캄필로박터 제주니 균(Campylobacter jejuni)은 세균성위장관감염증을 일으키는 수인성식품매개질환의 중요한 원인 균으로 알려져 있다. 2014년부터 2016년까지 경기지역에서 발생된 17번의 식중독에서 캄필로박터 제주니 균에 감염된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 PFGE와 multiplex-PCR typing 방법을 사용하여 비교분석 하였다. 47개의 Penner-type으로 구분되는 캄필로박터 제주니 균의 혈청형을 multiplex-PCR typing을 이용하여 35개의 유전형으로 구분할 수 있는 것을 확인하였고 선별된 균주에서 7개의 유전형(HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, HS53)으로 구분되는 것을 확인하였다. 가장 많은 케이스에서 분리된 유전형은 HS2였고 7건의 식중독케이스에서 확인되었다. PFGE를 통하여 11건의 식중독에서 모두 5개의 그룹으로 분류되었고 그룹간의 유사성은 61.8에서 66.6%였다. 본 연구는 다양한 유전자 분석방법을 통하여 경기도내에서 분리된 캄필로박터 제주니 균의 유전적 다양성을 파악하고 향후 집단발생시 환자의 분리 균주 간의 상관관계 규명하며 캄필로박터 감염증의 발생 및 확산 방지에 필요한 기초자료를 마련하고자 한다.
캄필로박터 제주니 균(Campylobacter jejuni)은 세균성위장관감염증을 일으키는 수인성식품매개질환의 중요한 원인 균으로 알려져 있다. 2014년부터 2016년까지 경기지역에서 발생된 17번의 식중독에서 캄필로박터 제주니 균에 감염된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 PFGE와 multiplex-PCR typing 방법을 사용하여 비교분석 하였다. 47개의 Penner-type으로 구분되는 캄필로박터 제주니 균의 혈청형을 multiplex-PCR typing을 이용하여 35개의 유전형으로 구분할 수 있는 것을 확인하였고 선별된 균주에서 7개의 유전형(HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, HS53)으로 구분되는 것을 확인하였다. 가장 많은 케이스에서 분리된 유전형은 HS2였고 7건의 식중독케이스에서 확인되었다. PFGE를 통하여 11건의 식중독에서 모두 5개의 그룹으로 분류되었고 그룹간의 유사성은 61.8에서 66.6%였다. 본 연구는 다양한 유전자 분석방법을 통하여 경기도내에서 분리된 캄필로박터 제주니 균의 유전적 다양성을 파악하고 향후 집단발생시 환자의 분리 균주 간의 상관관계 규명하며 캄필로박터 감염증의 발생 및 확산 방지에 필요한 기초자료를 마련하고자 한다.
Campylobacter jejuni is an important food-borne pathogen causing gastroenteritis in human. We isolated 208 strains of Campylobacter jejuni from 430 diarrhea patients and food employees with 17 food-poisoning outbreaks between 2014 and 2016 in Gyeonggi area. The strains were tested for genetic relati...
Campylobacter jejuni is an important food-borne pathogen causing gastroenteritis in human. We isolated 208 strains of Campylobacter jejuni from 430 diarrhea patients and food employees with 17 food-poisoning outbreaks between 2014 and 2016 in Gyeonggi area. The strains were tested for genetic relationship and the genotype distribution using PFGE and multiplex-PCR typing. Among the 47 Penner-serotypes known for C. jejuni, it was identified as a genotype consisting of 35 genotypes by multiplex-PCR typing and represented 7 genotypes (HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, and HS53) in the selected strain. From the PFGE analysis of 11 food-poisoning outbreaks, 5 group of PFGE profile were obtained, and genetic similarity in these clusters ranged from 61.8 to 66.6%. This study examines the genetic diversity of C. jejuni that have been separated in the Gyeonggi area through various genetic analysis methods and identifies the correlation between strains in patients who have been infected with the disease in the future.
Campylobacter jejuni is an important food-borne pathogen causing gastroenteritis in human. We isolated 208 strains of Campylobacter jejuni from 430 diarrhea patients and food employees with 17 food-poisoning outbreaks between 2014 and 2016 in Gyeonggi area. The strains were tested for genetic relationship and the genotype distribution using PFGE and multiplex-PCR typing. Among the 47 Penner-serotypes known for C. jejuni, it was identified as a genotype consisting of 35 genotypes by multiplex-PCR typing and represented 7 genotypes (HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, and HS53) in the selected strain. From the PFGE analysis of 11 food-poisoning outbreaks, 5 group of PFGE profile were obtained, and genetic similarity in these clusters ranged from 61.8 to 66.6%. This study examines the genetic diversity of C. jejuni that have been separated in the Gyeonggi area through various genetic analysis methods and identifies the correlation between strains in patients who have been infected with the disease in the future.
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문제 정의
본 연구에서는 경기도지역 집단식중독 설사환자로부터 분리된 캄필로박터 제주니 균의 PFGE를 통하여 유전적 상관관계를 확인하고 합병증을 유발할 수 있는 캄필로박터 제주니 균의 유전형을 구분할 수 있는 다양한 방법을 통하여 분석하였다. 또한 분석된 균 종간의 유전적 상관관계를 비교하고 유전형을 분석하여 캄필로박터 제주니 균에 의한 질환 발생 시역학 연구의 기초 자료를 확보하고자 하였다.
6%였다. 본 연구는 다양한 유전자 분석방법을 통하여 경기도내에서 분리된 캄필로박터 제주니 균의 유전적 다양성을 파악하고 향후 집단발생시 환자의 분리 균주 간의 상관관계 규명하며 캄필로박터 감염증의 발생 및 확산 방지에 필요한 기초자료를 마련하고자 한다.
본 연구에서는 경기도지역 집단식중독 설사환자로부터 분리된 캄필로박터 제주니 균의 PFGE를 통하여 유전적 상관관계를 확인하고 합병증을 유발할 수 있는 캄필로박터 제주니 균의 유전형을 구분할 수 있는 다양한 방법을 통하여 분석하였다. 또한 분석된 균 종간의 유전적 상관관계를 비교하고 유전형을 분석하여 캄필로박터 제주니 균에 의한 질환 발생 시역학 연구의 기초 자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
2014년부터 2016년 8월까지 캄필로박터 제주니 감염증으로 확인된 17건의 식중독 중에서 분리된 11건의 식중독에 대한 균주의 표본에 대하여 PFGE를 실시하였다. DNA를 SmaI 제한효소로 처리한 후 PFGE 실험법으로 유전형을 분석하였고 유전적 유사성이 80% 이하인 경우 서로 다른 그룹으로 분리하였다.
Multiplex-PCR을 통한 유전형을 확인하기 위해 Poly 등(2015)의 방법을 참고하여 형-특이성을 갖는 프라이머쌍을 제작하였다. 47개의 혈청형으로 구별할 수 있는Penner type을 기반으로 하여 35개의 프라이머쌍을 제작하였다(Table 1). 사용하는 프라이머의 수가 많기 때문에 4번에 나누어 수행하였으며 각 프라이머 혼합그룹을 편의상 α, β, γ, δ-mix로 구분하였고, PCR 생성물의 크기의 차이가 20개의 염기쌍 이상 날 수 있도록 구성하였다.
2014년부터 2016년 8월까지 캄필로박터 제주니 감염증으로 확인된 17건의 식중독 중에서 분리된 11건의 식중독에 대한 균주의 표본에 대하여 PFGE를 실시하였다. DNA를 SmaI 제한효소로 처리한 후 PFGE 실험법으로 유전형을 분석하였고 유전적 유사성이 80% 이하인 경우 서로 다른 그룹으로 분리하였다. 그 결과 11개의 식중독 케이스는 5개의 그룹(A~E)으로 분류되었다(Fig.
, 2013). Multiplex-PCR을 통한 유전형을 확인하기 위해 Poly 등(2015)의 방법을 참고하여 형-특이성을 갖는 프라이머쌍을 제작하였다. 47개의 혈청형으로 구별할 수 있는Penner type을 기반으로 하여 35개의 프라이머쌍을 제작하였다(Table 1).
PCR 조건은 94°C에서 5분간 pre-denaturation한 후 94°C에서 1분간 denaturation, 52°C에서 1분간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 조건으로 30 cycle 반복한 다음 72°C에서 10분간 post-extension 하였다. PCR 반응 후 생성물은 QiaExcel (Qiagen)에서 전기영동하여 결과를 확인하였다(Fig. 1).
분리된 집락은 campylobacter triplex PCR kit (Kogene), catalase, 그리고 API campy (bioMériux)를 사용해 최종 동정하였다.
사용하는 프라이머의 수가 많기 때문에 4번에 나누어 수행하였으며 각 프라이머 혼합그룹을 편의상 α, β, γ, δ-mix로 구분하였고, PCR 생성물의 크기의 차이가 20개의 염기쌍 이상 날 수 있도록 구성하였다.
식중독으로 분리된 균주를 multiplex-PCR typing을 통한 캄필로박터 제주니 균의 Penner-type을 기반으로 한 유전형을 확인하였다. Table 1의 35개의 형-특이 프라이머쌍을 이용하여 17건의 경기도 식중독의 유전자 패턴을 분석한 결과, 2건을 제외한 15건의 식중독에서 7개의 서로 다른 유전형으로 구분되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
실험이 잘 되었는지 확인하기 위해 양성대조군으로 모든 캄필로박터 제주니 균에서 동일하게 확인가능 하고 매우 보존적인 유전자 lpxA를 γ-mix PCR의 331 bp에 확인할 수 있게 만들었다.
유전자의 PCR 반응은 추출한 주형 DNA (1~10 ng), forward와 reverse primer (20 pmole/ µl) 각각 1 µl, PCR mastermix(Bioneer)를 사용하여 최종 20 µl가 되게 하였다.
enterica serotype Braenderup H9812(ATCC #BAA-664)를 size marker로 사용하였으며 XbaI (40U/µl, Roche)을 처리하여 37°C에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. 전기영동이 완료되면 SYBR gold 염색시약(Invitrogen)에 gel을 넣어 30분 염색 후, 증류수에 1시간동안 탈색 DNA image analyzer (Bio-Rad)로 확인하였다. 확인된 사진은 BioNumerics (Applied Maths) 프로그램을 이용하여, 1.
제한효소를 처리한 plug 절편을 전기영동 장치(CHEF DR3, Bio-Rad)를 사용해 initial time 6.76 sec, final time 35.38 sec, gradient 6 v/cm,included angle 120° 조건으로 14°C에서 18시간 동안 전기영동하였다.
캄필로박터 제주니 균의 분리를 위해 mCCDA (Oxoid) 평판배지에 검체를 도말한 후 Campygen (Oxoid)를 첨가하여 42°C에서 48시간 동안 미호기 상태로 배양한 다음 원형 또는 불규칙한 형태의 회백색 집락을 순수 분리하였다.
표준균주로 S. enterica serotype Braenderup H9812(ATCC #BAA-664)를 size marker로 사용하였으며 XbaI (40U/µl, Roche)을 처리하여 37°C에서 2시간 30분 동안 반응시켰다.
대상 데이터
2014년과 2016년 8월까지 경기지역 발생된 식중독 중 캄필로박터 제주니 감염증이 원인으로 확인된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 분리였다. 동일기간 동안 경기도에서 발생한 353건(3,858명)의 세균성식중독 중 캄필로박터 제주니 감염증에 의한 식중독은 17건(430명)으로 전체의 케이스의 4.
캄필로박터 제주니 균(Campylobacter jejuni)은 세균성위장관감염증을 일으키는 수인성식품매개질환의 중요한 원인균으로 알려져 있다. 2014년부터 2016년까지 경기지역에서 발생된 17번의 식중독에서 캄필로박터 제주니 균에 감염된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 PFGE와 multiplex-PCR typing 방법을 사용하여 비교분석 하였다.
분리된 균주는 0.2% yeast extract, 20% glycerol, 5% FBS를 첨가한BHI (Oxoid) 배지에 넣어 -70°C 초저온냉동고에 보관하였다가 실험에 사용하였다.
데이터처리
2014년부터 2016년까지 경기지역에서 발생된 17번의 식중독에서 캄필로박터 제주니 균에 감염된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 PFGE와 multiplex-PCR typing 방법을 사용하여 비교분석 하였다. 47개의 Penner-type으로 구분되는 캄필로박터 제주니 균의 혈청형을 multiplex-PCR typing을 이용하여 35개의 유전형으로 구분할 수 있는 것을 확인하였고 선별된 균주에서 7개의 유전형(HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, HS53)으로 구분되는 것을 확인하였다.
전기영동이 완료되면 SYBR gold 염색시약(Invitrogen)에 gel을 넣어 30분 염색 후, 증류수에 1시간동안 탈색 DNA image analyzer (Bio-Rad)로 확인하였다. 확인된 사진은 BioNumerics (Applied Maths) 프로그램을 이용하여, 1.5% tolerance, 1.5% optimization Dice co-efficient로 유사도를 계산하였으며, UPGMA (unweight pair group method of averagelinkage)법으로 유전적 유연관계를 분석하였다.
성능/효과
월별 분리현황을 살펴보면, 여름철(6~8월)에 많이 발생하였고, 지역별로는 안양이 4건으로 가장 많았으며 그 다음으로 용인이 3건이었다. 10인 이상의 환자가 발생한 집단식중독의 경우 17건 중 9건(52%)이었으며 전체 353건에 식중독 중 집단식중독이 62건(17.5%)으로 캄필로박터 제주니 감염증은 다른 식중독에 비해 집단식중독의 경우가 많았으며 그 원인은 단체급식소에서 대량으로 발생한 것이 원인이었다. 9건의 집단식중독 중 5건은 학교식중독이 원인이며 4건은 학교가 아닌 급식시설이었다(Table 2).
2). 11개의 식중독케이스에서 분리된 균주의 유전형을 살펴보면 그룹A는 2016년 6월 김포에서 발생한 식중독과 2014년 8월 군포에서 발생한 식중독으로 multiplex-PCR typing에서 HS15로 확인된 균주와 일치하였다. 그룹 내에서는 86.
선별된 균주의 유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 PFGE와 multiplex-PCR typing 방법을 사용하여 비교분석 하였다. 47개의 Penner-type으로 구분되는 캄필로박터 제주니 균의 혈청형을 multiplex-PCR typing을 이용하여 35개의 유전형으로 구분할 수 있는 것을 확인하였고 선별된 균주에서 7개의 유전형(HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, HS53)으로 구분되는 것을 확인하였다. 가장 많은 케이스에서 분리된 유전형은 HS2였고 7건의 식중독케이스에서 확인되었다.
가장 많은 케이스에서 분리된 유전형은 HS2였고 7건의 식중독케이스에서 확인되었다. PFGE를 통하여 11건의 식중독에서 모두 5개의 그룹으로 분류되었고 그룹간의 유사성은 61.8에서 66.6%였다. 본 연구는 다양한 유전자 분석방법을 통하여 경기도내에서 분리된 캄필로박터 제주니 균의 유전적 다양성을 파악하고 향후 집단발생시 환자의 분리 균주 간의 상관관계 규명하며 캄필로박터 감염증의 발생 및 확산 방지에 필요한 기초자료를 마련하고자 한다.
같은 환자군과 분리된 캄필로박터 제주니 균의 유전형이 동일한 것으로 확인되었고 같은 식품을 섭취하여 발생된 것으로 확인된다. 조리종사자에게서도 동일한 유전형이 확인되었는데 복수로 확인된 경우가 많아 조리종사자의 의한 감염보다 같은 식품을 섭취함으로써 감염된 것으로 예상된다.
11개의 식중독케이스에서 분리된 균주의 유전형을 살펴보면 그룹A는 2016년 6월 김포에서 발생한 식중독과 2014년 8월 군포에서 발생한 식중독으로 multiplex-PCR typing에서 HS15로 확인된 균주와 일치하였다. 그룹 내에서는 86.8%의 유전적 유사성을 보여주었으며 케이스 간에는 조리종사자 균주를 포함하여 100%의 유사성을 보여주었다. 그룹B는 2016년 5월 안양에서 발생한 식중독으로 HS41로 확인된 균주와 일치하였고 100%의 유사성을 보여주었다.
그룹B는 2016년 5월 안양에서 발생한 식중독으로 HS41로 확인된 균주와 일치하였고 100%의 유사성을 보여주었다. 그룹C은 2014년 6월과 2016년 8월 용인에서 발생한 식중독으로 HS29로 확인된 균주와 일치하였고 81.23~93.3%의 유사성을 보여 균주 간에도 매우 변이가 심한 것이 확인되었다. 그룹D는 2014년 12월 수원, 2015년 7월 화성, 용인에서 발생한 식중독은 HS2로 확인된 균주와 일치하였으나 2014년 11월 하남에서 발생한 식중독은 HS4A로 확인된 균주와도 일치하였다.
위에 열거한 그룹 A, B, C는 multiplex-PCR typing과 PFGE의 패턴이 정확히 일치한 것을 보여주지만 그룹D, E는 일치하지 않았다. 그룹D의 HS2 균주는 HS4A로 확인된 2014년 11월 하남에서 발생된 식중독과 93.3%로 매우 유사도가 높은 반면 같은 HS2에 속하는 그룹 E의 균주와는 77.3%로 유사도가 높지 않은 것을 확인하였다. 기존의 고전적인 분류 방법인 혈청형을 이용하는 실험법과 혈청형을 기반으로 구성되는 multiplex-PCR typing의 경우 매우 높은 유사성을 보여주지만 PFGE의 실험법은 균주의 전체유전자를 확인하여 분석하기 때문에 상대적으로 낮은 유사성을 보여주는 것이라 생각된다.
2014년과 2016년 8월까지 경기지역 발생된 식중독 중 캄필로박터 제주니 감염증이 원인으로 확인된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 분리였다. 동일기간 동안 경기도에서 발생한 353건(3,858명)의 세균성식중독 중 캄필로박터 제주니 감염증에 의한 식중독은 17건(430명)으로 전체의 케이스의 4.8%이며 전체 식중독환자와 종사자중 11.1%가 캄필로박터 제주니 균을 보유한 것으로 확인되었다. 건당 평균 25.
본 연구를 통해 캄필로박터 제주니 균의 다양한 다양한 유전자형이 존재함을 확인할 수 있었고, multiplex-PCR typing을 이용한 유전자형분석은 캄필로박터 제주니 균의 유연관계를 분석하는 분자유전학적 분석에 좋은 방법임을 확인할 수 있었다. 기존에 CPS 유전자를 발현하여 혈청형을 분석하는 방법은 매우 복잡하고 많은 비용을 소모한다고 알려져 있다(Bacon et al.
1). 분리된 균주 208균주 중 175균주의 유전형을 확인하였다. 2015년 11월 수원과 2016년 6월 안양 식중독은 검체의 수가 적어서 모두 소실되었다.
조리종사자에게서도 동일한 유전형이 확인되었는데 복수로 확인된 경우가 많아 조리종사자의 의한 감염보다 같은 식품을 섭취함으로써 감염된 것으로 예상된다. 캄필로박터 제주니 균의 동일유전형이 산발적으로 발생하여 지역적 특색을 확인할 수 없었고 감염된 식품의 캄필로박터 제주니 균의 유전형을 확인하여 전국적인 유통망의 관리를 통하여 발생을 억제할 수 있을 것으로 예상된다.
후속연구
또한 새로운 균주가 발견되었을 때 기존 균주와 비교분석해야 하는 PFGE와는 달리 multiplex-PCR typing을 이용한 유전자형 분석은 개별 검체로 분석할 수 있다는 장점이 있다고 생각한다. 향후 감염된 식품의 캄필로박터 제주니 균의 유전형을 확인하여 통계를 데이터베이스화 한다면 보다 신속하게 감염원 추적이 가능할거라 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
캄필로박터 제주니 균은 어떤 특징을 가진 균인가?
캄필로박터 제주니 균(Campylobacter jejuni)은 세균성위장관감염증을 일으키는 수인성식품매개질환의 중요한 원인 균으로 알려져 있다. 2014년부터 2016년까지 경기지역에서 발생된 17번의 식중독에서 캄필로박터 제주니 균에 감염된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 선별하였다.
유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 어떤 방법을 사용하여 비교 분석 하였는가?
2014년부터 2016년까지 경기지역에서 발생된 17번의 식중독에서 캄필로박터 제주니 균에 감염된 430명의 환자와 조리종사자에게서 208건의 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 유전적 상관관계와 유전형분포를 확인하기 위하여 PFGE와 multiplex-PCR typing 방법을 사용하여 비교분석 하였다. 47개의 Penner-type으로 구분되는 캄필로박터 제주니 균의 혈청형을 multiplex-PCR typing을 이용하여 35개의 유전형으로 구분할 수 있는 것을 확인하였고 선별된 균주에서 7개의 유전형(HS2, HS4A, HS8, HS15, HS29, HS41, HS53)으로 구분되는 것을 확인하였다.
캄필로박터 제주니 균에 의해 발생한 식중독의 증상과 치료 방법은?
임상증상은 묽은 설사, 변, 복통, 열, 메스꺼움, 구토 등을 나타내며 3일에서 5일 정도 지속되지만 증상이 심하지 않고 대부분 1주일 안에 치료되기 때문에 항생제 치료가 필요하지 않는 것으로 알려져 있다. 증상이 심한 경우 엘리트로마이신(erythromycin), 퀴놀론(quinolone), 테트라사이클린(tetracycline),아지트로마이신(azithromycin) 등을 사용하는데 최근 항생제 저항성을 보이는 균들이 증가하고 있는 추세이다(Zaman, 1992;Szczepanska et al., 2017).
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