[논문]페놀성 화합물을 이용한 현지초의 UPLC 다성분 동시분석 개발

김세건; 라미차네 라마칸타; 이경희; 판데야 프라카스 라즈; 심상연; 정현주

페놀성 화합물을 이용한 현지초의 UPLC 다성분 동시분석 개발
Simultaneous Analysis of Phenolic Compounds in Geranium thunbergii Using UPLC 원문보기

생약학회지, v.49 no.1, 2018년, pp.15 - 22

김세건 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 라미차네 라마칸타 (원광대학교 약학대학 한약학과 및 원광한약연구소) , 이경희 (원광대학교 약학대학 한약학과 및 원광한약연구소) , 판데야 프라카스 라즈 (원광대학교 약학대학 한약학과 및 원광한약연구소) , 심상연 (원광대학교 약학대학 한약학과 및 원광한약연구소) , 정현주 (원광대학교 약학대학 한약학과 및 원광한약연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to develop a UPLC method for simultaneous analysis of 8 phenolic compounds including gallic aicd (1), protocatechuic acid (2), methyl gallate (3), ellagic acid (4), kaempferol-3-arabinofranosyl-7-rhamnoside (5), kaempferitrin (6), afzelin (7) and kaempferol-7-rhamnoside (8) isolated from Geranium thunbergii which has been traditionally used as anti-diarrheal agent. The UPLC method was optimized and validated using Halo C18 column ($4.6{\times}100mm$, $2.7{\mu}m$) consisting of MeOH and 0.1% formic acid at 260 nm in 25 minutes. In quantitative analysis of 8 compounds in MeOH extract of G. thunbergii, contents of 4-6 were 12.39, 20.52 and 21.45 mg/g, respectively. These compounds were measured as major phenolic compounds in G. thunbergii and can be useful as marker compounds for its quality control. These results suggest that the UPLC method can be contributed as basic data for quality evaluation of herbal preparations.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Chemical structures of compounds 1-8 isolated from MeOH extract of G. thunbergii.
그림 Fig. 2. UPLC chromatograms of (A) standard mixture 1-8 and (B) MeOH extract of G. thunbergii.
표 Table I. Chromatographic conditions for compounds 1-8 in MeOH extract of G. thunbergii
그림 Fig. 3. UV spectra of eight standards (1-8, black curve) and MeOH extract of G. thunbergii (red curve).
표 Table II. Analyzed data of linearity regression, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for compounds 1-8
표 Table III. Precision data of compounds 1-8 in different concentrations
표 Table IV. Recovery data of compounds 1-8 in different concentrations
표 Table V. Contents of compounds 1-8 in MeOH extract of G.thunbergii

AI 본문요약
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문제 정의

9-12) 본 연구에서는 현초로부터 분리된 8종의 페놀성 화합물을 사용하여 기존의 HPLC보다 고성능이면서 분석시간의 단축, 용매소비를 줄일 수 있는 경제성 및 성분 분리도가 우수한 UPLC(ultra performance liquid chromatography)로 단일성분에 대한 개별적인 분석이 아닌 다성분 동시분석법을 개발하여 신속하고 정확하며 효율적인 현초의 품질관리 및 품질평가의 기준을 마련하고자 하였다.
함량평가 − 본 연구에서는 현초의 주요성분으로 알려진 페놀성 화합물의 프로파일 작성 및 품질평가를 위한 다성분 동시분석법을 개발하고자 하였다.

제안 방법

2 μm PTFE membrane filter를 이용하여 여과한 후 분석에 사용하였다. 8종의 화합물에 대한 UPLC 분석은 diode array detector, binary pump, autosampler가 장착된 Waters(Minneapolis, MN, USA) ACQUITY UPLC I-Class를 사용하였으며 분석조건은 Table I과 같다.
UPLC를 이용하여 현초 MeOH 추출물 내 페놀성 화합물 gallic acid (1), protocatechuic acid (2), methyl gallate (3), ellagic acid(4), kaempferol-3-arabinofranosyl-7-rhamnoside (5), kaempferitrin (6), afzelin (7), kaempferol-7-rhamnoside (8) 등 8종의 화합물에 대한 프로파일 작성 및 다성분 동시분석법을 Halo C18 (4.6×100 mm, 2.7 μm)컬럼, 0.1% formic acid가 함유된 water와 MeOH을 이동상으로 하여 최적화 및 분석법을 검증하였다.
n-BuOH 분획물 150 g에 대하여 CHCl3-MeOH(7:1→0:1, v/v)로 silica gel column chromatography를 실시한 다음 10개의 소분획(GTB1-10)으로 나누고, GTB6에 대하여 10% MeOH를 이동상으로 사용하고 Watchers RP18 flash cartridge column (40-60 μm, 30 g, Isu industry co., Seoul, Korea)이 장착된 medium pressure liquid chromatography(MPLC)를 이용하여 화합물 1(378 mg), 화합물 2(51 mg) 및 화합물 3(640 mg)을 얻었다.
분석조건 최적화 − 현초 MeOH 추출물로부터 분리된 8종의 페놀성 화합물 gallic acid (1), protocatechuic acid (2), methyl gallate (3), ellagic acid (4), kaempferol-3-arabinofranosyl-7-rhamnoside (5), kaempferitrin (6), afzelin (7) 및 kaempferol-7-rhamnoside (8)에 대한 UPLC 분석법을 최적화하고자 다양한 용매조성의 변화(pH 변화 등), 컬럼의 종류, 컬럼 온도 등을 탐색하였다(data 미제시).
정밀성(Precision) − 화합물 1-8에 대하여 직선성에 사용한 표준용액의 3가지 농도(7.81-250.0 μg/mL)를 선택하여 일 내(intra day) 및 일간(inter day precision) 반복 분석의 정밀도를 평가하였다.
정밀성은 직선성 범위 내에 있는 3가지 농도에서 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 정밀도를 측정하여 상대표준차(relative standard deviation, RSD %) 10% 이내에서 정밀성을 평가하였으며,17) 정확성은 8종 표준품의 3가지 농도를 첨가하여 ±15% 범위에서 회수율(recovery)로 평가하였다.
정확성(Accuracy) − 현초 MeOH 추출물에 화합물 1-8를 7.81-250.0 μg/mL의 범위에서 3가지 농도를 선택하여 첨가한 후 실험결과의 참값에 근접한 정도를 측정하기 위하여 회수율(Recovery)로 정확성을 평가하였다.
직선성(Linearity), 검출한계(Limit of detection) 및 정량한계(Limit of quantification) − 화합물 1-8를 7.81-125.0, 3.91-62.50, 7.81-125.0, 15.63-250.0, 31.25-500.0, 31.25-500.0, 7.81-125.0, 7.812-125.0 μg/mL로 각각 만든 후 UPLC로 분석하여 검량선의 상관계수(R2)로 직선성을 평가하였다.
분석법 검증 − 현초 내 8종의 화합물에 대한 UPLC 분석법 밸리데이션은 식품의약품안전처의 “의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인”에 따라 정량시험법 밸리데이션 파라미터인 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 정량한계(limit of quantification) 및 검출한계(limit of detection, LOD)를 평가하였다. 특이성은 8종의 표준품과 시료 내 동일한 머무름 시간을 가지는 피크의 UV spectrum 패턴의 일치여부로 판단하였으며, 직선성은 8종 표준품의 5개 구간 농도를 설정하여 상관계수(R²) 0.99 이상에서 평가하였다. 검출한계와 정량한계는 signal대 noise 비가 3:1과 10:1에서 각각 평가하였다.
함량평가 − 본 연구에서는 현초의 주요성분으로 알려진 페놀성 화합물의 프로파일 작성 및 품질평가를 위한 다성분 동시분석법을 개발하고자 하였다. 현초 MeOH 추출물로부터 단리된 8종의 화합물을 이용하여 UPLC 다성분 동시 분석법을 최적화였고 밸리데이션을 통하여 분석법에 대한 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성을 확인하였다. 확립된 분석법을 적용하여 현초 MeOH 추출물 내 화합물 1-8의 함량분석결과(Table V), 5(kaempferol-3-arabinofranosyl-7-rhamnoside) 및 6(kaempferitrin)이 현초 MeOH 추출물 내 각각 20.

대상 데이터

ODS-A(75 μm)는 YMC(Kyoto, Japan)로부터 구입하였으며, NMR 측정 용매는 Cambridge Isotope Laboratories(Andover, MA, USA)의 것을 사용하였다.
분석용매 methanol과 water는 Burdik & Jackson(Muskegon, MI)의 HPLC 등급을 사용하였다.
시약 − 현초 구성성분의 분리는 SK chemicals(Seongnam, Korea)의 methanol, chloroform, n-butanol을 사용하였고, silica gel(40-63 μm, Art. No. 9385), TLC plate(layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm, Art. No. 5715)는 Merck(Kenilworth, NJ, USA)의 제품을 사용하였다.
실험재료 − 현초(G. thunbegii)는 광주에 소재한 약업사에서 구입하여 원광대학교 정현주 교수가 감별하였으며, 식물표본(OPC 10-0306)은 원광대학교 약학대학 한약학과 표본실에 보관하였다.

이론/모형

분석법 검증 − 현초 내 8종의 화합물에 대한 UPLC 분석법 밸리데이션은 식품의약품안전처의 “의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인”에 따라 정량시험법 밸리데이션 파라미터인 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 정량한계(limit of quantification) 및 검출한계(limit of detection, LOD)를 평가하였다.

성능/효과

그 결과, 이동상을 MeOH와 0.1% formic acid의 혼합용매 조건과 Halo C18(4.6×100 mm, 2.7 μm) 역상컬럼에서 컬럼 오븐 온도를 50oC로 설정하였을 때, 지표성분의 양호한 피크분리도를 가지는 것으로 확인되었고, 검출파장 260 nm에서 25분 내에 모든 지표성분의 분석이 가능하였으며, 1-8의 retention time은 각각 1.45, 2.78, 4.27, 15.07, 19.33, 19.77, 22.05, 23.82분에 검출되었다(Fig. 2).
0 μg/mL)를 선택하여 일 내(intra day) 및 일간(inter day precision) 반복 분석의 정밀도를 평가하였다. 그 결과, 일내 및 일간 정밀도의 상대표준편차(RSD) 값은 0.06-3.96%, 0.11-3.18%로 각각 나타내어 4% 미만의 우수한 정밀성을 가지는 것으로 확인되었다(Table III).
0 μg/mL로 각각 만든 후 UPLC로 분석하여 검량선의 상관계수(R²)로 직선성을 평가하였다. 그 결과, 화합물 8종에 대한 검량선의 상관계수는 0.99이상으로 우수한 직선성을 나타내었으며 정량 할 수 있는 회귀방정식을 작성하였다(Table I). 화합물 8종의 검출한계와 정량한계는 0.
그 결과, 화합물 8종에 대한 회수율의 범위는 96.72%에서 104.18%로 나타났으며 화합물 5(kaempferol-3-arabinofranosyl-7-rhamnoside)의 62.5 μg/mL를 첨가하였을 때 참값에 가장 근접한 100.07%의 회수율을 보였고 전체적으로 5% 이내의 우수한 정확도를 나타내었다(Table IV).
특이성(Specificity) − PDA(photo diode array, 200-400 nm) 검출기로 지표성분과 시료 내 동일한 retention time을 가지는 피크의 UV spectrum을 추출하여 패턴을 비교한 결과, 동일한 UV 흡수패턴을 가지는 것으로 확인되었으며 현초 내 8종의 페놀성 화합물에 대한 UPLC 분석법은 특이성을 나타내었다(Fig. 3).
39 mg/g로 탄닌 계열의 주요물질로 확인되었다. 화합물 4-6은 현초 MeOH 추출물 내 5%이상 차지하는 주요성분으로 확인되었으며 이외의 화합물 5종은 1% 미만의 함유량을 나타내어 3종의 화합물이 페놀성 화합물의 주요 성분임이 확인되었다. 생약의 품질관리 기준 물질은 기능성 성분 또는 주성분을 지표물질로 설정하는데, 본 분석결과를 통하여 8종의 페놀성 화합물 중 화합물 4-6은 현초 품질관리 및 이를 이용한 생약제제의 품질평가를 위한 주요 지표물질로 설정 가능함을 알 수 있었으며 시중에 유통되는 국산 및 수입산 현초에 대한 추가 분석연구가 필요할 것으로 사료된다.
1% formic acid가 함유된 water와 MeOH을 이동상으로 하여 최적화 및 분석법을 검증하였다. 화합물 4-6은 현초 MeOH 추출물에 존재하는 주요물질로 확인되었으며 현초의 품질관리를 위한 지표물질로 설정 가능함을 알 수 있었다. 이러한 분석결과는 한약재 및 생약제제에 대한 품질평가를 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
화합물 8종의 검출한계와 정량한계는 0.04-0.10 μg/mL와 0.12-0.22 μg/mL로 감도가 높았으며, 미량성분도 분석이 가능함을 알 수 있었다(Table II).
현초 MeOH 추출물로부터 단리된 8종의 화합물을 이용하여 UPLC 다성분 동시 분석법을 최적화였고 밸리데이션을 통하여 분석법에 대한 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성을 확인하였다. 확립된 분석법을 적용하여 현초 MeOH 추출물 내 화합물 1-8의 함량분석결과(Table V), 5(kaempferol-3-arabinofranosyl-7-rhamnoside) 및 6(kaempferitrin)이 현초 MeOH 추출물 내 각각 20.52, 21.45 mg/g로 가장 많은 함유량을 가지는 플라보노이드 계열 물질이었으며 4(ellagic acid)는 12.39 mg/g로 탄닌 계열의 주요물질로 확인되었다. 화합물 4-6은 현초 MeOH 추출물 내 5%이상 차지하는 주요성분으로 확인되었으며 이외의 화합물 5종은 1% 미만의 함유량을 나타내어 3종의 화합물이 페놀성 화합물의 주요 성분임이 확인되었다.

후속연구

화합물 4-6은 현초 MeOH 추출물 내 5%이상 차지하는 주요성분으로 확인되었으며 이외의 화합물 5종은 1% 미만의 함유량을 나타내어 3종의 화합물이 페놀성 화합물의 주요 성분임이 확인되었다. 생약의 품질관리 기준 물질은 기능성 성분 또는 주성분을 지표물질로 설정하는데, 본 분석결과를 통하여 8종의 페놀성 화합물 중 화합물 4-6은 현초 품질관리 및 이를 이용한 생약제제의 품질평가를 위한 주요 지표물질로 설정 가능함을 알 수 있었으며 시중에 유통되는 국산 및 수입산 현초에 대한 추가 분석연구가 필요할 것으로 사료된다.
화합물 4-6은 현초 MeOH 추출물에 존재하는 주요물질로 확인되었으며 현초의 품질관리를 위한 지표물질로 설정 가능함을 알 수 있었다. 이러한 분석결과는 한약재 및 생약제제에 대한 품질평가를 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	현초란 무엇인가?	현초(Geranium thunbergii, 玄草)는 노관초(老鸛草) 또는 이질풀로 불리는 여러해살이풀로 지상부를 약용으로 사용하며, 한국, 대만, 일본 등 아시아에 분포하는 식물성 생약이다. 현초의 성미(性味)는 평(平)하고 고(苦)·미신(微辛)하며, 전통적으로 장염에 의한 설사, 종기, 피부병 등의 치료에 사용되어 왔다.
	생약으로 사용하는 천연물 중 현초는 어디에 사용되고 있는가?	현초(Geranium thunbergii, 玄草)는 노관초(老鸛草) 또는 이질풀로 불리는 여러해살이풀로 지상부를 약용으로 사용하며, 한국, 대만, 일본 등 아시아에 분포하는 식물성 생약이다. 현초의 성미(性味)는 평(平)하고 고(苦)·미신(微辛)하며, 전통적으로 장염에 의한 설사, 종기, 피부병 등의 치료에 사용되어 왔다. 최근까지의 연구결과에 의하면 현초 알콜추출물은 항산화 효과, 간보호 효과, 항비만 효과, 항염 효과 등의 약리작용을 가지는 것으로 보고되었으며, 구성성분으로는 kaempferitrin, quercetin, (-)-epicatechin, kaempferol-7-rhamnoside, brevifolin, corilagin, pyrogallol, ellagitannin, geraniin, gallic acid, protocatechuic acid 등의 페놀성 화합물이 주요성분으로 알려져 있다.
	현초 알콜추출물의 구성성분은 무엇인가?	현초의 성미(性味)는 평(平)하고 고(苦)·미신(微辛)하며, 전통적으로 장염에 의한 설사, 종기, 피부병 등의 치료에 사용되어 왔다. 최근까지의 연구결과에 의하면 현초 알콜추출물은 항산화 효과, 간보호 효과, 항비만 효과, 항염 효과 등의 약리작용을 가지는 것으로 보고되었으며, 구성성분으로는 kaempferitrin, quercetin, (-)-epicatechin, kaempferol-7-rhamnoside, brevifolin, corilagin, pyrogallol, ellagitannin, geraniin, gallic acid, protocatechuic acid 등의 페놀성 화합물이 주요성분으로 알려져 있다.2-5) 다양한 생리활성을 가진 현초는 현재 식품의약품안전처의 ‘대한민국약전외 한약생약규격집’에서 대조생약을 기준으로 TLC(thin layer chromatography)를 통하여 페놀성 화합물의 유무를 판단하는 확인시험법만이 존재할 뿐 지표성분에 대한 기준이 규정되어 있지 않다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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