증숙 처리에 의한 산삼 부정 배양근의 저분자 진세노사이드 추출 Extraction of Low Molecular Weight Ginsenosides from Adventitious Roots Culture of Wild Mountain Ginseng by Steam Processing원문보기
Background: Hot steaming is known to be effective in improving the biological activities of plant extracts by breaking down useful compounds to low molecular weight ones. Methods and Results: This study aimed to develop an optimal extraction and steam processing method for enhancing the low molecula...
Background: Hot steaming is known to be effective in improving the biological activities of plant extracts by breaking down useful compounds to low molecular weight ones. Methods and Results: This study aimed to develop an optimal extraction and steam processing method for enhancing the low molecular ginsenoside contents of the adventitious roots culture of wild mountain ginseng. The total ginsenoside was optimally extracted when 70% EtOH was used at $50^{\circ}C$, whereas low molecule ginsenoside such as Rg2, Rh1, Rh4 and Rk1 could be extracted using 70% EtOH at $70^{\circ}C$. The adventitious roots culture of wild mountain ginseng is known to contain four major ginsenosides, i.e., Rb2, Rb1, Rg1 and Rd, however new ginsenosides Rg6, Rh4, Rg3, Rk1 and Rg5 were new abundantly obtaind after steam processing method was applied. The contents of total ginsenosides were the highest when thermal steam processing was conducted at $120^{\circ}C$ for 120 min. Unlike ginsenosides such as Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, and Rh1, which decreased after steam processing, Rg3, Rk1, and Rg5 increased after thermal processing. Steam processing significanltly reduced the content of Rb1, increased that of Rg6 by about ten times than that in the adventitious roots culture of wild mountain ginseng. Conclusions: Our study showed that the optimal extraction and steam processing method increased the content of total ginsenosides and allowed the extraction of minor ginsenosides from major ones.
Background: Hot steaming is known to be effective in improving the biological activities of plant extracts by breaking down useful compounds to low molecular weight ones. Methods and Results: This study aimed to develop an optimal extraction and steam processing method for enhancing the low molecular ginsenoside contents of the adventitious roots culture of wild mountain ginseng. The total ginsenoside was optimally extracted when 70% EtOH was used at $50^{\circ}C$, whereas low molecule ginsenoside such as Rg2, Rh1, Rh4 and Rk1 could be extracted using 70% EtOH at $70^{\circ}C$. The adventitious roots culture of wild mountain ginseng is known to contain four major ginsenosides, i.e., Rb2, Rb1, Rg1 and Rd, however new ginsenosides Rg6, Rh4, Rg3, Rk1 and Rg5 were new abundantly obtaind after steam processing method was applied. The contents of total ginsenosides were the highest when thermal steam processing was conducted at $120^{\circ}C$ for 120 min. Unlike ginsenosides such as Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, and Rh1, which decreased after steam processing, Rg3, Rk1, and Rg5 increased after thermal processing. Steam processing significanltly reduced the content of Rb1, increased that of Rg6 by about ten times than that in the adventitious roots culture of wild mountain ginseng. Conclusions: Our study showed that the optimal extraction and steam processing method increased the content of total ginsenosides and allowed the extraction of minor ginsenosides from major ones.
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문제 정의
본 연구에서는 산삼 부정 배양근을 대상으로 하여 추출용매, 시간, 온도, 횟수를 달리하여 적용하고 수율 및 총 ginsenoside 함량을 비교함으로서 최적의 추출 조건을 확립하였으며 다양한 증숙 조건별로 유도되는 저분자 ginsenoside 함량을 검정하여 저분자 ginsenoside 함량을 증진시키는 방법을 개발하고, 기능 성과 체내 흡수율이 향상된 저분자 ginsenoside를 고농도로 함유한 원료를 산업적으로 활용하고자 실험을 수행하였다.
제안 방법
동결건조한 건조물 1 ㎏ 을 분쇄기를 이용하여 100 mesh로 분말화하여 용매, 시간, 온도, 횟수에 따른 추출수율 및 총 ginsenoside 함량을 확인하였다.
생체 1㎏을 60, 80, 100, 120℃에서 30, 60, 120분 습윤 고압 증숙기에서 각각 증숙한 후, 2일간 동결건조하였다. 건조가 완료되면 분쇄기를 이용하여 100 mesh로 분말화한 후, 70% EtOH 추출, 농축 및 동결건조하여 시료로 사용하였다.
이동상은 처음 5분까지는 solvent A를 80% 수준으로 유지하였고, 5분에서 20분까지 solvent A의 농도를 77%, 20분에서 25분까지 solvent A의 농도를 70%, 25분에서 30분까지 solvent A의 농도를 60%, 30분에서 60분까지 solvent A의 농도를 50%로 유지하였다. 다시 60분에서 65분까지 solvent A의 농도를 15%를 낮추는 gradient system을 적용하여 수행하였다.
이후 pre-culture 된 산삼 부정 배양근 세포 30g을 접종하여, 온도 25.0 ± 0.5℃, 습도 40.0 ± 5.0%, 광도 1,200 ± 50 Lux에서 8 - 9주간 배양한 후, 수확하여 사용하였다.
총 ginsenoside는 HPLC 분석으로 실시하였다. Column은 Capcell pak C18 column (Shiseido Osaka Soda Co.
추출수율은 초기 투입한 산삼 부정 배양근 대비 동결건조 후 제조된 시료의 무게를 다음 계산식에 대입하여 계산하였다.
추출온도에 따른 조건은 30, 40, 50, 60, 70, 80℃, 추출횟수에 따른 조건은 1, 2, 3, 4회로 나누어 실시하였다. 각 추출액을 0.
추출용매에 따른 조건으로 water, 20%, 40%, 60% 70% 80%, 100% EtOH을 시료 무게 당 10배 (v/w) 혼합하였고, 추출시간에 따른 조건은 70% EtOH에 시료를 침지한 후, 2, 4, 6, 8, 16, 32시간으로 나누어 추출을 실시하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 산삼 부정 배양근은 2017년 10월 주식회사 화진바이오코스메틱 생명공학연구소에서 배양한 것을 실험 원료로 사용하였다.
분석시약은 water, acetonitrile (AcN), ethanol (EtOH)은 J. T. Baker Chemical (Phillipsburg, NJ, USA)의 일급 또는 특급 제품을 구입하여 사용하였다.
모든 실험은 3회 반복으로 진행하여 평균과 표준편차를 나타내었다. 실험에 관련된 통계처리는 SPSS program (Statistical Package for Social Science, Version 24; IBM, Chicago, IL, USA)를 이용하여 Duncan`s Multiple Range Test (DMRT) 검증하였고, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였다.
모든 실험은 3회 반복으로 진행하여 평균과 표준편차를 나타내었다. 실험에 관련된 통계처리는 SPSS program (Statistical Package for Social Science, Version 24; IBM, Chicago, IL, USA)를 이용하여 Duncan`s Multiple Range Test (DMRT) 검증하였고, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였다.
이론/모형
시험물질의 정량값은 측정값의 피크면적을 검량선 (y = ax + b) 식에 대입한 후 정량값 계산식에 의해 산출하였다. 검량선은 x축에 농도를 y축에 피크면적을 적용하여 최소자승법으로 계산하였다.
성능/효과
120℃ 증숙 처리군에서는 Rb2 비율이 더욱 감소하고, ginsenoside 중 Rg2, Rd, Rg6, Rh4, Rg3, Rh2, Rh3 비율이 증가하였으며, 증숙시간이 길어질수록 검출되는 Rg2, Rd, Rg6, Rh4, Rg3, Rh2, Rh3 등의 ginsenoside 비율이 증가하여 120분을 처리하였을 때, 최대치를 나타내었다.
81 ㎎/g으로 함량이 증가하였다. 모든 추출용매별 조건에서 Rh4, Rg3, Rk1, compound K는 검출되지 않았지만, 60% EtOH 추출부터 EtOH 농도가 증가할수록 Rb1, Rb2, Rd가 증가하여 총 ginsenoside 함량이 증가하였다 (Table 1).
반면 70℃에서 추출하는 경우 총 ginsenoside 함량은 36.37 ± 1.51 ㎎/g을 나타내어 50℃에서 추출하는 경우보다 함량은 감소하였으나, Rh1, Rh4, Rk1 등이 미량 검출되었으며, 수율도 증가하였다.
본 연구결과에서는 PDS 계열의 ginsenoside Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rg3가 PTS 계열의 ginsenoside Rg1, Re, Rg2보다 성분변화가 많은 것을 확인하였고, 추출온도 50℃일 때 총 ginsenoside 함량 최대치를 나타내었으며, 그 이상 온도에 서는 감소하는 경향을 보여 기존연구 결과와 유사한 것을 확인하였다.
본 연구에서는 산삼 부정 배양근의 추출 및 증숙으로 변화하는 수율과 total ginsenoside 함량 변화의 조건별 실험으로, 70% EtOH을 이용하여 8시간 동안 50℃에서 3회 반복 추출하는 방법이 total ginsenoside 함량을 최대로 수득할 수 있는 추출법으로 확립하였으며, 증숙조건으로 120℃, 120분 조건에서 산삼 부정 배양근 생체를 증숙할 때 total ginsenoside 함량이 최대로 증가하고, 고온의 증숙으로 인한 당 분해로 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2는 감소하고, Rg6, Rh4, Rg3, Rk1, Rg5 등 저분자 ginsenoside 비율이 증가하여, Rg3, Rk1, Rg5가 17.25%까지 생성되는 것을 확인하였다.
산삼 부정 배양근 생체를 온도 (80 - 120℃)와, 시간 (30 -120분)으로 증숙한 후, 추출 수율을 확인한 결과, 3.47 ± 0.26%에서 4.59 ± 0.34%의 범위를 나타내었고, 80℃ 이상 온도조건에서는 4% 이상의 수율을 나타냈다.
산삼 부정 배양근에 water 및 EtOH 농도별 용매를 적용하고 추출 수율을 조사한 결과 각 용매 당 추출 수율은 1.44 ± 0.05 - 2.79 ± 0.13%의 범위를 나타냄을 확인하였으며, 70% EtOH로 추출하였을 때 2.79 ± 0.13%로 가장 높은 수율을 나타냈다 (Table 1).
Yang 등 (2006)은 홍삼을 추출하기 위해 24, 48, 72시간의 추출시간과 섭씨 82, 93℃의 추출온도로 나누어 실시하였다. 시간에 따른 총 ginsenoside 함량은 24시간 (0.13%)일 때 높은 함량이 나타났지만, 추출시간이 지속될수록 감소하는 경향을 나타내었다. 온도에 따른 총 ginsenoside 함량은 93℃(1.
13%)일 때 높은 함량이 나타났지만, 추출시간이 지속될수록 감소하는 경향을 나타내었다. 온도에 따른 총 ginsenoside 함량은 93℃(1.42%)로 고온일 때 증가하였고, 온도가 증가함에 따라 PDS와 PTS의 비율이 0.40%에서 0.14%로 감소되었다. 이는 PDS가 PTS에 비해 열처리에 의해 보다 쉽게 가수분해가 되기 때문인 것으로 보고하였다.
67 ㎎/g의 가장 높은 함량을 나타내어 ginsenoside의 함량은 8시간이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통하여 수율은 추출시간이 증가할수록 원재료로부터 용출되는 추출물의 양이 증가하지만 유용성분의 경우는 최적의 추출시간이 존재한다는 것을 확인하였다.
증숙 조건별 총 ginsenoside 함량을 분석한 결과, 산삼 부정 배양근 대조군에서는 ginsenoside Rg1, Re, Rb1의 비율이 48.98%인 반면, 60 - 100℃ 증숙 처리군에서는 Rg1, Re, Rb1 는 감소하고, Rb2 비율이 증가하였다.
총 ginsenoside 함량은 50℃에서 추출하는 경우 41.35 ± 0.48 ㎎/g으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, Rb1, Rb2의 함량이 9.14 ± 0.08, 16.39 ± 0.56 ㎎/g을 나타내 총 ginsenoside 비율 중 61%를 차지하였다.
총 ginsenoside 함량은 6시간 추출에서 32.38 ± 1.31 ㎎/g으로 가장 낮은 함량을 보였고 8시간 추출에서 40.56 ± 1.67 ㎎/g의 가장 높은 함량을 나타내어 ginsenoside의 함량은 8시간이 가장 높은 것으로 확인되었다.
추출시간 2시간에서 2.27 ± 0.07%로 가장 낮은 수율이 확인되었고, 추출시간이 증가할수록 수율이 증가하여 32시간 추출에서 3.01 ± 0.03%를 나타내어 산삼 부정 배양근을 70% EtOH을 적용하여 추출하는 경우 추출시간이 증가할수록 용출되는 양이 증가되고 이에 따라 추출 수율이 증가된다는 것을 확인하였다.
추출온도가 높아질수록 추출물의 수율도 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 추출온도를 70℃로 하여 추출한 경우 수율은 2.91 ± 0.06%로 최대 수율을 나타냈다.
추출횟수가 1 차에서 4 차 추출로 반복될 수록 수율은 2.34 ± 0.09%, 0.91 ± 0.01%, 0.37 ± 0.02%, 0.11 ± 0.01%순으로 감소하는 것을 확인하였다.
57㎎/g으로 유사하였지만, 1차 추출과 달리 2차에서 4차 추출까지 추출되는 정도는 ginsenoside의 종류에 따라 다른 양상을 나타내었다. 추출횟수가 증가할수록 Rg1, Re는 감소하였고 Rb2는 3회 추출까지 증가한 후 감소하였으며 Rd, Rg6는 매회 증가하였고, 4차 추출에서는 이전까지 추출되지 않은 Rk1, Rg5가 0.73, 1.22㎎/g 검출되었다.
후속연구
산삼 부정 배양근은 무균 조건 하에 기내에서 배양배지 및 환경인자를 조절하여 배양·생산하는 기술로, 유해성분이 존재하지 않으며, 산삼과 동일하게 다양한 ginsenoside를 함유하고 있다. 또한 생산 육종연한이 짧아 그 활용성이 대두되는 원재료로 산삼 부정 배양근의 prosapogenin 함량 향상을 위한 지속적인 연구가 수행되어 저분자 ginsenoside가 고농도로 함유된 기능성제품 개발에 기대가 모아질 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
산삼 부정 배양근의 대량 증식 기술은 무엇을 이용하는가?
산삼은 제한적 생산과 비용 문제로 산업적 활용의 어려움이 있으나, 이를 극복하기 위해 생물공학적 기법인 식물조직배양 기술과 대용량 생물반응기 (bioreactor)를 이용한 산삼 부정 배양근의 대량 증식 기술이 발달하고 있다. 이러한 생물공학 기법으로 배양된 산삼 부정 배양근은 유전적 조성이 안정적인 것으로 보고되고 있다 (Shin et al.
산삼은 무엇을 의미하는가?
A. Meyer)은 두릅나무과 (Araliaceae)에 속하는 다년생 초본으로, 재배하지 않고 야생에서 자연적으로 발아하여 성장한 삼을 말한다. 맛은 달고 쓰며 온한 기운을 가지고 있는 약재로 알려져 있으며 (Shin, 2001; Park et al.
산삼이 인삼과 장뇌삼에 비해 우수하다고 알려진 점은?
, 2003; Hong et al., 2008), 인삼과 장뇌삼에 비해 약효적인 면에서 우수하다고 알려져 있다 (Nam et al., 2012).
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