 셀룰로오스분해 박테리아 분리 및 효소학적 특성규명

박화랑; 오기철; 김봉규

doi:10.3839/jabc.2018.009

[국내논문] 혼효림으로부터 셀룰로오스분해 박테리아 분리 및 효소학적 특성규명
Isolation and characterization of cellulolytic bacteria, Bacillus sp. EFL1, EFL2, and EFP3 from the mixed forest 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.61 no.1, 2018년, pp.59 - 67

박화랑 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology) , 오기철 (Nakdong River Basin Environmental Office) , 김봉규 (Department of Forest Resources, Gyeongnam National University of Science and Technology)

초록
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본 연구는 경상남도 산청군 소재 경남과학기술대학교 학술림에서 채취한 토양으로부터 CMCase와 xylanase를 생산하는 3개의 Bacillus종을 분리하였다. API kit 분석과 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 3개의 균 모두 Bacillus종에 속하였으며, Bacillus sp. EFL1, EFL2, EFP3로 명명하였다. Bacillus sp. EFL1, EFL2, EFP3의 최적 생장온도는 $37^{\circ}C$였으며, CMCase와 xylanase의 활성은 배양 후 12시간에 최고에 달하였다. Bacillus sp. EFL1의 CMCase 효소활성의 최적온도는 $50^{\circ}C$, pH는 5.0이었고, xylanase 효소활성의 최적온도는 $50^{\circ}C$, pH 6.0이었다. Bacillus sp. EFL2의 CMCase활성의 최적온도는 $60^{\circ}C$, pH는 5.0이었고, xylanase 효소활성의 최적온도는 $60^{\circ}C$였고, pH 3.0-9.0까지 비교적 높은 활성을 보였다. Bacillus sp. EFP3의 CMCase의 최적온도는 $50^{\circ}C$, pH는 5.0이었고, xylanase의 최적온도는 $50^{\circ}C$, pH 4.0이었다. Bacillus sp. EFL1, EFL2, EFP3의 CMCase는 모두 온도안정성이 낮았다. 또한 Bacillus sp. EFL1과 EFP3의 xylanase 역시 온도안정성이 낮았지만, Bacillus sp. EFL2의 xylanase는 온도안정성이 높았다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to isolate the cellulolytic bacteria able to grow on LB- Carboxymethyl cellulose (CMC) agar trypan blue medium from the mixed forest and Larix leptolepis stands. Three bacterial strains with high activity against both CMC and xylan were isolated. Both API kit test and 16S rRNA gene sequence analysis revealed that the three different isolates belong to the gene Bacillus. Therefore, the isolates named as Bacillus sp. EFL1, Bacillus sp. EFL2, and Bacillus sp. EFP3. The optimum growth temperature of Bacillus sp. EFL1, EFL2, and EFP3 were $37^{\circ}C$. The optimum temperature for CMCase and xylanase from Bacillus sp. EFL1 were $50^{\circ}C$. The optimum pH of Bacillus sp. EFL1 xylanase was pH 5.0 but the optimum pH of CMCase from Bacillus sp. EFL1 was pH 6.0. The optimum temperature of CMCase and xylanase from Bacillus sp. EFL2 was $60^{\circ}C$, respectively. The optimum pH of CMCase of Bacillus sp. EFL2 was 5.0, whereas xylanase showed high activity at pH 3.0-9.0. The optimum temperature for CMCase and xylanase of Bacillus sp. EFP3 was $50^{\circ}C$. The optimum pH for CMCase and xylanse was 5.0 and 4.0, respectively. CMCases from Bacillus sp. EFL1, EFL2, and EFP3 were thermally unstable. Although xylanase from Bacillus sp. EFL1 and EFP3 showed to be thermally unstable, xylanase from Bacillus sp. EFL2 showed to be thermally stable. Therefore, Bacillus sp. EFL2 has great potential for animal feed, biofuels, and food industry applications.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 활엽수림에서 침엽수림으로 생태천이가 일어나고 있는 혼효림지대와 식재 후 약 60년이 지난 일본잎갈나무림으로 부터 우수한 섬유소 분해 효과를 보이는 Bacillus sp. EFL1, Bacillus sp. EFL2, Bacillus sp. EFP3를 분리·동정 하였다. 또한 이들 박테리아가 생산하는 Carboxymethyl cellulose(CMCase)와 xylanase의 생화학적 특성들을 조사하였다.
EFP3를 분리·동정 하였다. 또한 이들 박테리아가 생산하는 Carboxymethyl cellulose(CMCase)와 xylanase의 생화학적 특성들을 조사하였다.

제안 방법

Xylanase 또는 CMCase의 효소활성에 영향을 미치는 최적 온도의 결정은 pH활성 실험에서 CMCase 또는 Xylanase에 대한 가장 높은 활성을 보인 pH buffer에 1% (w/v) xylan 또는CMC 용액을 기질로 사용하여 20-70 ºC까지 10간격으로 각각 30분간 반응을 실시한 후 DNS법으로 효소의 활성을 측정하였다. 효소의 온도안정성 평가는 효소들을 40, 50, 70 ^oC 조건에서 0, 15, 30, 45, 60 ºC, 75분간 전 배양 후 40 ºC에서 30분간 반응한 후 남아 있는 효소의 활성을 평가하였다.

대상 데이터

당화 가능한 토양 박테리아를 분리하기 위해 경상남도 산청군 금서면 수철리에 위치한 경남과학기술대학교 학술림내 고동재부근에서 2016년 8월에 혼효림(잣나무-참나무)과 약 60년생의 낙엽송 동령림에서 각각 토양 샘플을 채집하였다. 혼효림의 상층은 리기다소나무, 잣나무가 우점하는 가운데 상수리나무가 높은 빈도로 출현하였다.

이론/모형

순수 분리한 당화 토양박테리아의 동정은 VITEK 2 시스템과 16S rRNA 유전자분석법을 사용하였다. VITEK 분석은 API 50CH Kit (bioMetrieux, Vitek, France)을 이용하여 제조사로부터 제공된 매뉴얼을 따랐다.
염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 BLASTN과 CLUSTAL W 프로그램으로 16S rRNA 유전자의 multiple sequence alignment와 염기서열간의 유사도를 분석하였다. 계통도 작성은 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 (MEGA 6.0) 프로그램에 내장되어 있는 neighbor-joining방법을 이용하였다(Tamura 등, 2013). 계통도의 신뢰도와 분지 패턴을 평가하기 위해 Bootstrap 분석 시 1,000회 반복하여 생성된 데이터를 평가 기준으로 사용하였다.
CMCase 또는 Xylanase의 측정은 환원당의 정량에 사용되는 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)법을 사용하였다(Miller 1959). CMCase 또는 Xylanase의 효소활성은 기질로 각각 CMC와 xylan를 이용하여 50 ºC에서 30분간 반응 후 유리된 환원당의 양을 측정하여 평가하였다.

성능/효과

20 ºC에서는 37 ºC에 비해 약 32%의 생장량을 보였고, 45 ºC에서는 37 ºC에 비해 약 65% 정도의 생장을 보였다. 이상의 결과로 보아 본 연구에서 분리한 미생물들은 모두 중온성 미생물에 속하였다.
3D). 이상의 결과를 종합해 보면 Bacillus sp. EFL2의 CMCase의 경우 산성과 중성에서 가장 높은 효소활성을 보였고, xylanase의 경우 넓은 범위의 pH에서 높은 효소활성을 가지는 결과를 보였다. 이러한 결과는 Bacillus sp.
4B). 이상의 결과를 종합해보면 Bacillus sp. EFL1이 생산하는 CMCase와 Xylanase 의 경우 효소의 온도안정성이 굉장히 낮은 것을 알 수 있다.

후속연구

EFL2가 생산하는 xylanase의 경우 넓은 범위의 산업적 응용가능성을 시사한다. 향후 Bacillus sp. EFL2를 이용한 미생물 토양개량제의 가능성 여부 및 xylanase 유전자의 클로닝과 생화학적 특성 규명 등을 통해 제지산업, 식품산업 등의 다양한 산업적 환경 등의 이용가능성을 알아보기 위한 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	산림토양의 대표적인 세균은 무엇이 있는가?	기존에는 대부분의 목질계바이오매스 분해는 목재부후균의 활동과 관련이 있다고 알려졌지만, 메타게놈분석법의 발전으로 이전의 연구방법으로는 알려져 있지 않은 다양한 종류의 미생물들이 여기에 관여한다는 것이 알려졌다. 최근의 연구결과에 의하면 산림토양의 대표적인 세균은 Pseudomonas속, Bacillus속, Rhizobacter속, Arthrobacter속, Paenibacillus속 등 이다(Wilson 2011; Yang 등,2014). 이와 같이 산림에는 목질바이오매스를 분해하여 먹고 사는 다양한 종류의 미생물들이 존재하기 때문에 산업적으로 유용한 미생물을 탐색하기 위한 중요한 보고이다(Li 등, 2009).
	목질바이오매스를 분해하여 먹고 사는 순수 미생물들의 적용가능한 산업분야는 무엇인가?	이와 같이 산림에는 목질바이오매스를 분해하여 먹고 사는 다양한 종류의 미생물들이 존재하기 때문에 산업적으로 유용한 미생물을 탐색하기 위한 중요한 보고이다(Li 등, 2009). 이러한 지역에서 순수 분리한 우수한 미생물들은 펄프산업, 식품 산업, 바이오에탄올 생산 등과 같은 각종 산업에 적용 가능하다. 특히, Bacillus속은 목질바이오매스를 분해하는데 필요한 다양한 효소들을 생합성 할 뿐만 아니라 효모나 곰팡보다 상대적으로 배양이 쉽고, 생장속도가 빠르고, 유전자 조작이 가능하기 때문에 식품산업, 펄프산업, 동물 사료산업 등과 같은 다양한 산업에 이용되고 있다(Lynd 등, 2002; Tjalsma 등, 2004; Khandeparker 등, 2011; Zang과 Zhang 2011).
	리그노셀룰로오스란 무엇인가?	리그노셀룰로오스는 광합성에 의해 합성되는 지구상에서 가장 풍부한 유기물로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌 등으로 구성되어 있다(Whitaker 1990; Kim 등, 2012). 피자식물의 경우 일반적으로 42-50% 셀룰로오스, 25-30% 헤미셀룰로오스, 20-25% 리그닌, 5-8%의 기타 유기물로 구성되어 있다(Kumar 등, 2008).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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