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문제 정의
- 본 연구에서는 혈중 지질 농도를 개선할 수 있는 음료 개발을 위한 연구의 일환으로 문헌조사를 통해 고지혈증 및 심혈 관계 질환의 개선과 관련해 활성이 있는 황금, 작약, 단삼, 상황버섯 및 뽕잎을 선별하였다. 5종의 선별된 소재 중 황금은 꿀풀과(Labiatae) 속썩은풀(Scutellaria baicalensis Georgi)의 뿌리로서 주피를 제거 하거나 뿌리 그 자체를 한약으로 사용하고 있으며[15], 한방에서 여러가지 한약 복합처방으로 토혈, 비혈, 신경통, 고혈압, 피부질환, 열성질환, 정신불안 등의 치료에 폭넓게 사용되고 있다[7].
제안 방법
- Blois의 방법[4]을 변형하여 DPPH 라디칼 소거활성에 의한 항산화 활성을 측정하였다. 에탄올로 1.
- 1 ml를 차례로 가한 후 혼합하여 실온의 암실에서 40분간 정치한 다음 분광광도계를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin (Sigma Co.Ltd.)을 표준물질로 하여 얻은 검량선으로부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- 가용성 고형분은 추출 후 여과한 시료액을 일정량 취하여 자동굴절계(PR-201 α, Atago, Tokyo, Japan)로 3회 반복 측정하였다.
- 각각의 약용식물 추출물에 대한 활성 검증결과를 통해 상대 적으로 활성이 우수한 3종의 소재를 선별하였고, 이들 각각의물 추출물 분말을 무게비로 0.2~2.0의 비율로 혼합한 후 모두 일정한 농도가 되도록 7종의 조성물을 제조하였으며 이 때의 혼합비는 Table 9와 같다.
- 논문(NDSL)과 특허(kissipris)를 중심으로 고지혈증 및 심혈관계 질환의 활성이 우수한 소재를 검색한 결과를 기준으로 선별된 황금, 작약, 단삼, 상황버섯 및 뽕잎은 건조된 상태의 것을 국내산임을 확인한 후 진주시내 한약재 도매상을 통하여 구입하였다. 물, 50% 주정 및 100% 주정을 추출용매로 하여 각각의 약용식물 추출물을 제조하였다. 물과 50% 주정 추출물은 건조된 시료의 무게 대비 20배의 물을 가하여 70℃에서 3시간 가열하였고, 100% 주정 추출물은 동일한 비율로 용매를 가하여 상온에서 24시간 방치하여 추출하였다.
- 물, 50% 주정 및 100% 주정을 추출용매로 하여 각각의 약용식물 추출물을 제조하였다. 물과 50% 주정 추출물은 건조된 시료의 무게 대비 20배의 물을 가하여 70℃에서 3시간 가열하였고, 100% 주정 추출물은 동일한 비율로 용매를 가하여 상온에서 24시간 방치하여 추출하였다. 각각의 추출물은 여과한 후 여액을 동결건조 하거나 회전식진공농축기를 이용하여 용매를 모두 제거한 후 분말화하여 시료로 사용하였다.
- 상층액 200 μl에 효소액 1.5 ml을 가해 혼합한 후 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 500 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도 비로서 콜레스테롤 흡착활성(%)을 나타내었다.
- 선별된 소재 각각의 물, 50% 및 100% 주정 추출물을 제조하여 용매별 추출물의 항산화 활성, 콜레스테롤 흡착활성 및 ACE (angiotensin I converting enzyme) 저해활성을 검증하였다. 이들 중 활성이 상대적으로 높은 약용식물 3종을 0.
- 시료액 40 μl, 증류수 40 μl, reaction solution 100 μl를 차례로 혼합하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, FeSO4 ·7H2O를 사용하여 환원력을 계산하였다.
- 에탄올로 1.5×10-4 M 농도가 되도록 조절한 DPPH용액 100 μl에 농도별 약용식물 추출액 100 μl를 가하고 10초간 균질화 시킨 다음 실온에서 10분간 방치한후 분광광도계로 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 선별된 소재 각각의 물, 50% 및 100% 주정 추출물을 제조하여 용매별 추출물의 항산화 활성, 콜레스테롤 흡착활성 및 ACE (angiotensin I converting enzyme) 저해활성을 검증하였다. 이들 중 활성이 상대적으로 높은 약용식물 3종을 0.2~2.0의비율로 혼합해 조성물 7종을 제조한 후 상호 혼합에 의한 활성의 변화를 확인하였다.
- 이용액 100 μl에 농도별 약용식물 추출액을 100 μl 가하여 실온에서 5분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS 라디칼 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 비로 나타내었다.
- 콜레스테롤 흡착능은 Soh 등[37]의 방법을 응용하여 콜레 스테롤 kit시약(AM 202-k, Asan Pharm., Seoul, Korea)으로 측정하였다. 시료액 1 ml에 콜레스테롤(300 mg/dl) 50 μl를가하여 25℃에서 20분간 반응시킨 후 0.
- Louis, MO, USA) 1 ml를 넣고 3분 후 10% Na2CO3 (Daejung, Siheung, Korea) 용액 1 ml씩을 가한 후 혼합하여 실온의 암실에서 1시간 정치한 다음 분광광도계 (Libra S 35, Biochrom, Cambridge, England)로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (Sigma Co. Ltd.)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀화합물의 함량을 계산하였다.
대상 데이터
- 논문(NDSL)과 특허(kissipris)를 중심으로 고지혈증 및 심혈관계 질환의 활성이 우수한 소재를 검색한 결과를 기준으로 선별된 황금, 작약, 단삼, 상황버섯 및 뽕잎은 건조된 상태의 것을 국내산임을 확인한 후 진주시내 한약재 도매상을 통하여 구입하였다. 물, 50% 주정 및 100% 주정을 추출용매로 하여 각각의 약용식물 추출물을 제조하였다.
데이터처리
- 결과치는 실험군당 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 시행하였다.
- 모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 실험으로부터 얻은 결과는 SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을사용하여 분석하였다. 결과치는 실험군당 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 p<0.
이론/모형
- ACE 저해활성 측정은 Cushman과 Cheung [9]의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 50 mM sodium borate buffer (pH 8.
- FRAP에 의한 항산화 활성의 측정은 환원력을 이용한 방법으로 Benzie와 Strain방법[3]을 응용하여 측정하였다. Reaction solution은 300 mM acetate buffer (pH 3.
- 총 페놀화합물의 함량은 페놀성 물질인 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리로 Foiln-Denis 방법 [11]을 이용하였다. 시료액 2 ml에 Foline-Ciocalteau 시약 (Sigma Co.
- 플라보노이드 함량 분석은 Moreno 등[33]의 방법에 따라 시료액 1 ml에 10% aluminum nitrate 0.2 ml, 1 M potassium acetate 0.2 ml 및 80% ethanol 4.1 ml를 차례로 가한 후 혼합하여 실온의 암실에서 40분간 정치한 다음 분광광도계를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin (Sigma Co.
성능/효과
- 100% 주정 추출물의 가용성 고형분 함량은 50% 주정 추출물보다 더 높았으며 19.67~20.33 brix°로 시료간의 차이는 크지 않았다.
- 125~ 500 μg/ml의 농도 범위에서 DPPH 라디칼 소거활성은 가장 낮은 농도인 125 μg/ml 농도에서 28.37~32.86%였으며, 시료의 농도가 증가함에 따라 활성도 증가하여 500 μg/ml 농도에서는 53.98~63.28%의 범위였다.
- 2 mg/ml 농도의 약용식물 조성물들의 콜레스테롤 흡착활성을 평가한 결과 B 조성물이 69.41%, F와 G 조성물이 각각 70.03%와 69.49%로 여타 시료에 비해 활성이 높았으며, 이들 시료간에는 유의적인 차이가 없었다. 콜레스테롤 흡착활성도총 페놀 및 플라보노이드 함량 결과와 같이 조성물들의 시너지 효과보다는 첨가 효과가 큰 것으로 판단된다.
- 06%의 범위였다. 50% 주정 추출물에서는 모든 시료가 가장 낮은 농도에서도 90% 이상으로 활성이 높았다.
- 50% 주정 추출물의 경우 여타 추출물에 비해 활성이 높으며, 최고 농도인 1,000 μg/ml 농도 에서는 592.31~967.53 μM의 범위였고, 50% 및 100% 주정 추출물에서는 상황버섯의 환원력이 가장 높았다.
- 500 μg/ml 농도에서는 물 추출물 중에서도 작약과 단삼 추출물이 각각 73.03% 와 79.73%로 활성이 높았고, 50%와 100% 주정 추출물 중에서는 뽕잎 추출물을 제외한 모든 시료가 73.66~99.28%의 높은 활성을 나타내었다.
- 가용성 고형분 함량은 물 추출물에서는 0.40~3.60 brix°였는데, 주정 추출물에서 월등히 더 높았다.
- 가장 시료의 농도가 낮은 125 μg/ml 농도에서는물 추출물 중 단삼 추출물이 44.10%로 가장 활성이 높았고, 주정 추출물에서는 상황버섯 추출물의 활성이 높아 77% 이상이었다.
- 농도별 약용식물 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성을 평가한 결과(Table 7) DPPH 라디칼 소거활성과는 다소 상이한 경향을 나타내었으며, 활성의 절대 값도 더 높아 가장 낮은 농도인 125 μg/ml 농도에서 물 추출물은 22.14~97.73%, 50% 주정 추출물은 90.82~98.68%로 활성이 높았고, 100% 주정 추출물의 활성도 33.87~98.79%의 범위였다.
- 84 mg/ml의 범위로 동일한 경향이었다. 단독 시료 중에서 이들 화합물의 함량을 분석한 결과를 고려할 때 단일 재료 중에 그 함량이 높은 시료의 혼합비율이 높으면 조성물에서도 높게 정량되어 단일 시료에서 이들 화합물의 함량이 직접적으로 영향을 미치는 것으로 판단된다.
- 47%로 수율이더 낮았다. 단삼도 유사한 경향으로 50% 주정 추출물의 수율은 31.53%로 물 추출물(20.93%)보다 수율이 더 높았고, 뽕잎은물 추출물의 수율이 8.59%로 50% 주정 추출물(7.94%)보다 더 높았다.
- 약용식물 5종 각각의 추출수율 및 가용성 고형분 함량은 분석한 결과는 Table 1과 같다. 모든 시료 추출물에서 100% 주정 추출물의 수율이 가장 낮아 1.17~2.35%에 불과하였다. 시료에 따라 50% 주정 추출물과 물 추출물의 수율은 서로 상이하였는데, 황금의 경우 각각 23.
- 71 mg/ml의 범위였다. 물 추출물 중에서는 단삼 추출물에서 35.83 mg/ml로 가장 높은 함량 이었으며, 다음으로 뽕잎 추출물에서 26.66 mg/ml로 함량이 높았고, 황금과 작약 추출물에서는 10 mg/ml 미만으로 정량 되었다. 황금의 경우 50% 주정 추출물과 100% 주정 추출물 간의 함량 차이가 미미하였으며, 상황버섯이나 뽕잎 추출물의 경우 50% 주정 추출물에서는 각각 45.
- 본 연구에서 사용한 약용식물 5종의 용매별 추출물 중 총페놀화합물 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 물 추출물 중에서는 단삼 추출물에서 가장 함량이 높아 80.27 mg/ml이었고, 다음으로 뽕잎 추출물에서 59.74 mg/ml로 그 함량이 높았으며, 황금 추출물에서 총 페놀화합물의 함량은 22.54 mg/ml에 불과하였다. 주정 추출물들에서는 그 함량이 월등히 높았는데, 뽕잎을 제외한 모든 시료에서 50% 주정 추출물에 비해 100% 주정 추출물에서 함량이 더 높았다.
- 75~100%의 범위였다. 물 추출물 중에서는 황금의 활성이 가장 낮아 최고 농도에서도 활성은 83.75%였고, 100% 주정 추출물 중에서는 뽕잎 추출물의 활성이 가장 낮아 33.87~91.06%의 범위였다. 50% 주정 추출물에서는 모든 시료가 가장 낮은 농도에서도 90% 이상으로 활성이 높았다.
- 부평초 추출물의 페놀화합물 함량을 분석한 Song 등[38]은모든 농도에서 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 페놀화합물의 함량이 더 높다고 하였으며, Kang 등[17]은 쑥의 건조방법뿐만 아니라 추출용매 중의 에탄올 비율에 따라서 총 페놀 화합물의 함량이 상이하다고 보고한 바 있다. 본 연구의 결과에서도 재료의 특성에 따라 차이가 있기는 하지만 추출용매 중의 주정농도가 높을수록 추출물의 총 페놀화합물의 함량이더 높았다.
- 약용식물 용매별 추출물을 대상으로 콜레스테롤 흡착활성을 평가한 결과는 Table 5와 같다. 시료마다 추출용매에 따른 활성이 서로 상이하였는데 황금과 상황버섯의 경우 물 추출물의 활성은 각각 8.87% 및 46.18%로 물 추출물의 활성이 가장 낮았으나 50% 주정 추출물에서는 각각 79.80% 및 66.96%, 100% 주정 추출물에서는 각각 86.22% 및 66.02%의 높은 활성을 나타내었다. 이와는 상반되게 뽕잎의 경우 물 추출물에서 45.
- 35%에 불과하였다. 시료에 따라 50% 주정 추출물과 물 추출물의 수율은 서로 상이하였는데, 황금의 경우 각각 23.34%와 24.27%로 수율이 유사한 범위였으나 작약 추출물의 경우 50% 주정 추출물에서 수율이 14.05%인 것에 반해 물 추출물에서는 8.47%로 수율이더 낮았다. 단삼도 유사한 경향으로 50% 주정 추출물의 수율은 31.
- 약용식물 5종의 물, 50% 및 100% 주정 추출물을 동일한 농도로 만들어 ACE 저해활성을 평가한 결과(Table 4) 물 추출 물에서만 활성이 확인되었다. 황금 추출물의 활성이 가장 높아 45.
- 약용식물 조성물의 FRAP를 확인한 결과 농도가 증가할수록 활성도 증가하는 경향이었으며, 시료간에 차이도 커서 125 μg/ml 농도에서 66.51~100.78 μM의 범위였다.
- 28%의 높은 활성을 나타내었다. 작약, 단삼, 상황버섯의 경우 물 추출물이나 주정 추출물들 모두에서 고루 활성이 높은데 반해 황금의 경우 물 추출물에서는 활성이 극히 낮아 최고 농도에서도 활성은 16.41%였다.
- 14%였다. 작약의 경우 물 추출물에서는 76.47%, 50% 주정 추출물에서는 79.16 %, 100% 주정 추출물은 82.19%로 모든 추출물에서 고루 활성이 높았다.
- 재료의 혼합 비율을 달리한 조성물의 ABTS 라디칼 소거활성은 125 μg/ml 농도에서는 81.72~94.79%로 시료 간에 차이가 있었으나 250 μg/ml 이상의 농도에서는 모든 시료에서 활성은 98% 이상으로 재료의 혼합 비율이나 사용농도에 따른 차이가 없었다.
- 54 mg/ml에 불과하였다. 주정 추출물들에서는 그 함량이 월등히 높았는데, 뽕잎을 제외한 모든 시료에서 50% 주정 추출물에 비해 100% 주정 추출물에서 함량이 더 높았다. 뽕잎 추출물의 경우 50% 주정 추출물에서 총 페놀화합물의 함량은 74.
- 총 페놀화합물의 함량은 50.53~61.96 mg/ml로 시료의 혼합 비율에 따라 차이가 있었으며, 총 플라보노이드 화합물의 함량도 16.91~32.84 mg/ml의 범위로 동일한 경향이었다. 단독 시료 중에서 이들 화합물의 함량을 분석한 결과를 고려할 때 단일 재료 중에 그 함량이 높은 시료의 혼합비율이 높으면 조성물에서도 높게 정량되어 단일 시료에서 이들 화합물의 함량이 직접적으로 영향을 미치는 것으로 판단된다.
- 5종 약용식물의 용매별 추출물 중 총 플라보노이드 화합물 함량은 Table 3과 같다. 총 플라보노이드 화합물의 함량은 총페놀화합물의 함량과 다소 차이가 있었으며 50% 주정 추출물에서 함량이 더 높아 14.45~62.71 mg/ml의 범위였다. 물 추출물 중에서는 단삼 추출물에서 35.
- 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 활성도 증가하였으며, 물 추출물의 경우 500 μg/ml 농도에서 14.69~608.27 μM의 범위로 시료에 따른 활성의 차이가 매우 컸는데, 단삼 추출물의 활성이 가장 높았다.
- 49%로 여타 시료에 비해 활성이 높았으며, 이들 시료간에는 유의적인 차이가 없었다. 콜레스테롤 흡착활성도총 페놀 및 플라보노이드 함량 결과와 같이 조성물들의 시너지 효과보다는 첨가 효과가 큰 것으로 판단된다.
- 약용식물 5종의 물, 50% 및 100% 주정 추출물을 동일한 농도로 만들어 ACE 저해활성을 평가한 결과(Table 4) 물 추출 물에서만 활성이 확인되었다. 황금 추출물의 활성이 가장 높아 45.33%였고, 다음으로 뽕잎 추출물이 34.58%로 활성이 높았으며, 작약과 상황버섯 추출물의 활성은 유사한 범위였다. 단삼 추출물의 활성이 가장 낮아 8.
- 66 mg/ml로 함량이 높았고, 황금과 작약 추출물에서는 10 mg/ml 미만으로 정량 되었다. 황금의 경우 50% 주정 추출물과 100% 주정 추출물 간의 함량 차이가 미미하였으며, 상황버섯이나 뽕잎 추출물의 경우 50% 주정 추출물에서는 각각 45.91 mg/ml과 40.51 mg/ml이 함유되어 있었으나 100% 주정 추출물에서는 각각 9.81 mg/ml과 9.47 mg/ml로 50% 주정추출물에 비해 약 21% 정도로 함량이 낮았다.
후속연구
- 49%로가장 낮은 오가피를 제외한 모든 시료가 산업적 활용이 가능 하다고 보고하였다. 이와 비교해 볼 때 본 연구 사용된 시료중 상황버섯을 제외한 시료들의 물 및 50% 주정추출물은 상업적 활용이 가능할 것으로 생각된다.
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