[논문]노루오줌으로부터 Bergenin의 함량 분석 및 에탄올 추출물의 자궁경부암세포 성장 억제 효과

김아현; 노종현; 우경완; 강주은; 심미옥; 김민석; 함성호; 조현우

노루오줌으로부터 Bergenin의 함량 분석 및 에탄올 추출물의 자궁경부암세포 성장 억제 효과
Quantitative Analysis of Bergenin in Astilbe rubra and Growth Inhibition Effect of Ethanol Extract on Hela Cells 원문보기

생약학회지, v.49 no.1, 2018년, pp.47 - 54

김아현 (한약진흥재단 한약자원본부) , 노종현 (한약진흥재단 한약자원본부) , 우경완 (한약진흥재단 한약자원본부) , 강주은 (한약진흥재단 한약자원본부) , 심미옥 (한약진흥재단 한약자원본부) , 김민석 (한약진흥재단 한약자원본부) , 함성호 (한약진흥재단 한약자원본부) , 조현우 (한약진흥재단 한약자원본부)

Abstract ▼ AI-Helper

Astilbe rubra (AR) is a perennial, belongs to the Saxifragaceae family, it contains tannin and triterpene. AR has been used in republic korea to improve toxication, fever, pain and convulsion. Recently, number of natural products have been analyzed for potential pharmacological activities including anti-cancer, anti-obesity and anti-diabetic medication. Consequently, we investigated the growth inhibition effect of Astilbe rubra water extract (WAC), ethanol extract (EAC) and bergenin on Hela cell (human adenocarcinoma cell). From whole plant of A. rubra, bergenin was isolated by column chromatography and its structures were identified by $^1H$, $^{13}C$ NMR and IT TOF-ESI MS. High extraction efficiency of bergenin was shown at 0.95% under 60 min reflux extraction with 50% MeOH. The MTS assay showed that EAC (ethanol extract) treatment increased cell death in a dose-dependent manner. Moreover, EAC treatment on Hela cell increased apoptotic cell death and caspase-3 activity. Results suggest that EAC has growth inhibition effect on Hela cells, but not WAC and bergenin. $500{\mu}g/mL$ EAC treatment inhibited Hela cell at $60.2{\pm}1.5%$.

주제어

표/그림 (10)

표 Table I. UPLC condition of bergenin
그림 Fig. 1. Chemical structures of bergenin.
그림 Fig. 2. TLC chromatogram of A. rubra and bergenin.
표 Table III. The contents of bergenin by extraction time and methods
표 Table II. The contents of bergenin by extract solvents
그림 Fig. 3. HPLC chromatogram of bergenin (A) and A. rubra (B).
그림 Fig. 4. Calibration curve of bergenin.
표 Table IV. Calibration data for analysis of bergenin
그림 Fig. 5. Cytotoxic evaluation of extracts and bergenin on Hela cells.
그림 Fig. 6. EAC increases apoptotic cell death and caspase-3 activity in Hela cells. Hela cells were treated with various concentration for 24 h.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 민간생약으로 사용중인 노루오줌의 품질 평가를 위한 기준 설정을 위해 지표성분 분리, 함량 분석 및 확인시험을 실시하여 제안하고자 하였다. 또한 노루오줌 MeOH 추출물에서 췌장암 세포주(AsPC-1 cell)에 농도의존적으로 유의성을 나타내어,¹⁷⁾ 자궁경부암 세포주(Hela cel) 에 노루오줌 물 추출물, 에탄올 추출물과 지표 성분인 bergenin을 처리하여 Hela 세포에 대한 세포성장억제 효과 및 기전을 확인하였다.

제안 방법

24시간 뒤 MTS 시약 20 μL를 넣고 2시간 동안 배양한 후 microplate reader infinite® 200 PRO(TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율은 정상대조군에 대한 생존율로 표시하였다.
29) 총 20 μg의 단백질 샘플을 사용하여 제조사가 제시한 protocol에 따라 실험을 수행하였다.
FACS Analysis − Annexin V-FITC apoptosis detection kit(Enzo, Farmingdale, USA)를 사용하였다. Apoptosis의 비율을 측정하기 위해 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 annexin V-FITC와 propidium iodide(PI) 형광다이로 염색시켰으며, 염색된 세포는 Novocyte flow cytometer(ACEA, San diego, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
Hela 세포를 96 well plate에 1×105 cells/mL 농도가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% 배양기에서 24시간 배양한 후 추출물을 31.25, 62.5, 125, 250 그리고 500 μg/mL 농도로, 분리 물질을 6.25, 12.5, 25, 50 그리고 100 μM 농도로 24시간 동안 처리하고 배양하였다.
MTS Assay – 세포생존율은 CellTiter 96® aqueous one solution Cell proliferation assay kit(Promega, Fitchburg, WI, USA)를 사용하여 측정하였다.
세포배양 − 실험에 사용된 Hela 세포(human adenocarcinoma cell)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다. RPMI 1640 배지(Thermo, Waltham, MA, USA)에 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin/ streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 5%, CO₂ 조건에서 배양하였다.
0 g을 칭량하고, 추출 용매별(MeOH, 50% MeOH, H₂O, EtOH)로 각각 10 mL을 첨가하여 30분간 초음파 추출, 여과 후 사용하였다. 각 용매에 따른 추출 효율은 3회 반복 분석하였다. 추출 조건(초음파 30분, 30분 2회, 60분과 환류 30분, 30분 2회, 60분 추출)에 따른 함량 분석은 동일한 방법으로 칭량 후 추출 효율이 가장 좋았던 용매를 25 mL 첨가, 여과 후 정확하게 25 mL로 하여 검액으로 하였다.
검량선 및 직선성(Linearity) − 지표 물질 bergenin의 표준액 750, 375, 187.5, 93.75, 46.875 μg/mL 농도를 이용하여UPLC로 실험하였으며 농도에 따른 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였다.
검액 및 표준액 10 μL를 박층크로마토그래프용 실리카겔(형광제 첨가)을 써서 만든 박층판에 점적하였다.
노루오줌에탄올 추출물은 125, 250 그리고 500 μg/mL 농도로 24시간동안 처리한 뒤 annexinV-PI 염색을 통해 flow cytometry 에서 apoptosis와 necrosis의 비율을 측정하였다.
노루오줌의 전초로부터 지표 물질인 bergenin을 colum chromatography법을 이용하여 분리하였고, ¹H, ¹³C NMR과 TOF-ESI MS를 이용하여 구조 동정하였다. 50% MeOH 용매로 60분 환류 추출 시 가장 높은 효율을 나타냈으며, 지표 물질은 0.
6A). 다음으로 세포자멸사를 유도하는 단백질인 caspase-3의 활성도를 측정하기 위해 caspase-3 activity assay를 수행하였다. EAC를 31.
본 연구에서는 민간생약으로 사용중인 노루오줌의 품질 평가를 위한 기준 설정을 위해 지표성분 분리, 함량 분석 및 확인시험을 실시하여 제안하고자 하였다. 또한 노루오줌 MeOH 추출물에서 췌장암 세포주(AsPC-1 cell)에 농도의존적으로 유의성을 나타내어,¹⁷⁾ 자궁경부암 세포주(Hela cel) 에 노루오줌 물 추출물, 에탄올 추출물과 지표 성분인 bergenin을 처리하여 Hela 세포에 대한 세포성장억제 효과 및 기전을 확인하였다.
Inc(USA)의 CD₃OD를 사용하였다. 분자량 확인을 위해 이용한 ESI-mass spectra는 schimadzu LCMS-IT-TOF mass spectrometer를 사용하였다. 일반성분 분석을 위한 건조기 (VS-1202D3, Jeiotech, Korea), 회화로(MF-21G, Daehan, Korea), 초음파추출기(UC-20, Branson, USA)이며, 확인시험에는 반자동박층크로마토그래프(ATS4&ADC2, Camag, Swiss)를 사용하였다.
세포생존율 분석 − Hela 세포에 대해 노루오줌 물 추출물(WAC), 노루오줌 에탄올 추출물(EAC)과 분리 물질인 bergenin의 암세포 사멸 효과를 확인하기 위해 MTS assay 를 수행하였다.
세포용해액은 원심분리기로 4℃, 13,000×g 조건에서 20분간 원심분리 하였고, 단백질 농도를 bradford assay를 이용하여 측정하였다.
이 결과를 바탕으로 WAC와 bergenin은 Hela 세포주에 대해 항암 효능이 없는 것으로 판단되며, EAC는 실험 농도를 31.25, 62.5, 125, 250 그리고 500 μg/mL로 정하였고, EAC 처리에 따른 apoptosis와 necrosis 중 기전 연구를 진행하였다.
이 중 NRE 4(4 g)를 glass column(4 cm×60 cm)에 ODS gel(20 μm, 0.4 kg, YMC, Japan)을 충진시키고 H2O(in 0.02% formic acid)-ACN 혼합용매(90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50)를 사용해 column chromatography를 진행하여 7개의 소분획물 (NRE 4-1~7)을 얻었다.
검량선은 y=ax+b(y: peak 면적, x: 시료농도, a: 직선의 기울기, b: y절편)의 형태로 작성하였다. 작성된 검량선의 상관계수를 이용하여 직선성을 검토하였다.
전개 용매 ethyl acetate·acetic acid·formic acid·water(50:5:5:7.5)에 약 10 cm 전개한 후 365 nm에서 관찰하였다.
지표물질 분리 − LC-MS 및 TLC로 확인한 후 주요성분이 함유되어 있는 ethyl acetate 분획물(24 g)을 ODS gel (50 μm, 0.8 kg, YMC, Japan)이 충진된 glass column(16 cm ×80 cm)을 이용하여 H2O(in 0.02% formic acid)-ACN 혼합 용매(80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 0:100)로 open column chromatography를 진행하였으며, LC-MS 및 TLC로 스크리닝하여 11개의 소분획물(NRE 1~11)로 나누었다.
각 용매에 따른 추출 효율은 3회 반복 분석하였다. 추출 조건(초음파 30분, 30분 2회, 60분과 환류 30분, 30분 2회, 60분 추출)에 따른 함량 분석은 동일한 방법으로 칭량 후 추출 효율이 가장 좋았던 용매를 25 mL 첨가, 여과 후 정확하게 25 mL로 하여 검액으로 하였다.
함량 분석은 UPLC(Acquity UPLC System, Waters, USA)를 사용하였으며, column은 ACQUITY UPLC HSS T3(C18) column(1.8 μm, 2.1 mm×100 mm, Waters)을 이용하였다.
확인시험 − 박층크로마토그래프법을 진행하였으며 분말시료 약 1.0 g에 메탄올 10 mL을 첨가하여 30 분간 초음파추출하여 여과 후 검액으로 하였고, 지표 물질 bergenin을 1.0 mg을 정밀하게 달아 메탄올 10 mL로 녹여 표준액으로 하였다.

대상 데이터

Column chromatography의 충진제는 YMC gel ODS-A(50 μm)와 YMC gel ODS-A(20 μm)를 사용하였다.
세포배양 − 실험에 사용된 Hela 세포(human adenocarcinoma cell)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용된 노루오줌 전초는 2015년 8월 전남 장흥(위도: 34.53'23"N, 경도: 126.91'59"E)에서 채취하였으며, 목포대학교 한약자원학과 김휘 교수에게 의뢰하여 동정하여 사용하였다.
일반성분 분석을 위한 건조기 (VS-1202D3, Jeiotech, Korea), 회화로(MF-21G, Daehan, Korea), 초음파추출기(UC-20, Branson, USA)이며, 확인시험에는 반자동박층크로마토그래프(ATS4&ADC2, Camag, Swiss)를 사용하였다.
Column chromatography의 충진제는 YMC gel ODS-A(50 μm)와 YMC gel ODS-A(20 μm)를 사용하였다. 지표성분의 분리에 사용된 preparative HPLC는 Agilent A1200 series(Agilent, U.S.A)이며, 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum은 Varian 500 spectrometer(¹H: 500 MHz, ¹³C: 125 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR 용매는 Sigma. Inc(USA)의 CD₃OD를 사용하였다.
표준액 조제 − 노루오줌 전초로부터 분리한 지표 물질 bergenin을 MeOH 에 녹여 750 μg/mL~46.875 μg/mL의 다섯 농도에 이르는 표준액을 제조하여 사용하였다.

데이터처리

Means values±SD from triplicate separated experiments are shown. *Means with difference letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
일원변량분석(one way ANOVA)을 실시하였으며, 유의성이 있는 경우 p<0.05 수준에서, Duncan’s multiple range test를 실시하였다.
통계 처리 − 통계 처리는 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 군 간의 유의성을 검정하기 위하여 SPSS(Statistical Package for Social Science Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 사용하였다.

이론/모형

(A-C) Hela cells were treated with extracts and bergenin for various concentration. Cell viability was measured by MTS assay. Means values±SD from triplicate separated experiments are shown.
일반성분 − 대한민국약전(제 11개정) 일반시험법 중 28. 생약시험법에 준하여 각각의 건조감량, 엑스함량(묽은에탄올엑스), 회분, 산불용성회분 시험법에 따라 실시하였다.

성능/효과

p class="0">자궁경부암(uterine cervical cancer)은 전 세계적으로 여성 에게 발병되는 암 중 두번째로 이로 인한 사망률이 60%를 차지한다고 알려져 있으며, 우리나라에선 위암과 유방암에 이어 다섯 번째를 차지한다.^1,2)현재 자궁경부암의 치료는 병의 진행 정도와 암종의 크기와 조직 형태에 따라 달라진다. 크게 3가지 단계로 나눌 수 있으며, 수술 또는 화학방사선요법을 통해 치료하지만 수술의 경우 화학방사선요법과 다르게 환자의 난소를 유지시킬 수 있을 뿐만 아니라 섬유화가 유발되지 않는다.
C NMR과 TOF-ESI MS를 이용하여 구조 동정하였다. 50% MeOH 용매로 60분 환류 추출 시 가장 높은 효율을 나타냈으며, 지표 물질은 0.95%의 함유량을 보였다. 노루오줌의 건조감량은 8.
EAC를 31.25, 62.5, 125, 250 그리고 500 μg/mL 농도로 Hela 세포에 24시간 동안 처리한 뒤 확인해본 결과, 500 μg/mL 농도에서 capase-3 활성도가 정상대조군에 비해 125.9±1.4%까지 유의적으로 증가되었다 (Fig. 6B).
함량분석 − 노루오줌의 지표 물질 bergenin을 Table I과 같은 조건으로 진행하였다. MeOH, 50% MeOH, H2O, EtOH의 추출 용매별 지표 성분 함량을 비교한 결과 Table II와 같이 50% MeOH에서 추출 효율이 가장 높은 것을 확인하였고, 추출 효율이 가장 높은 50% MeOH을 추출 용매로 하여 초음파 및 환류 추출 30분, 30분 2반복, 60분의 추출 조건별로 비교한 결과 Table III과 같이 환류 60분 추출이 가장 높은 것을 확인하였다. 지표 물질의 표준액 46.
결과를 확인했을 때 EAC는 농도의존적으로 Hela 세포의 apoptosis를증가시키는 것이 확인되었고, 최고 농도인 500 μg/mL에서 apoptotic death(apoptosis+cell death)비율이 25.8±2.5%까지 증가되었다(Fig. 6A).
3). 그 결과 노루오줌 50% MeOH 추출물에서 bergenin의 함유량은 0.95%로 확인하였다(Table IV).
95%의 함유량을 보였다. 노루오줌의 건조감량은 8.3%, 엑스함량은 21.3%, 회분은 7.7%, 산불용성회분은 1.7%로 확인되었다. 노루오줌 에탄올 추출물은 Hela 세포의 apoptotic death와 caspase-3 단백질 활성도를 증가시킴을 통해 Hela 세포 사멸 효능을 나타내는 것으로 사료된다.
6B). 실험 결과를 종합했을 때, EAC는 Hela 세포의 세포자멸사를 증가시키는 것으로 나타났을 뿐만 아니라 암세포 사멸에 관여하는 caspase-3 단백질 활성도를 증가시키는 것으로 확인되었다. 이는 EAC가 Hela 세포주 내에서 caspase-3 단백질 활성화를 통해 항암효과를 나타내는 것으로 판단된다.
5B). 실험결과를 요약하면 EAC가 Hela세포에 대해 암세포 사멸 효과를 가지고 있는 것으로 나타났지만, WAC 와 bergenin은 유의적인 효과가 나타나지 않았다. 이 결과를 바탕으로 WAC와 bergenin은 Hela 세포주에 대해 항암 효능이 없는 것으로 판단되며, EAC는 실험 농도를 31.
일반성분 − 노루오줌은 대한약전에 수재되어 있지 않는 민간생약으로 설정된 기준 규격이 없으며, 실험결과 건조감 량은 8.3%, 엑스함량(묽은에탄올엑스)은 21.3%, 회분은 7.7%, 산불용성회분은 1.7%의 결과를 확인하였다.
추출물은 31.25, 62.5, 125, 250 그리고 500 μg/mL 농도로, 분리 물질은 6.25, 12.5, 25, 50 그리고 100 μM 농도로 24시간 동안 처리하였을 때, WAC와 bergenin은 Hela 세포에 대해 암세포 사멸 효과는 나타내지 않았으며(Fig. 5A, 5C), EAC는 125 μg/mL 농도에서 Hela 세포의 생존율을 72.5±1.1%까지 감소시켰을 뿐만 아니라 최종 농도인 500 μg/mL 농도에서 60.2±1.5%까지 감소시켰다(Fig. 5B).
화합물의 구조 − LC ESI-IT TOF MS에서 molecular ion peak가 m/z 327에서 확인하였고, formular predictor(Shimadzu, Japan)를 이용한 결과 C14H16O9 의 분자식을 얻었다.
확인시험 − 지표 물질 bergenin의 표준액과 추출한 검액을 이용하여 박층크로마토그래프 실험을 진행하여 365 nm에서 관찰한 결과 Rf = 0.55에서 푸른색 반점을 확인하였다(Fig. 2).

후속연구

61% 정도의 세포사멸효과를 나타낸 것에 비해 효과가 좋게 나타났지만,³²⁾ 아로니아(Aronia melanocarpa) 에탄올 추출물에 비하여 효과가 낮게 나타났다.³³⁾ 에탄올 분획에 존재하는 성분이 Hela 세포를 사멸시키는 것으로 예상되어, 향후 추가 적인 실험을 통해 식물 화학적 성분 연구를 통한 추가 지표 및 활성 물질의 분리, 구조 동정 및 in-vivo 실험을 진행하여 한의약으로서 활용방안을 마련하겠다.
앞서 언급한 것처럼caspase-3 단백질은 암세포 내부에서 세포사를 일으킬 수 있는 인자로 작용할 수 있기 때문에,^12,13,31)이 결과는 EAC가 자궁경부암을 개선할 수 있는 천연 추출물로 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 EAC가 in vitro와 in vivo 수준에서 정상세포에 대한 독성이 나타나는지 또는 caspase-3 단백질과 연관된 주요 신호전달 경로를 추가적으로 확인하는 실험이 필요하다.
이는 EAC가 Hela 세포주 내에서 caspase-3 단백질 활성화를 통해 항암효과를 나타내는 것으로 판단된다. 앞서 언급한 것처럼caspase-3 단백질은 암세포 내부에서 세포사를 일으킬 수 있는 인자로 작용할 수 있기 때문에,^12,13,31)이 결과는 EAC가 자궁경부암을 개선할 수 있는 천연 추출물로 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나 EAC가 in vitro와 in vivo 수준에서 정상세포에 대한 독성이 나타나는지 또는 caspase-3 단백질과 연관된 주요 신호전달 경로를 추가적으로 확인하는 실험이 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	현재 개발된 항암제의 한계는?	또한 치료를 받은 여성의 경우 정신정인스트레스가 높게 보고되고 있어 치료방법에 대해 향후 많은 연구가 필요한 실정이다.3-5) 현재까지 개발되어진 항암제는 대게 강한 독성을 보이나 효과가 뛰어나고, 항암제에 대한 암세포의 내성이 생겨 치료의 한계를 보이고 있다.6-8) 이러한 이유 때문에, 현재 효과가 알려지지 않은 여러 천연분리물질과 추출물을 이용해 암세포 사멸 기전 규명 및 효능에 관련된 여러 연구들이 수행되고 있다.
	자궁경부암의 사망률은?	자궁경부암(uterine cervical cancer)은 전 세계적으로 여성 에게 발병되는 암 중 두번째로 이로 인한 사망률이 60%를 차지한다고 알려져 있으며, 우리나라에선 위암과 유방암에 이어 다섯 번째를 차지한다.1,2) 현재 자궁경부암의 치료는 병의 진행 정도와 암종의 크기와 조직 형태에 따라 달라진다.
	자궁경부암의 치료 방법과 특징은?	1,2) 현재 자궁경부암의 치료는 병의 진행 정도와 암종의 크기와 조직 형태에 따라 달라진다. 크게 3가지 단계로 나눌 수 있으며, 수술 또는 화학방사선요법을 통해 치료하지만 수술의 경우 화학방사선요법과 다르게 환자의 난소를 유지시킬 수 있을 뿐만 아니라 섬유화가 유발되지 않는다. 또한 치료를 받은 여성의 경우 정신정인스트레스가 높게 보고되고 있어 치료방법에 대해 향후 많은 연구가 필요한 실정이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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