약용식물의 기원 판별을 위한 Bar-HRM 분석기술의 응용 Practical application of the Bar-HRM technology for utilization with the differentiation of the origin of specific medicinal plant species원문보기
DNA 바코딩 기술은 다양한 약용식물 종들의 기원을 확인하기 위해 폭넓게 이용되고 있는 연구방법이다. 그러나, 시중에 판매되고 있는 유사 식물종을 재료로 사용한 상품이나 혼재되어 있는 상품에서 확인하고자 하는 약용식물을 선별 가능한 실질적인 기술의 개발은 아직 많이 미흡한 실정이다. 최근에는 보다 신속하고 정확도가 높은 기술을 개발하고자 DNA barcoding (Bar) 기술과 high-resolution melting (HRM) curve pattern 분석기술을 혼합한 Bar-HRM 분석기술을 이용한 연구가 진행 중에 있다. 본 리뷰논문에서는 국제적인 시장에서 다양한 기원의 약용식물 판별에 실질적으로 적용 가능한 Bar-HRM 기술의 최근의 발전 과정과 그 이용에 대해서 정리하였다. 다양한 연구들을 통해서 일부 성공적인 결과들이 보고되고 있지만, 제한된 DNA 바코드 및 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 등 아직 해결되어야 할 과제들이 많다. 특히, 핵 내 바코드로는 ribosomal DNA의 internal transcribed sequence (ITS)단편 이외에는 보고된 사례가 한건도 없었다. 또한, 약용식물을 끓는 물로 추출하여 가공한 약탕, 잼, 젤리, 쥬스 등의 제품은 DNA 단편이 분해되어 분리가 안 되는 경우에는 DNA바코딩 기술을 적용하기가 곤란한 것으로 알려져 있으나 비교적 짧은 DNA단편이 요구되는 Bar-HRM 분석기술을 이용하여 일부 성공한 보고도 있어 향후 그 응용사례가 증가할 것으로 전망된다.
DNA 바코딩 기술은 다양한 약용식물 종들의 기원을 확인하기 위해 폭넓게 이용되고 있는 연구방법이다. 그러나, 시중에 판매되고 있는 유사 식물종을 재료로 사용한 상품이나 혼재되어 있는 상품에서 확인하고자 하는 약용식물을 선별 가능한 실질적인 기술의 개발은 아직 많이 미흡한 실정이다. 최근에는 보다 신속하고 정확도가 높은 기술을 개발하고자 DNA barcoding (Bar) 기술과 high-resolution melting (HRM) curve pattern 분석기술을 혼합한 Bar-HRM 분석기술을 이용한 연구가 진행 중에 있다. 본 리뷰논문에서는 국제적인 시장에서 다양한 기원의 약용식물 판별에 실질적으로 적용 가능한 Bar-HRM 기술의 최근의 발전 과정과 그 이용에 대해서 정리하였다. 다양한 연구들을 통해서 일부 성공적인 결과들이 보고되고 있지만, 제한된 DNA 바코드 및 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 등 아직 해결되어야 할 과제들이 많다. 특히, 핵 내 바코드로는 ribosomal DNA의 internal transcribed sequence (ITS)단편 이외에는 보고된 사례가 한건도 없었다. 또한, 약용식물을 끓는 물로 추출하여 가공한 약탕, 잼, 젤리, 쥬스 등의 제품은 DNA 단편이 분해되어 분리가 안 되는 경우에는 DNA바코딩 기술을 적용하기가 곤란한 것으로 알려져 있으나 비교적 짧은 DNA단편이 요구되는 Bar-HRM 분석기술을 이용하여 일부 성공한 보고도 있어 향후 그 응용사례가 증가할 것으로 전망된다.
The advent of available DNA barcoding technology has been extensively adopted to assist in the reference to differentiate the origin of various medicinal plants species. However, this technology is still far behind the curve of technological advances to be applied in a practical manner in the market...
The advent of available DNA barcoding technology has been extensively adopted to assist in the reference to differentiate the origin of various medicinal plants species. However, this technology is still far behind the curve of technological advances to be applied in a practical manner in the market to authenticate the counterfeit components or detect the contamination in the admixtures of medicinal plant species. Recently, a high resolution melting curve analysis technique was combined with the procedure of DNA barcoding (Bar-HRM) to accomplish this purpose. In this review, we tried to summarize the current development and bottleneck of processing related to the Bar-HRM technology for the practical application of medicinal plant species' differentiation in a viable global market. Although several successful results have been reported, there are still many obstacles to be resolved, such as limited number of DNA barcodes and single nucleotide polymorphisms, in particular, only one DNA barcode, internal transcribed sequence (ITS) of ribosomal DNA has been reported in the available nuclear genome. In addition, too few cases have been reported about the identification of counterfeit or contamination with processed medicinal plant products, in particular specifically the case of technology based infusion, jam and jelly products and components in which it is noted that DNA can be thereby degraded during the processing of these products and components.
The advent of available DNA barcoding technology has been extensively adopted to assist in the reference to differentiate the origin of various medicinal plants species. However, this technology is still far behind the curve of technological advances to be applied in a practical manner in the market to authenticate the counterfeit components or detect the contamination in the admixtures of medicinal plant species. Recently, a high resolution melting curve analysis technique was combined with the procedure of DNA barcoding (Bar-HRM) to accomplish this purpose. In this review, we tried to summarize the current development and bottleneck of processing related to the Bar-HRM technology for the practical application of medicinal plant species' differentiation in a viable global market. Although several successful results have been reported, there are still many obstacles to be resolved, such as limited number of DNA barcodes and single nucleotide polymorphisms, in particular, only one DNA barcode, internal transcribed sequence (ITS) of ribosomal DNA has been reported in the available nuclear genome. In addition, too few cases have been reported about the identification of counterfeit or contamination with processed medicinal plant products, in particular specifically the case of technology based infusion, jam and jelly products and components in which it is noted that DNA can be thereby degraded during the processing of these products and components.
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문제 정의
따라서 본 논문에서는 Bar-HRM 분석기술을 이용한 약용식물의 기원 판별에 관한 연구현황을 조사하고 그 문제점을 파악하고 향후 보다 개선된 기술의 개발을 위한 연구과제들을 논하였다.
) Kurz는 형태학적으로 아주 유사하기 때문에 일반적으로 채취하는 과정에서도 거의 구분이 잘 안되며 이들을 건조하여 만든 거의 모든 분말 제품에서는 서로 섞여 있다고 한다. 따라서 본 보고서에 의하면 향후 실제 시중에 유통되는 이들 한약제의 구분 유통질서 확립에 큰 도움이 될 것이라고 하였다.
최근에는 보다 신속하고 정확도가 높은 기술을 개발하고자DNA barcoding (Bar) 기술과 high–resolution melting (HRM)curve pattern 분석기술을 혼합한 Bar-HRM 분석기술을 이용한 연구가 진행 중에 있다. 본 리뷰논문에서는 국제적인 시장에서 다양한 기원의 약용식물 판별에 실질적으로 적용 가능한 Bar-HRM 기술의 최근의 발전 과정과 그 이용에 대해서 정리하였다. 다양한 연구들을 통해서 일부 성공적인 결과들이 보고되고 있지만, 제한된 DNA 바코드 및 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 등 아직 해결되어야할 과제들이 많다.
제안 방법
특히, 이들 3종에 대하여 염기서열을 비교한 후 상동성이 가장 우수한 부위에서 하나의 프라이머 조합을 제작하여 동시에 3계통을 판별 할 수 있도록 하였다. 따라서 향후 시중에 유통되는 이들 한약재를 사용한 제품에서 위품이나 혼재 여부를 판별하는 전략으로ARMS-PCR 기술에 의하여 1차적으로 판별이 가능하도록 제작한 종 특이 프라이머를 사용하여 먼저 구분을 한 다음 상기한 단 하나의 프라이머 조합을 사용하여 Bar-HRM 분석기술을 적용하여 최종 확인하도록 전략을 제시하였다.
multiflorum)등 3종에 해당하는 11계통들에 대하여 trnL-trnF 바코드를 사용하여 HRM 곡선 패턴 분석기술을 이용하여 이들 계통들을100% 판별이 가능하였다고 하였다. 특히, 이들 3종에 대하여 염기서열을 비교한 후 상동성이 가장 우수한 부위에서 하나의 프라이머 조합을 제작하여 동시에 3계통을 판별 할 수 있도록 하였다. 따라서 향후 시중에 유통되는 이들 한약재를 사용한 제품에서 위품이나 혼재 여부를 판별하는 전략으로ARMS-PCR 기술에 의하여 1차적으로 판별이 가능하도록 제작한 종 특이 프라이머를 사용하여 먼저 구분을 한 다음 상기한 단 하나의 프라이머 조합을 사용하여 Bar-HRM 분석기술을 적용하여 최종 확인하도록 전략을 제시하였다.
대상 데이터
(2015b)은 먼저 GenBank에 등록된 데이터베이스를 통하여 Euphobiaceae과에 속하는 Croton종에 대하여 4 종의 엽록체 바코드(matK, rbcL, rpoC, trnL)와 하나의 핵 내 바코드(ITS1)에 대한 염기서열을 비교 분석하였으며 이 과정에서 공인된 식물표본에 의한 바우쳐 등록번호가 확인되지 않은 것들은 제외하였다. 공인된 시료는 QueenSirikit Botanic Garden에서 분양받은 것을 사용하였다. 총 5개의 DNA 바코드로 부터 7종류의 HRM 분석용 프라이머를 디자인하여 약 200 bp의 크기의 단편이 증폭될 수 있도록 한 후 최종적으로 HRM 곡선 패턴을 비교 분석한 결과 ITS바코드에 의하여 이들 종들에 대한 판별이 가장 우수하였다고 하였다.
결과적으로 판매상들의 의지 여부와는 상관없이 소비자들은 위품이나 혼재된 제품들을 구입하게 되며, 이들을 제대로 확인 할 방법도 없다. 따라서 이들 3종에 대한 바우쳐된 샘플을 먼저 태국의Queen Sirikit Botanic Garden (QSBG)에서 구입한 다음 4종의 DNA 바코드 즉 matK, rbcL, rpoC, trnL 에 대한 염기서열을 비교분석 한 후 약 200 bp 내에 단일염기다형성을 포함하도록 디자인한 프라이머 조합을 사용하여 HRM곡선 패턴을 비교하여 상호 판별이 가능한 것을 확인 하여이를 실제 시중에서 구입한 이들 제품에 실용화가 가능한지의 여부를 조사하기 위하여 전통시장으로부터 15점에 해당하는 분말제품들을 구입하였으며 이들은 제품의 정보에 대한 표시가 없거나 제대로 포장이 되지 않은 상태로 판매되는 것들이었다. 이들 분말시료로부터 채취한 DNA를 사용하여 기존에 확립한 Bar-HRM분석기술을 적용하여 본 결과 거의 모든 제품이 상기한 3종류가 혼재되어 있음을 확인하였다.
성능/효과
따라서 이들 3종에 대한 바우쳐된 샘플을 먼저 태국의Queen Sirikit Botanic Garden (QSBG)에서 구입한 다음 4종의 DNA 바코드 즉 matK, rbcL, rpoC, trnL 에 대한 염기서열을 비교분석 한 후 약 200 bp 내에 단일염기다형성을 포함하도록 디자인한 프라이머 조합을 사용하여 HRM곡선 패턴을 비교하여 상호 판별이 가능한 것을 확인 하여이를 실제 시중에서 구입한 이들 제품에 실용화가 가능한지의 여부를 조사하기 위하여 전통시장으로부터 15점에 해당하는 분말제품들을 구입하였으며 이들은 제품의 정보에 대한 표시가 없거나 제대로 포장이 되지 않은 상태로 판매되는 것들이었다. 이들 분말시료로부터 채취한 DNA를 사용하여 기존에 확립한 Bar-HRM분석기술을 적용하여 본 결과 거의 모든 제품이 상기한 3종류가 혼재되어 있음을 확인하였다. 특히 Andrographis paniculata (Burm.
이러한 연구결과를 종합하여 보면 현재까지 전 세계적으로 보고된 약용식물의 기원판별을 위하여 개발된 비코드들은 엽록체 게놈의 경우에는 matK, rbcL1, rbcL2, rbcL3, rpoC,trnL, trnL-trnF, trnK-matK, psbA-trnH 등 다양한 바코드가 사용되었음을 알 수 있었으나 핵 내 바코드는 아직까지 ITS 외에는 보고가 없는 것으로 조사되었다.
이와 유사한 연구결과로 역시 태국에서 ‘Rang Chuet’ 라는 전통약재로 함께 혼용되고 있는 Thunbergia laurifolia과Crotalaria spectabilis를 구분하기 위하여 먼저 바우쳐된 시료를 사용하여 4종의 DNA바코드(matK, rbcL, rpoC, trnL) 사용한 Bar-HRM분석기술에 의한 판별조건을 확립한 후 시중에서 구입한 건제품, 분말제품, 캡슐, 티백 등 10점의 제품을 대상으로 Bar-HRM기술을 적용한 결과 10개 제품 중 3개는 이들 두 종이 서로 혼재되어 유통되고 있음을 확인하여 향후 본 기술을 이용하여 유통 질서 확립에 도움이 될 수 있을 것이라고 하였다 (Singtonat and Osathanunkul. 2015).
공인된 시료는 QueenSirikit Botanic Garden에서 분양받은 것을 사용하였다. 총 5개의 DNA 바코드로 부터 7종류의 HRM 분석용 프라이머를 디자인하여 약 200 bp의 크기의 단편이 증폭될 수 있도록 한 후 최종적으로 HRM 곡선 패턴을 비교 분석한 결과 ITS바코드에 의하여 이들 종들에 대한 판별이 가장 우수하였다고 하였다.
후속연구
특히 Bar-HRM 분석기술은 특정 DNA 바코드의 염기서열을 분석하여 비교하지 않고도 신속하면서 정확도가 뛰어난 것이 특징이다. 그러나 Bar-HRM 분석기술을 실제 한약재 유통시장에서 적용하기 위하여서는 아직 많은 후속연구가 뒤따라야 한다.
하지만 Bar-HRM 분석기술은 단지 200 bp 내외의 짧은 DNA 단편만 존재하면 문제가 없으므로 성공할 수 있다고 하겠다. 따라서 보다 많은 가공품을 대상으로 보다 많은 DNA바코드를 사용하면 한약재의 유통시장에서 끊임없이 제기되고 있는 위품 또는 혼용 여부를 판별 할 수 있는 과학적인 기술을 적용할 수가 있을 것으로 전망된다.
또한 약 200bp 내외의 짧은 단편을 사용하기 때문에 현재까지 알려진 DNA 바코드를 사용한 연구보고서를 종합하여 보면 이렇게 짧은 단편 내에서 상호 판별이 가능한 다수의 단일염기다형성을 찾기가 어렵다는 것이다. 따라서 앞으로 목표로 하는 약용식물과 관련된 유사 종들에 대하여 유용한 DNA바코드를 보다 많이 확보하여야 할 것이다. 특히 최근에 발전된 Next Generation Sequencing(NGS), Whole Genome Sequencing(WGS) 기술 등의 도입으로 보다 다양한 단일염기다형성을 찾아야 한다.
특히 최근에 발전된 Next Generation Sequencing(NGS), Whole Genome Sequencing(WGS) 기술 등의 도입으로 보다 다양한 단일염기다형성을 찾아야 한다. 또한 Sequence Tagged Site marker들을 사용하여 그 응용을 확대하는 연구 또한 필요할 것이다(Kamel et al. 2015).
그러므로 검출하고자 하는 위품에 대한 프라이머를 기존에 알려진 DNA바코드를 검색하여 디자인하거나 아니면 분류학적으로 동일한 속 또는 과에 속하는 종의염기서열 데이터베이스를 근거로 디자인하여야만 한다. 또한 약 200bp 내외의 짧은 단편을 사용하기 때문에 현재까지 알려진 DNA 바코드를 사용한 연구보고서를 종합하여 보면 이렇게 짧은 단편 내에서 상호 판별이 가능한 다수의 단일염기다형성을 찾기가 어렵다는 것이다. 따라서 앞으로 목표로 하는 약용식물과 관련된 유사 종들에 대하여 유용한 DNA바코드를 보다 많이 확보하여야 할 것이다.
특히, 핵 내 바코드로는 ribosomal DNA의internal transcribed sequence (ITS)단편 이외에는 보고된 사례가 한건도 없었다. 또한, 약용식물을 끓는 물로 추출하여 가공한 약탕, 잼, 젤리, 쥬스 등의 제품은 DNA 단편이 분해되어분리가 안 되는 경우에는 DNA바코딩 기술을 적용하기가 곤란한 것으로 알려져 있으나 비교적 짧은 DNA단편이 요구되는 Bar-HRM 분석기술을 이용하여 일부 성공한 보고도 있어 향후 그 응용사례가 증가할 것으로 전망된다.
즉 모든 시료에 대하여 개별적으로 염기서열을 수행하여 비교분석을 하여야하기 때문에 시간과 비용이 많이 요구되며, 두 가지 이상의 약용식물이 유통시장에서 서로 혼입된 경우에 이들에 대한 DNA를 분리하여 염기서열 분석을 수행할 경우 서로 다른 염기서열의 혼재로 분석결과가 정확하지 않거나 읽을 수 가 없는 경우가 허다하다. 뿐만 아니라 모르는 미지의 약용식물의 혼입여부 또는 위품여부를 판별하기 위하여 모든 게놈의 염기서열을 분석하여 비교하여야 한다.
(2015)은 메리골드(Calendula officinalis)의 saffron(꽃으로 만드는 샛노란 가루로 음식의 색소첨가제로 사용됨)에 혼재되어 있는 다른 Calendula 종의 구분이 가능한 Bar-HRM 분석기술을 개발하였다. 특히 saffron에 혼재되어 있는 다른 유사종의 혼입율이 0.01%까지 검출이 가능하다고 하여 향후 이 기술은 탕재, 분말, 티백 등 약용식물의 가공품 뿐만 아니라 다양한 식품 첨가제에 포함된 다른 유사종의 혼입율을 추적하는데 크게 기여할 수 있을 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 Costa et al.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
DNA 바코딩 기술이란?
DNA 바코딩 기술은 다양한 약용식물 종들의 기원을 확인하기 위해 폭넓게 이용되고 있는 연구방법이다. 그러나, 시중에 판매되고 있는 유사 식물종을 재료로 사용한 상품이나 혼재되어 있는 상품에서 확인하고자 하는 약용식물을 선별 가능한 실질적인 기술의 개발은 아직 많이 미흡한 실정이다.
HRM 기법이란?
최근에는 보다 신속하고 정확도가 높은 기술을 개발하고자 DNA barcoding (Bar) 기술과 high-resolution melting (HRM)curve pattern 분석기술을 혼합한 Bar-HRM 분석기술을 사용한 연구 보고서가 축적되고 있다. HRM 기법은 Real time PCR을 이용한 분석방법으로 PCR 산물이 DNA 서열에 따라 고유의 Tm (melting temperature)를 갖는 것을 이용한 SNP 분석 기법이다. PCR 산물이 만들어질 때 DNA 이중 가닥에 끼어 들어가는 intercalating dye를 첨가하게 되면 PCR 산물에 끼어 들어가 형광 파장을 방출하게 되며, 이때 온도를 낮은 온도에서 높은 온도로 서서히 올리면 PCR 산물은 고유의 Tm 값에서 이중가닥에서 단일 가닥으로 바뀌게 되고 형광 값이 급격히 떨어지게 된다.
HRM의 원리는?
HRM 기법은 Real time PCR을 이용한 분석방법으로 PCR 산물이 DNA 서열에 따라 고유의 Tm (melting temperature)를 갖는 것을 이용한 SNP 분석 기법이다. PCR 산물이 만들어질 때 DNA 이중 가닥에 끼어 들어가는 intercalating dye를 첨가하게 되면 PCR 산물에 끼어 들어가 형광 파장을 방출하게 되며, 이때 온도를 낮은 온도에서 높은 온도로 서서히 올리면 PCR 산물은 고유의 Tm 값에서 이중가닥에서 단일 가닥으로 바뀌게 되고 형광 값이 급격히 떨어지게 된다. 이때의 Tm값의 차이를 구분하여 PCR 산물에서 서열 하나의 차이까지 구분해내는 기법이다. HRM곡선 패턴 비교분석 기술은 극도로 민감하여 목표로 하는 유전자단편의 복제수가 극히 낮은 경우에도 검출이 가능한 기술로 알려져 병원균등의 검사와 같은 임상진단분야에서 널리 사용되고 있는 기술이다(Er and Chang 2012).
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