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문제 정의
- jejuni의 heat-stable 항원을 이용해 혈청형을 분석하였다. 더불어 PFGE와 rep-PCR을 통해 분리된 C. jejuni 균의 유전형을 분석하여 이들 사이에 유전적 상관성을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 경기도내 병원을 내원한 설사환자와 식중독 outbreak에서 분리된 C. jejuni 균주를 대상으로 C. jejuni에 특이적인 hipO 유전자, 중요 독력인자인 cdtB 유전자를 확인하였고, gyrA 유전자를 PCR과 sequencing 방법으로 확인하여 ciprofloxacin에 대한 내성과의 관련성도 연구하였다. 또한 C.
- Campylobacter jejuni는 사람에서 매우 중요한 식중독 원인균의 하나이며, 2010년 경기도내 병원을 내원한 설사 환자와 4번의 식중독 outbreak에서 42균주를 분리하였다. 본 연구에서는 분리된 C. jejuni 42균주의 유전적 특성과 혈청형, 항균제 내성율을 분석하였다. hipO 종특이 유전자(100%), cdtB 독소 유전자(100%)가 검출되었고, gyrA 돌연변이 유전자(95.
제안 방법
- 5로 맞추고 배지에 고르게 도말하였다. 37℃에서 미호기 상태로 48시간 동안 배양 후 억제환의 크기를 측정하여 내성유무를 판독하였다. 정도 관리를 위하여 E.
- C. jejuni 균을 혈액 한천 배지에 도말한 후, 42℃에서 미호기성으로 48시간 배양한 균의 genomic DNA를 QiAmp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 사용해 추출하였다. Ciprofloxacin 내성과 관련된 gyrA 유전자의 돌연변이 여부를 확인하기 위해 Table 1의 gyrA sequencing primer를 사용하여 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea).
- 2010년 경기도지역 병원(고대안산 병원, 동수원 병원, 성빈센트 병원, 분당차병원)을 내원한 설사환자 검체(급성설사 질환 실험실 감시사업)에서 분리된 10균주와 4건의 식중독 outbreak에서 분리된 32균주 등 전체 42균주를 연구에 사용하였다. C. jejuni의 분리를 위해 modified Charcoal Cefoperazone Desoxycholate Agar (Oxoid, UK) 평판배지에 검체를 도말한 후 Campygen (Oxoid)를 첨가하여 42℃에서 48시간 미호기 배양한 다음 원형 또는 불규칙한 형태의 회백색 집락을 순수 분리하였다. 분리된 집락은 Campylobacter triplex PCR kit (Kogene, Korea), catalase (BD, USA), API campy (bioMériux, France)를 사용해 최종 동정하였다.
- jejuni에 대해 항균제 내성 정도를 확인하였다. C. jejuni의 치료제로 쓰이는 nalidixic acid, ciprofloxacin, erythromycin, azithromycin과 그밖에 cephalothin, imipenem, chloramphenicol, tetracycline 등 8종류의 항균제를 사용하여 디스크 확산법으로 실험하였다(Table 4).
- jejuni 균을 혈액 한천 배지에 도말한 후, 42℃에서 미호기성으로 48시간 배양한 균의 genomic DNA를 QiAmp DNA mini kit (Qiagen, Germany)를 사용해 추출하였다. Ciprofloxacin 내성과 관련된 gyrA 유전자의 돌연변이 여부를 확인하기 위해 Table 1의 gyrA sequencing primer를 사용하여 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea).
- 증폭된 PCR 산물을 micro-fluidic chips에 주입하여 전기영동한 후 Caliper Labchip Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)로 분석하였다. Diversilab Web interface software를 사용해 C. jejuni의 rep-PCR profiles을 98% cutoff로 하여 유전적 연관성을 확인하였다.
- jejuni의 균주는 총 42주로 도내 4개의 종합병원 설사환자(급성설사 질환 실험실 감시사업) 를 대상으로 10균주, 4건의 식중독 outbreak를 통해 분리된 균주가 32균주였다(Table 3). mCCDA 선택배지상에서 원형 또는 불규칙한 형태의 회색 집락을 종특이 유전자 PCR, catalase 양성, API campy 실험을 통해 분리 동정하였다. 월별로 살펴보면 8월에 가장 높은 분리율(40.
- 도내 병원을 대상으로 하는 급성 설사질환 실험실 감시사업과 식중독 outbreak에서 분리한 42균주의 C. jejuni에 대해 항균제 내성 정도를 확인하였다. C.
- , 1999). 따라서 ciprofloxacin 내성과 관련 있는 gyrA 유전자의 돌연변이를 PCR로 확인하였다. 그 결과 42균주 중 40균주(95.
- jejuni에 특이적인 hipO 유전자, 중요 독력인자인 cdtB 유전자를 확인하였고, gyrA 유전자를 PCR과 sequencing 방법으로 확인하여 ciprofloxacin에 대한 내성과의 관련성도 연구하였다. 또한 C. jejuni의 heat-stable 항원을 이용해 혈청형을 분석하였다. 더불어 PFGE와 rep-PCR을 통해 분리된 C.
- , 2002). 또한 C. jejuni의 독성 여부를 확인하기 위해 세포를 비정상적으로 팽창시키는 CDT (cytolethal distending toxin)의 독소 유전자인 cdtB의 존재 여부를 PCR로 확인하였다. CDT는 1988년경 Shigella, E.
- 또한 ciprofloxacin에 내성을 나타내는 균주에서 C. jejuni의 QRDR (quinolone resistance determining region) 부위의 아미노산 서열이 트레오닌에서 이소루신으로 변이 되어있다고 보고한(Zirnstein et al., 1999) 바 PCR 결과 검출된 gyrA 유전자의 돌연변이 여부를 실제로 확인하기 위해 염기서열을 분석하였다. 그 결과 fluoroquinolone계 항생제인 ciprofloxacin 내성과 관련 있는 C.
-
Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction)에 의한 C. jejuni의 유전형 분석
분리된 C. jejuni 42균주의 유전형을 rep-PCR을 통해 확인해 보았다. Rep-PCR은 증폭된 product의 size와 density 둘 다 고려하므로 98% 이상 유사도가 있을 때 같은 유전형을 가진 균으로 판단하였는데, 그 결과 11개의 cluster로 분류되었다(Fig.
- 분리된 집락은 Campylobacter triplex PCR kit (Kogene, Korea), catalase (BD, USA), API campy (bioMériux, France)를 사용해 최종 동정하였다.
- 순수 배양한 C. jejuni의 genomic DNA를 MoBio Ultra clean Microbial DNA isolation kit (MoBio Laboratories, USA)를 사용하여 추출하였다. 추출한 DNA 2 µl, rep-PCR MM1 18 µl, GenAmp 10X PCR buffer 2.
- 유전자의 PCR 반응은 추출한 주형 DNA 2 µl, forward와 reverse primer (20 pmole/µl) 각각 1 µl, PCR mastermix (Bioneer)를 사용하여 최종 20 µl가 되게 하였다.
- PCR 증폭은 validation된 personal thermal cycler (Biometra, Germany)로 수행되었고, PCR 반응 조건은 Table 2와 같다. 증폭된 PCR 산물을 micro-fluidic chips에 주입하여 전기영동한 후 Caliper Labchip Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)로 분석하였다. Diversilab Web interface software를 사용해 C.
- 추출한 DNA 2 µl, rep-PCR MM1 18 µl, GenAmp 10X PCR buffer 2.5 µl, primer mix 2.0 µl, ampliTaq DNA Polymerase 0.5 µl를 혼합해 rep-PCR (Campylobacter kit, bioMérieux)을 실시하였다.
- jejuni에 대한 혈청형은 Campylobacter antisera (Denka seiken, Japan)를 사용하여 passive hemagglutination (PHA)법으로 실시하였다. 혈액 한천배지에서 42℃, 48시간 순수 분리한 C. jejuni의 heat-stable antigen을 제조사의 실험방법으로 추출하여 항원액을 준비하고 fixed chick red blood cells과 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 감작세포를 제조하였다. Microplate well (V bottom) plate에 각각의 항혈청 1방울씩 첨가하고, 각 well에 감작세포를 25 µl를 넣어 잘 혼합한 후 습윤상자에 넣어 30분간 반응시킨 후 응집유무를 판독하였다.
대상 데이터
- 2010년 경기도지역 병원(고대안산 병원, 동수원 병원, 성빈센트 병원, 분당차병원)을 내원한 설사환자 검체(급성설사 질환 실험실 감시사업)에서 분리된 10균주와 4건의 식중독 outbreak에서 분리된 32균주 등 전체 42균주를 연구에 사용하였다. C.
- 항생제 감수성 시험은 표준 디스크 확산법으로 실험하였다. 5% sheep blood를 포함한 Muller-Hinton agar (Oxoid)를 사용하였다. 혈액 배지에서 42℃, 48시간 동안 순수 배양한 균을 TSB (Oxoid)에 부유하여 MacFarland 0.
- 분리된 집락은 Campylobacter triplex PCR kit (Kogene, Korea), catalase (BD, USA), API campy (bioMériux, France)를 사용해 최종 동정하였다. 분리된 균주는 0.2% yeast extract, 20% glycerol, 5% FBS를 첨가한 Brain Heart Infusion (Oxoid) 배지에 넣어 -70℃ deep freezer에 보관하였다가 실험에 사용하였다.
- 사용된 항생제 디스크는 Nalidixic acid (30 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Erythromycin (15 µg), Azithromycin (15 µg), Cephalothin (30µg), Imipenem (10 µg), Chloramphenicol (30 µg), Tetracycline(30 µg)을 사용하였다 (Oxoid).
- 37℃에서 미호기 상태로 48시간 동안 배양 후 억제환의 크기를 측정하여 내성유무를 판독하였다. 정도 관리를 위하여 E. coli ATCC 25922 균주를 함께 실험하였다. 사용된 항생제 디스크는 Nalidixic acid (30 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Erythromycin (15 µg), Azithromycin (15 µg), Cephalothin (30µg), Imipenem (10 µg), Chloramphenicol (30 µg), Tetracycline(30 µg)을 사용하였다 (Oxoid).
데이터처리
- 염색이 끝나면 증류수를 이용하여 1시간동안 탈색을 시킨 후 UV로 확인하였다. 확인된 사진은 Bionumerics 프로그램을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- C. jejuni에 대한 혈청형은 Campylobacter antisera (Denka seiken, Japan)를 사용하여 passive hemagglutination (PHA)법으로 실시하였다. 혈액 한천배지에서 42℃, 48시간 순수 분리한 C.
- C. jejuni의 PFGE 분석은 표준화된 국가 실험실망인 PulseNet 방법으로 실험하였다. 순수 분리된 균을 면봉으로 묻혀낸 다음, 2 ml의 cell suspension TE (100 mM Tris; pH 7.
- 항생제 감수성 시험은 표준 디스크 확산법으로 실험하였다. 5% sheep blood를 포함한 Muller-Hinton agar (Oxoid)를 사용하였다.
성능/효과
- 설사질환 감시사업을 통해 분리된 10균주는 전체 6개의 cluster로 분류되어 다양한 유전형을 가진 균이 발견되었다. 4개의 식중독 outbreak에서 분리된 균주의 유전형을 살펴보면 김포시 식중독(case 1)에서 분리된 12균주는 cluster 5로 모두 같은 유전형이었고, 시흥시 식중독(case 2)에서 분리된 6균주는 cluster 1, 8, 12로 3가지 다른 유전형이 확인되었다.
- Mutated gyrA와 positive gyrA 유전자의 경우 94℃에서 3분간 pre-denaturation한 후 94℃에서 30초간 denaturation, 50℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 20초간 extension 조건으로 30 cycle 반복한 다음 72℃에서 5분간 post-extension하였다. PCR 반응 후 생성물은 cyber green 염색시약이 포함된 2% agasose gel상에서 전기 영동하여 결과를 확인하였다.
- 4). gyrA 돌연변이 PCR 결과와 마찬가지로 설사질환 감시사업 분리균주 9번과 수원시 식중독(case 3) 분리균주 29번만 wild type C. jejuni와 염기서열이 같았고, 나머지 40균주(95.2%)에서 돌연변이가 확인되었다(Fig. 4 and Table 5).
- 2%)가 PCR 실험결과 검출되었다. gyrA 돌연변이 유전자는 ciprofloxacin 내성과 연관이 깊으며, 디스크 확산법에 의해 실험한 결과 gyrA 돌연변이 유전자가 검출된 40균주(95.2%)에서 실제 ciprofloxacin에 대해 내성을 보였다. 분리된 42균주 C.
- jejuni 42균주의 유전적 특성과 혈청형, 항균제 내성율을 분석하였다. hipO 종특이 유전자(100%), cdtB 독소 유전자(100%)가 검출되었고, gyrA 돌연변이 유전자(95.2%)가 PCR 실험결과 검출되었다. gyrA 돌연변이 유전자는 ciprofloxacin 내성과 연관이 깊으며, 디스크 확산법에 의해 실험한 결과 gyrA 돌연변이 유전자가 검출된 40균주(95.
- 따라서 ciprofloxacin 내성과 관련 있는 gyrA 유전자의 돌연변이를 PCR로 확인하였다. 그 결과 42균주 중 40균주(95.2%)에서 gyrA 돌연변이 유전자가 검출되었다. 반면 positive gyrA 유전자는 42균주 모두에서 정상적으로 확인되었다(Fig.
- , 1999) 바 PCR 결과 검출된 gyrA 유전자의 돌연변이 여부를 실제로 확인하기 위해 염기서열을 분석하였다. 그 결과 fluoroquinolone계 항생제인 ciprofloxacin 내성과 관련 있는 C. jejuni의 gyrA QRDR 단백질의 86번 아미노산 코돈 부위가 ACA (트레오닌)에서 ATA (이소루신)로 변이되어 있음을 확인하였다(Fig. 4). gyrA 돌연변이 PCR 결과와 마찬가지로 설사질환 감시사업 분리균주 9번과 수원시 식중독(case 3) 분리균주 29번만 wild type C.
- 김포시 식중독(case 1)의 경우 PFGE 결과와 마찬가지로 분리된 12균주가 모두 동일한 유전형(cluster 10)으로 확인되었고, 광명시 식중독(case 4)의 경우도 분리된 12균주가 cluster 7, 9의 두 가지의 유전형으로 확인되었다. 그에 반해 시흥시(case 2)와 수 원시(case 3) 식중독의 경우는 PFGE와는 다르게 각각 2가지 (cluster1, 4)와 1가지(cluster 1)로 확인되었다.
- jejuni의 혈청형을 분석한 결과 4가지 타입으로 분류되었는데, HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O)로 확인되었다. 도내에서 분리한 C. jejuni 42균주의 유전형을 rep-PCR과 PFGE로 확인한 결과 PFGE에 의해서는 12 cluster, rep-PCR에 의해서는 11 cluster의 유전형으로 구분되었다.
- 따라서 C. jejuni의 gyrA 유전자가 ACA (트레오닌)에서 ATA (이소루신)로 돌연변이 되면 nalidixic acid와 ciprofloxacin 항균제에 내성을 보임을 알 수 있다. 이는 다른 그람 음성균과는 달리 nalidixic acid에 내성인 C.
- 6% (41균주) 감수성을 보였다. 또한 C. jejuni의 혈청형을 분석한 결과 4가지 타입으로 분류되었는데, HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O)로 확인되었다. 도내에서 분리한 C.
- 또한 수원시 식중독(case 3)은 2균주가 각각 다른 유전형(cluster 10, 11)을 가지고 있었고, 광명시 식중독(case 4)은 cluster 3, 9로 2가지 유전형을 가진 균이 확인되었다. 즉 두 가지 이상의 유전형을 가진 C.
- 2%)에서 gyrA 돌연변이 유전자가 검출되었다. 반면 positive gyrA 유전자는 42균주 모두에서 정상적으로 확인되었다(Fig. 3 and Table 5).
- 2%)에서 실제 ciprofloxacin에 대해 내성을 보였다. 분리된 42균주 C. jejuni에 대한 gyrA 유전자의 염기서열을 분석한 결과 ciprofloxacin에 내성을 가진 40균주에서 아미노산 서열이 ACA (트레오닌)에서 ATA (이소루신)으로 돌연변이 되어있음을 확인하였다. 하지만 대체 치료제인 erythromycin과 azithromycin에 대해서는 97.
- 2%)가 내성을 보였다(Table 4). 분리된 C. jejuni 대부분이 이들 항생제에 높은 내성율을 보였고, 감수성을 나타내는 균주는 설사질환 감시 사업 분리 균주 9번과 수원시 식중독(case 3) 분리 균주 29번이었다(Table 5). 이 2균주는 gyrA 돌연변이 유전자 PCR 결과 돌연변이 유전자가 검출되지 않았고, gyrA DNA 염기서열 분석 결과 정상 유전자를 가진 균주와 일치하였다(Table 5).
- 실험결과 설사질환 감시사업과 식중독 outbreak에서 분리한 42균주 모두에서 C. jejuni에 특이적인 hipO 유전자와 독소 유전자인 cdtB가 100% 검출되었다(Fig. 2 and Table 5).
- jejuni 대부분이 이들 항생제에 높은 내성율을 보였고, 감수성을 나타내는 균주는 설사질환 감시 사업 분리 균주 9번과 수원시 식중독(case 3) 분리 균주 29번이었다(Table 5). 이 2균주는 gyrA 돌연변이 유전자 PCR 결과 돌연변이 유전자가 검출되지 않았고, gyrA DNA 염기서열 분석 결과 정상 유전자를 가진 균주와 일치하였다(Table 5).
- 전체 분리된 42균주의 C. jejuni DNA를 SmaI 제한효소로 처리한 후 PFGE 실험법으로 유전형을 분석한 결과 12개의 cluster로 분류되었다(Fig. 5). 설사질환 감시사업을 통해 분리된 10균주는 전체 6개의 cluster로 분류되어 다양한 유전형을 가진 균이 발견되었다.
- 5%)에서 4종의 혈청형이 확인되었으며 그 분포는 Table 6과 같다. 확인된 혈청형은 HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O)형이며, 이 중 가장 많이 분포된 혈청형은 HS19(O)형으로 14.3%였다. 그러나 전체 42균주 중 27균주(64.
후속연구
- 3%였다. 그러나 전체 42균주 중 27균주(64.3%)에서는 혈청형이 확인되지 않았는데, 혈청형 실험에 사용된 Campylobacter antisera (Denka Seiken) 이외에 혈청형이 존재할 수 있으며 PHA법의 감도상 문제일 수도 있어 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 6%)가 감수성을 보였다(Table 4). 아직까지 erythromycin과 azithromycin이 치료제로 유효함을 알 수 있었으나, 내성균주가 1균주 발견되어 C. jejuni 감염 치료 시 이들 항균제에 대한 내성 여부도 확인이 필요할 것으로 생각된다. 이는 부산(Park et al.
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