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문제 정의
- 이에 따라 본 연구에서는 화장품 소재 및 산업적 가치를 향상시키기 위하여 산삼 부정 배양근을 초임계 유체로 추출한오일의 불포화지방산의 함량을 증대시키기 위하여 desaturase를 포함한 발효 미생물인 효모균을 처리한 후 비 (非)사포닌계 지방산 성분분석과 주름형성에 관여하는 caollagenase 및 elastase에 대한 저해활성을 평가하였다.
제안 방법
- 75 ㎖/min으로 흘려주었다. Column 온도는 100℃에서 4 분간 유지한 후 3℃/min의 비율로 240℃까지 온도를 상승시키고 이후 15 분 이상 유지하였고, 검출기는 FID로 285℃의 조건으로 측정하였다.
- 6)에 녹여 사용하였다. 각 시험용액은 일정 농도가 되도록 조제하였으며, 시험용액 100 ㎕,elastase 효소액 (0.2 U/㎖) 50 ㎕, 기질액 (1 ㎎/㎖)을 100 ㎕을 취하여 37℃에서 30 분간 반응시켜 96 well plate (SPL),410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성도는 다음과 같은 계산식을 이용하여 산출하였다.
- 각 추출 여과물에 함유된 용매 (n-hexane, EtOH) 및 수분을 제거하기 위해 농축을 실시한 후, 수율을 비교 측정하였고, 추출수율은 다음과 같은 방법으로 산출하였다.
- 본 연구에서는 n-hexane 추출과 초임계 유체 추출의 조건 및 수율을 비교하였고, 초임계 유체 추출 조건은 압력 (250 - 350 bar), 시간 (120 - 180 min) 및 보조용매 첨가여부에 의해 수행하였다.
- 산삼 부정 배양근에 함유된 지방산 수율을 확인하기 위하여 건강기능식품의 기준 및 규격 (2016-163호)에 기재된 ‘EPA 및 DHA 함유 유지’ 제조방법을 변형하여 헥산추출과 초임계유체 추출을 실시하였다.
- 산삼 부정 배양근에 함유된 지방산 중 불포화 지방산 함량을 증진시키기 위하여 발효미생물인 효모균 (S. cerevisiaeHLJG0703)을 처리하였다.
- 5)에 4 mM의 CaCl2을 녹여 buffer를 제조하여 사용하였다. 제조된 buffer에 collagenase와 기질 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-DArg을 각각 0.2 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖의 농도로 제조하여 반응하였다. 각 시험용액은 일정 농도가 되도록 조제하였다.
- 지방산 분석은 식품의 기준 및 규격 (2016-72호)에 기재된 ‘지방산 제1 법’ 의 분석방법을 변형하여 실시하였다.
- 지방산 표준용액 SUPELCOTM 37 Component FAME Mix를 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64로 희석하여 검량선을 확인하였다 (Table 1).
- 초임계 유체 추출은 시료 100 g을 초임계추출기에 충전한 후, 추출압력 (250 - 350 bar), 온도 (50 - 60℃), 시간 (120 -180 min) 조건별로 달리 추출하여 0.45 ㎛ syringe로 여과하였다 (Table 2).
대상 데이터
- 발효에 사용한 균주는 빵에서 분리·동정된 효모균(Saccharomyces cerevisiae HLJG0703, KACC 83014BP, Jeonju, Korea)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 산삼 (Panax ginseng C. A. Meyer) 부정 배양근은 ㈜화진바이오코스메틱 생명공학연구소에서 배양한 재료를 사용하였다.
- 실험에 사용한 초임계추출기는 Ilshin Biobase (Dongducheon,Korea)의 ISA-SEFE-0500-0700-080, 감압회전 농축기는 EYELA (Tokyo, Japan)의 N-1200, pH meter기는 Mettler Toledo (Greifensee, Switzerland)의 ME204, 원심분리기는 Labogene (Lynge, Denmark)의 1580R, 초음파 추출기는 Jeiotech (Seoul, Korea)의 VCP-10, GC-FID (gas chromatography flame ionization detector)는 Agilent (Santa Clara, CA, USA)의7890B series, 분광광도계는 Molocular Devices (San Jose,CA, USA)의 spectra max M series를 사용하였다.
- 주름억제 효과 측정을 위한 trizma base, N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-LeuGly-Pro-D-Arg, elastase from porcine pancreas, collagenase from clostridium histolyticum, CaCl2, ethyl acetate 등은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
- 지방산 표준품은 SUPELCOTM 37 Component FAME Mix는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품, 추출 및 효모균의 효소 처리에 사용한 n-hexane, ethyl alcohol (EtOH), dimethyl sulfoxide (DMSO) 및 이외 시약은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)의 일급 또는 특급 제품을 구입하여 사용하였다.
- 효모균 처리는 초임계 유체로 추출하고 농축된 산삼 부정 배양근 오일 시료 10 g을 30% DMSO에 희석하여 사용하였다. 효모균을 2 일간 PDB (trypticase soy broth) medium에서 pre-culture하여 사용하였다. 배양된 효모균을 3,000 rpm, 5 min으로 원심분리 하여 희석된 산삼 부정 배양근오일에 접종하였으며, 1 - 5 일간 25℃, facultative anaerobe 조건으로 처리하였다 (treatment 1 - 5).
데이터처리
- 모든 실험은 3 회 반복으로 진행하여 평균과 표준편차를 나타내었다. 실험에 관련된 통계처리는 SPSS program(Statistical Package for Social Science, Version 24; IBM,Chicago, IL, USA)를 이용하여 분산분석 (ANOVA)으로 p <0.
- 실험에 관련된 통계처리는 SPSS program(Statistical Package for Social Science, Version 24; IBM,Chicago, IL, USA)를 이용하여 분산분석 (ANOVA)으로 p <0.05 수준에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)에 의하여 시료간의 유의차를 검증하였다.
이론/모형
- Collagenase 저해활성 측정은 Wünsch과 Heindrich (1963)의 방법에 따라 측정하였다.
- Elastase 저해활성측정은 Cannell 등 (1988)의 방법에 따라 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 410 ㎚에서 측정하였다.
- Hierarchical clustering analysis (HCA)를 위해 Multi-Experiment Viewer version 4.9.0 (MeV, Boston, MA,USA)을 사용하였다.
성능/효과
- 250 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군이 20.68 ± 2.63%, 효모균 처리군 (treatment 1 - 5)이 45.17 ± 2.61%, 55.33 ± 1.63%, 27.63 ± 4.34%, 48.88 ± 10.21%, 49.32 ± 8.97%의 저해율을 각각 나타내었고, 500 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군 29.76 ± 3.77%을 나타낸 데 반하여 효모균 처리군 (treatment 1 - 5)은 46.69 ± 3.15%, 59.15 ± 2.92%, 40.49 ± 1.27%, 50.58 ± 2.82%, 54.54 ± 0.76%의 수준을 나타내어 산삼 부정 배양근 오일은 모든 처리구에서 농도 의존적으로 활성이 증가함을 확인할 수 있었으며, treatment 2에서 가장 높은 collagenase 저해활성을 확인하였다.
- Positive control은 elastase 저해활성으로 잘 알려진 ursolic acid로 300 ㎍/㎖의 농도일 때 30.85 ± 8.30%의 활성이 확인되었다 (Fig. 4).
- cis-11-eicosenoate는 대조군이 0.71 ± 0.24 ㎍/㎎로 확인되었고 효모균 처리를 하는 경우 처리 시기별로 1.56 ± 0.09 ㎍/㎎에서 3.23 ± 0.20 ㎍/㎎까지 확인되었고, linolenate의 경우 대조군이 4.00 ± 0.23 ㎍/㎎, 효모균 처리군에서는 8.65 ±1.31 ㎍/㎎에서 13.09 ± 0.80 ㎍/㎎ 범위 수준의 함량을 나타내었다.
- 또한 125 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군이 15.85 ± 1.19%를 나타낸 반면 효모균 처리군 (treatment 1 - 5)은 각각 34.01 ± 2.16%, 51.15 ± 4.12%, 37.90 ± 2.93%, 44.88 ± 5.16%, 35.09 ± 5.07%의 저해활성을 나타냄을 확인하였다.
- 또한 cis-5,8,11,14-eicosatetraenoic acid는 대조군이 0.63± 0.06 ㎍/㎎의 함량을 나타낸 반면 효모균 처리군에서는 0.91± 0.21 ㎍/㎎에서 2.00 ± 0.34 ㎍/㎎ 범위의 함량을 나타내었고,cis-11,14-eicosadienoic acid는 대조군이 0.81 ± 0.06 ㎍/㎎, 효모균 처리군이 1.55 ± 0.08 ㎍/㎎에서 2.57 ± 0.16 ㎍/㎎까지 범위로 상대적으로 증가하는 경향을 나타내었다 (Fig. 1, 2, Table 3).
- 산삼 부정 배양근 오일의 효모균 처리에 의한 총 지방산의 군집을 확인하였을 때, 효모균 처리군 (treatment 1 - 5)는 대조군과 다른 군집을 형성하였으며, treatment 1, 2, 5와 treatment 3, 4가 유사 군집으로 형성되었다. 또한 대조군은 blue를 나타내어 낮은 함량으로 군집이 형성되는 반면, 효모균 처리군에서는 높은 함량인 red 군집의 빈도가 높아지는 것을 확인하였다 (Fig. 3).
- 본 시험에서 positive control은 collagenase 저해활성으로 잘 알려진 epigallocatechin gallate (EGCG)로 500 ㎍/㎖의 농도일 때 72.11 ± 1.08%의 활성을 확인하였다 (Fig. 5).
- 본 시험에서 대조군과 효모균 처리군 (treatment 1 - 5) 각각의 농도를 100, 500, 1,000 ㎍/㎖로 elastase 저해활성을 검정한 결과, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 3.11 ± 1.82%, 효모균 처리군 (treatment 1 - 5) 14.50 ± 3.42%, 20.62 ± 0.74%, 1.58 ±1.56%, 3.84 ± 3.38%, 1.20 ± 0.74%의 저해율, 500 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 22.36 ± 0.93%, 효모균 처리군 (treatment 1 - 5) 55.23 ± 2.63%, 56.47 ± 0.39%, 50.42 ± 1.08%, 47.23 ± 6.76%, 32.99 ± 2.98%의 저해율, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군 30.90 ± 0.26%, 효모균 처리군 (treatment 1 - 5) 54.88 ± 6.04%, 59.70 ± 1.45%, 52.41 ± 1.11%, 54.61 ± 0.36%, 45.32 ± 3.98%로 농도 의존적으로 저해활성이 증가하였다.
- 본 시험에서는 산삼 부정 배양근 오일에 효모균을 처리한결과 효모균의 대사과정 중 생성되는 desaturase에 의한 불포화 지방산 비율을 확인한 결과, 위의 선행연구와 유의적인 결과 값을 나타냈다.
- 본 연구에서 보조용매 EtOH를 첨가하지 않은 추출조건에서는 압력 250 bar에서 350 bar로 증가하였을 때, 시간이 증가할수록 수율은 0.141 - 0.185%로 증가한 반면, 보조용매 EtOH를 첨가한 추출조건에서는 압력 250 bar에서 350 bar로 증가하였을 때 수율 0.214 - 0.243%로 증가하였지만, 시간 증가에 비례하여 유의적인 결과를 나타내지 않았다 (Table 2).
- 본 연구에서는 n-hexane 추출에서는 0.403%의 추출수율을 나타냈었고 초임계 유체 추출에서는 조건인 온도, 압력, 보조 용매 변화에 따라 추출 수율에 차이가 나타났다.
- 본 연구의 결과를 통하여 산삼 부정 배양근을 주름개선을 위한 소재로 활용하고자 하는 경우 초임계 유체 추출이 발효오일이 collagenase의 활성을 저해하여 주름개선에 대한 효능을 가지는 것으로 판단되었으며, 선행연구와 유사한 결과가 나타났다.
- 산삼 (Panax ginseng C. A. Meyer) 부정 배양근 오일이 추출되는 수율에 있어서 비록 이 초임계 유체 추출보다는 hexane을 사용한 추출이 더 높은 결과를 나타내었으나 초임계 유체 추출은 부정 배양근 오일을 활용한 화장품의 제조 공정 등에 유기용매를 제거하는 공정을 거치지 않아도 되는 유용성을 가진다고 생각되어지며 이러한 초임계 유체 추출을 적용하는 경우 추출 수율이 증가를 위하여 높은 온도 및 압력의 사용과 함께 보조용매 EtOH의 사용하는 것이 효율적으로 판단된다.
- cerevisiae의 포화지방산 및 불포화 지방산의 함량은 고려하지 않았다. 산삼 부정 배양근으로부터 초임계 추출한 오일에 S. cerevisiae가 포함하고 있는 desaturase가 작용하여 포화지방산 비율이 감소하고 불포화 지방산 비율 및 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 산삼 부정 배양근의 초임계 유체 추출 및 효모균을 처리한 오일의 elastase 저해활성 중, treatment 2에서 가장 높은elastase 저해활성이 확인되었다.
- 이러한 결과를 종합하여 보면 산삼 부정 배양근 초임계 유체 추출 오일에 효모균을 처리하는 경우 효모균을 처리하지 않는 경우 보다 더 높은 elastase에 대한 저해활성이 가질 수 있음을 확인하였다.
- 이상이 결과를 통하여 산삼 부정 배양근 초임계 유체 추출오일에 효모균을 처리하는 경우 효모균의 대사과정 중에 발현되는 desaturase에 의해 산삼 부정 배양근 초임계 유체 추출오일에 포함되어져 있는 포화지방산의 변화를 유도하여 불포화 지방산의 함량을 증가시킬 수 있으며 증가된 불포화 지방산에 기인하여 elastase 및 collagenase에 대한 저해활성이 높아졌다는 것을 확인할 수 있었고 이것을 통해 효모균 처리가 된 산삼 부정 배양근 초임계 유체 추출 오일이 주름개선에 대하여 더 높은 주름 개선 효능을 나타낼 수 있을 것으로 생각되며 효모균 처리의 최적 기간은 2 일이라는 것을 확인하였다.
- 초임계 유체 추출한 산삼 부정 배양근 오일을 대상으로 효모균을 처리하고 37 종의 지방산 함량을 비교해본 결과, 대조군 비교하여 효모균 처리군에서 불포화지방산 중 palmitoleate, cis-9-oleic acid, linoleate, γ-linolenate, cis-11-eicosenoate, linolenate, cis-5,8,11,14-eicosatetraenoic acid, cis-11,14-eicosadienoic acid의 함량이 증가되는 것으로 확인되었다.
- 총 지방산 37 종을 분석한 후 포화지방산, 불포화지방산 비율을 비교해본 결과, 대조군 대비 발효 처리군에서 불포화지방산 비율이 증가하였다 (Table 4). S.
- 효모균을 처리하지 않은 대조군과 효모균 처리군 (treatment 1 - 5) 각각의 농도를 31.25, 62.5, 125, 250, 500 ㎍/㎖로 collagenase 저해활성을 검정한 결과, 32.25 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 2.67 ± 3.77%를 나타내었고 효모균 처리군 (treatment 1 -5)은 26.66 ± 8.45%, 29.39 ± 2.79%, 29.18 ± 0.33%, 32.93 ± 3.72%,29.83 ± 2.01%의 저해율을 각각 나타내었으며, 62.5 ㎍/㎖ 농도에서는 대조군 5.73 ± 1.28%, 효모균 처리군 (treatment 1 - 5)은 각각 32.06 ± 1.86%, 39.99 ± 2.88%, 23.78 ± 2.74%, 34.65 ± 4.06%, 27.09 ± 2.82%의 저해율을 나타내었다.
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