구강위생을 위한 간편성과 편리성 때문에 영유아에서 건강취약자 및 일반인에 이르기까지 구강청결티슈 사용이 증가되고 있다. 또한 기본 성분인 정제수 외에도 구강위생에 도움이 될 목적으로 다양한 기능 성분이 첨가된 구강청결티슈들이 시판되고 있다. 하지만 함유 성분에 대한 제공정보가 부족하고 함유량 기준이 마련되지 못하고 있어 구강 환경이 예민한 영유아 등에게 적용하기 위해서는 이들 제품에 대한 연구자료가 필요할 것으로 보인다. 본 연구에서는 구매도가 높은 시판 구강청결티슈 5종에 대한 구강세포 안전성을 확인함으로써 제품사용 시 유의해야 할 정보를 제공하고자 하였다. 시험 결과 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 구강미생물 S. mutans 및 A. actinomycetemcomitans에 대한 항균작용을 나타냈지만 구강상피세포 및 구강섬유세포에도 독성을 나타냈다. 항균작용이 제한적인 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분은 구강상피세포 및 구강섬유세포에 대한 독성도 낮았다. 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의한 구강세포 독성은 G2/M phase에서 세포주기 진행 억제와 세포자멸 유도에 의한 것으로 분석되었다. 따라서 구강 환경이 예민한 영유아 등을 대상으로 한 반복적이고 빈번한 사용은 구강세포 독성의 가능성을 높일 수 있다.
구강위생을 위한 간편성과 편리성 때문에 영유아에서 건강취약자 및 일반인에 이르기까지 구강청결티슈 사용이 증가되고 있다. 또한 기본 성분인 정제수 외에도 구강위생에 도움이 될 목적으로 다양한 기능 성분이 첨가된 구강청결티슈들이 시판되고 있다. 하지만 함유 성분에 대한 제공정보가 부족하고 함유량 기준이 마련되지 못하고 있어 구강 환경이 예민한 영유아 등에게 적용하기 위해서는 이들 제품에 대한 연구자료가 필요할 것으로 보인다. 본 연구에서는 구매도가 높은 시판 구강청결티슈 5종에 대한 구강세포 안전성을 확인함으로써 제품사용 시 유의해야 할 정보를 제공하고자 하였다. 시험 결과 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 구강미생물 S. mutans 및 A. actinomycetemcomitans에 대한 항균작용을 나타냈지만 구강상피세포 및 구강섬유세포에도 독성을 나타냈다. 항균작용이 제한적인 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분은 구강상피세포 및 구강섬유세포에 대한 독성도 낮았다. 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의한 구강세포 독성은 G2/M phase에서 세포주기 진행 억제와 세포자멸 유도에 의한 것으로 분석되었다. 따라서 구강 환경이 예민한 영유아 등을 대상으로 한 반복적이고 빈번한 사용은 구강세포 독성의 가능성을 높일 수 있다.
Wet wipes are being increasingly used because of their convenience. Particularly, oral wet wipes are useful for regular cleaning of a baby's mouth after birth. Therefore, the consumption of oral wet wipes has increased over the past few years and a variety of products are commercially available. How...
Wet wipes are being increasingly used because of their convenience. Particularly, oral wet wipes are useful for regular cleaning of a baby's mouth after birth. Therefore, the consumption of oral wet wipes has increased over the past few years and a variety of products are commercially available. However, product information on safety is not sufficiently provided and still raises doubts regarding adverse effects. To confirm the safety of wet wipes as an oral hygiene item and provide information for their use, we investigated the cytotoxicity of oral wet wipes and verified the underlying mechanism. The anti-bacterial effect of oral wet wipes was analyzed using the disk diffusion method. The cytotoxic effects of oral wet wipes were observed based on morphological changes using microscopy and determined using a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in gingival epithelial cells and gingival fibroblasts. Evaluation of apoptosis by oral wet wipes was explored using propidium iodide flow cytometric analysis and a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) assay. Apoptosis-related molecules were also analyzed using western blotting. Five types of oral wet wipes were tested, and two products from Fisher-Price and Dr. Kennedy revealed strong cytotoxic effects on gingiva epithelial cells and gingiva fibroblasts, although they also showed intense anti-bacterial effects on oral bacteria. Cell cycle arrest in the G2/M phase and apoptosis were observed based on treatment of extracts from Fisher-Price and Dr. KENNEDY. Relatively high TUNEL levels, reduction of proliferating cell nuclear antigen and cyclin-dependent kinase 4 expression, and fragmentation of poly (ADP-ribose) polymerase were also elucidated. These results suggest that commercial oral wet wipes could exert cytotoxic influences on oral tissue, although there are anti-bacterial effects, and careful attention is required, especially for infants and toddlers.
Wet wipes are being increasingly used because of their convenience. Particularly, oral wet wipes are useful for regular cleaning of a baby's mouth after birth. Therefore, the consumption of oral wet wipes has increased over the past few years and a variety of products are commercially available. However, product information on safety is not sufficiently provided and still raises doubts regarding adverse effects. To confirm the safety of wet wipes as an oral hygiene item and provide information for their use, we investigated the cytotoxicity of oral wet wipes and verified the underlying mechanism. The anti-bacterial effect of oral wet wipes was analyzed using the disk diffusion method. The cytotoxic effects of oral wet wipes were observed based on morphological changes using microscopy and determined using a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in gingival epithelial cells and gingival fibroblasts. Evaluation of apoptosis by oral wet wipes was explored using propidium iodide flow cytometric analysis and a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) assay. Apoptosis-related molecules were also analyzed using western blotting. Five types of oral wet wipes were tested, and two products from Fisher-Price and Dr. Kennedy revealed strong cytotoxic effects on gingiva epithelial cells and gingiva fibroblasts, although they also showed intense anti-bacterial effects on oral bacteria. Cell cycle arrest in the G2/M phase and apoptosis were observed based on treatment of extracts from Fisher-Price and Dr. KENNEDY. Relatively high TUNEL levels, reduction of proliferating cell nuclear antigen and cyclin-dependent kinase 4 expression, and fragmentation of poly (ADP-ribose) polymerase were also elucidated. These results suggest that commercial oral wet wipes could exert cytotoxic influences on oral tissue, although there are anti-bacterial effects, and careful attention is required, especially for infants and toddlers.
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문제 정의
본 연구에서는 구매도가 높은 시판 구강청결티슈 5종을 대상으로 구강위생용품으로서의 안전성을 확인하고 이에 대한 정보를 제공하고자 하였다.
이와 함께 자가 구강관리가 어려운 노약자 및 장애인뿐만 아니라 일반인도 제품 대상이 되므로 인체 안전성에 관한 적절한 조사 및 정보제공이 필요하다. 이에 본 연구에서는 시판되고 있는 다양한 구강청결티슈 중 구매도가 높은 제품 5종에 대해 구강위생용품으로서의 안전성을 확인하였다.
또한 키토산은 긍정적인 기능성이 많은 만큼 방부제로서의 활성을 극대화하기 위해 구강세포독성이 낮은 키토산을 선별하여 대체하는 것도 바람직할 것으로 보인다. 2018년 현재 10여종의 구강위생물티슈가 시판되고 있으며, 본 연구에서는 쇼핑몰 상품거래 기준 상위 5종 제품에 대한 안전성을 조사하였다. 상위 5종 제품들은 화학보존제 무첨가 및 무표백 등 구강 제품들의 최근 경향을 모두 반영하고 있고, 나머지 제품들에 대해서는 상품거래량이 적어 전수조사는 시행하지 않았다.
상위 5종 제품들은 화학보존제 무첨가 및 무표백 등 구강 제품들의 최근 경향을 모두 반영하고 있고, 나머지 제품들에 대해서는 상품거래량이 적어 전수조사는 시행하지 않았다. 본 연구 결과는 구강청결티슈에 대한 구강위생용품으로서의 안전성을 확인함으로써 제품사용 시 유의해야 할 정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
마이비(Mybee; Avent Korea, Seoul, Korea), 닥터케네디 (Dr. KENNEDY; Kennedy & Kennedy, Seoul, Korea), 궁중비책(Goongbe; Zero to Seven, Seoul, Korea), 아이수(I-Soo; Wooil C&Tech, Pyeongtaek, Korea), 피셔프라이스(Fisher-Price; C&Tech, Hwaseong, Korea)에서 판매하는 일회용 구강청결티슈를 각각 20 ml 구강세포 배양액에 담가 24시간 동안 교반을 유지하며 티슈 성분을 추출하였다.
60 mm petri dish에서 배양된 구강세포를 구강청결티슈성분이 포함된 세포배양액으로 교체해 배양한 후 세포모양변화를 위상차현미경(CKX41-A32PHP; Olympus, Tokyo, Japan)을 통해 확인하였다.
멸균한 원형 Whatman 종이 디스크(지름 8 mm)를 배치하고 추출한 구강청결티슈 성분을 각각 5 μl씩 디스크에 점적한 후 35oC 인큐베이터에서 배양하였다.
1% NP-40, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 10 mM NaCl, protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)이 함유된 세포분해용액으로 추출된 단백질 50 μg을 10% SDS-PAGE에서 전기영동 하였다.
PBS 세척 후 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 염색 후 마운트(VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)하였고 형광현미경(EVOS FL monochrome microscope; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 세포반응을 관찰하였다.
0.25 mg/ml RNase-A와 50 μg/ml propidium iodide를 넣어 반응한 후 FACSAriaTMIII (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포주기(cell cycle)를 분석하였다.
멸균한 원형 Whatman 종이 디스크(지름 8 mm)를 배치하고 추출한 구강청결티슈 성분을 각각 5 μl씩 디스크에 점적한 후 35oC 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 배양 후 미생물 증식 억제 작용이 나타난 원형 디스크 주위의 clear zone을 측정하였다.
PBS/Tween-20 용액으로 membrane을 3회 세척한 후 3,000배 희석된 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체를 넣어 상온에서 2 시간 반응하였다. 1차 항체에 대한 단백질 발현은 Enhanced Chemiluminescence Detection kit (ECL; Amersham Life Science, Parsippany, NJ, USA)를 이용한 Kodak x-ray 필름으로 확인하였다. Gel Doc XR＋ imaging system (Bio-Rad)을 이용하여 단백질 발현을 비교 분석하였다.
1차 항체에 대한 단백질 발현은 Enhanced Chemiluminescence Detection kit (ECL; Amersham Life Science, Parsippany, NJ, USA)를 이용한 Kodak x-ray 필름으로 확인하였다. Gel Doc XR＋ imaging system (Bio-Rad)을 이용하여 단백질 발현을 비교 분석하였다.
Disc diffusion 분석법을 이용하여 구강청결티슈 성분이 구강미생물 생육에 미치는 영향을 관찰하였다. BHI 평판배지에 S. mutans 혹은 A. actinomycetemcomitans를 도말하고 구강청결티슈 성분을 점적한 디스크를 배치하여 생육을 관찰하였다. 24시간 후 대조군과 비교했을 때 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 구강미생물 생육억제 작용은 제한적으로 관찰된 반면 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 높은 구강미생물 생육억제 작용을 나타내었다(Table 1).
구강청결티슈 성분에 의한 구강세포 독성의 원인을 분석하고자 구강청결티슈 성분으로 배양된 구강상피세포를 유세포분석기를 이용하여 세포주기를 관찰하였다(Fig. 2A). 대조군과 비교하여 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 G2/M phase에서 세포주기 진행을 현저히 억제하였고 세포자멸 또한 증가시켰다.
궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 G2/M phase 세포주기 진행 억제 및 세포자멸을 나타낸 세포 수는 대조군과 비교하여 제한적이었다. 세포자멸에서 나타나는 DNA 절편의 3ˊ-OH 말단을 TUNEL 방식으로 표식함으로써 구강청결티슈 성분에 의한 구강세포자멸을 형광현미경으로 관찰하였다(Fig. 2B). 세포주기 분석 결과와 같이 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 세포자멸은 매우 제한적이었지만 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의한 강한 세포자멸 유도가 확인되었다.
대상 데이터
구강상피세포와 구강섬유세포를 fetal bovine serum이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F-12 phenol red-free medium (3:1) 배지로 37oC, CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
KENNEDY; Kennedy & Kennedy, Seoul, Korea), 궁중비책(Goongbe; Zero to Seven, Seoul, Korea), 아이수(I-Soo; Wooil C&Tech, Pyeongtaek, Korea), 피셔프라이스(Fisher-Price; C&Tech, Hwaseong, Korea)에서 판매하는 일회용 구강청결티슈를 각각 20 ml 구강세포 배양액에 담가 24시간 동안 교반을 유지하며 티슈 성분을 추출하였다. 추출 성분용액은 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 원액 시료로 사용하였고, 대조군으로는 구강청결티슈에 사용된 분량의 순면부직포를 멸균하여 동일 조건에서 성분을 추출해 실험에 사용하였다. 구강미생물에 대한 실험에는 구강청결티슈 성분을 구강미생물 배양액으로 동일 과정에 따라 추출해 적용하였다.
추출 성분용액은 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 원액 시료로 사용하였고, 대조군으로는 구강청결티슈에 사용된 분량의 순면부직포를 멸균하여 동일 조건에서 성분을 추출해 실험에 사용하였다. 구강미생물에 대한 실험에는 구강청결티슈 성분을 구강미생물 배양액으로 동일 과정에 따라 추출해 적용하였다.
추출된 구강청결티슈 성분은 동일 배양액으로 희석하여 세포에 적용하였다. S. mutans와 Aggregatibacter actinomycetemcomitans는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받았으며, brain-heart infusion (BHI) 배지(Becton, Dickinson and Company, Baltimore, MD, USA)로 35oC 인큐베이터에서 교반 배양하였다. 배양된 미생물은 3,000 rpm으로 원심분리하여 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하였고 이를 다시 PBS에 풀어 650 nm 파장에서 흡광도를 측정(DU800 spectrophotometer; Beckman Coulter, Palo Alto, CA,
(A) The solution from oral wet wipes were treated in oral gingival epithelial cells and oral gingival fibroblasts for 4 hours. The oral wet wipes from Goongbe, Fisher-Price, Mybee, I-Soo, and Dr. KENNEDY were tested. Pictures were taken using a phase-contrast microscope at 200× magnifications.
데이터처리
25 mg/ml RNase-A와 50 μg/ml propidium iodide를 넣어 반응한 후 FACSAriaTMIII (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포주기(cell cycle)를 분석하였다. 결과 분석에는 Win MDI 3.0 소프트웨어(BD)를 이용하였다.
자료 분석은 InStatTM statistical software Prism 5 (Graph-Pad, San Diego, CA, USA)를 이용하여 one-way ANOVA로 분석하였고 p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 해석하였다.
이론/모형
구강청결티슈 성분에 의한 세포사멸(apoptosis)은 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end labeling (TUNEL)이 적용된 In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche, Minneapolis, MN, USA)을 이용하였고 제조회사가 제공하는 실험방법에 따라 진행하였다. Chamber slide에서 배양된 구강상피세포는 구강청결티슈 성분이 포함된 배양액으로 교체하여 16시간 배양하였다.
Disc diffusion 분석법을 이용하여 구강청결티슈 성분이 구강미생물 생육에 미치는 영향을 관찰하였다. BHI 평판배지에 S.
성능/효과
actinomycetemcomitans를 도말하고 구강청결티슈 성분을 점적한 디스크를 배치하여 생육을 관찰하였다. 24시간 후 대조군과 비교했을 때 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 구강미생물 생육억제 작용은 제한적으로 관찰된 반면 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 높은 구강미생물 생육억제 작용을 나타내었다(Table 1). 이런 결과는 구강세포에서도 관찰되었는데 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분이 함유된 배지로 배양된 구강상피세포와 구강섬유세포는 세포 모양 변화와 세포독성이 현저히 관찰되지 않았지만 피셔프라이스와 닥터케네디제품 성분이 함유된 배지로 배양된 구강상피는 위축된 세포모양이 관찰되었고 구강섬유세포는 짧아진 방추형을 나타내었다(Fig.
2A). 대조군과 비교하여 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 G2/M phase에서 세포주기 진행을 현저히 억제하였고 세포자멸 또한 증가시켰다. 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 G2/M phase 세포주기 진행 억제 및 세포자멸을 나타낸 세포 수는 대조군과 비교하여 제한적이었다.
2B). 세포주기 분석 결과와 같이 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 세포자멸은 매우 제한적이었지만 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의한 강한 세포자멸 유도가 확인되었다. 세포자멸을 나타내는 TUNEL 형광은 DAPI로 염색된 핵에서 일치되게 검출되었다.
세포주기 분석 결과와 같이 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 세포자멸은 매우 제한적이었지만 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의한 강한 세포자멸 유도가 확인되었다. 세포자멸을 나타내는 TUNEL 형광은 DAPI로 염색된 핵에서 일치되게 검출되었다. 또한 세포자멸에서 관찰되는 proliferating cell nuclear antigen (PCNA)과 cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)의 발현 감소 및 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 단백질의 분절이 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의해 유도되었다(Fig.
연구결과, 5종의 구강청결티슈 중 구강미생물 S. mutans 및 A. actinomycetemcomitans에 대한 항균작용이 높았던 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 구강상피세포와 구강섬유세포에 대해 강한 세포 모양 변화 및 세포 독성을 나타내었다. 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분은 그 효과들이 제한적이었다.
피셔프라이스와 닥터케네디 제품의 성분이 항균활성이 있다고는 하지만 구강세포에 대한 강한 세포독성은 영유아나 노약자에게 자주 사용될 경우 세포 손상이 우려될 수 있다. 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분에 의한 구강세포 독성은 G2/M phase에서 세포주기 진행 억제와 더불어 세포자멸 유도로 분석되었다. 세포자멸에서 관찰되는 PCNA 및 CDK4 단백질의 발현 감소와 함께 PARP 단백질 분절이 확인되었을 뿐 아니라 강한 염색체 분절이 관찰되었다16,17).
후속연구
하지만 화학방부제보다 미생물 생육억제 활성이 낮고 키토산 분해 활성이 있는 미생물의 생육에 오히려 영양분으로 사용될 수 있으므로 제조나 유통 과정 중에 이로 인한 문제 발생 소지가 남아 있다. 더욱이 키토산이 포함된 시판 구강청결티슈 성분에 의한 강한 구강세포독성이 본 연구에서 확인된 만큼 직접 접촉이 필수인 구강청결티슈에 대한 키토산 적용 방식의 재고가 필요할 것으로 보인다. 특히 구강 내용물의 자발적 뱉기가 어려운 영유아에 대해서는 상대적으로 잔존 키토산이 높을 수 있어 내용제에 준하는 기준치 마련이 필요할 것으로 보인다.
특히 구강 내용물의 자발적 뱉기가 어려운 영유아에 대해서는 상대적으로 잔존 키토산이 높을 수 있어 내용제에 준하는 기준치 마련이 필요할 것으로 보인다. 또한 키토산은 긍정적인 기능성이 많은 만큼 방부제로서의 활성을 극대화하기 위해 구강세포독성이 낮은 키토산을 선별하여 대체하는 것도 바람직할 것으로 보인다. 2018년 현재 10여종의 구강위생물티슈가 시판되고 있으며, 본 연구에서는 쇼핑몰 상품거래 기준 상위 5종 제품에 대한 안전성을 조사하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
영아의 치아가 맹출되지 않고 맹출할 위치의 뼈와 잇몸의 모양이 형성되는 시기는 언제인가?
생후 2주부터 6개월까지는 영아의 치아가 맹출되지 않고 맹출할 위치의 뼈와 잇몸의 모양이 형성되는 시기이다. 보통 치아는 맹출 시기에 치근이 형성되기 시작해 맹출 1∼2년 후 치근이 완성되며, 보통 만 3세 정도면 20개의 유치를 갖게 된다1).
치아가 형성되기 시작해 유치를 가지게 되는 시기는 언제인가?
생후 2주부터 6개월까지는 영아의 치아가 맹출되지 않고 맹출할 위치의 뼈와 잇몸의 모양이 형성되는 시기이다. 보통 치아는 맹출 시기에 치근이 형성되기 시작해 맹출 1∼2년 후 치근이 완성되며, 보통 만 3세 정도면 20개의 유치를 갖게 된다1). 유중절치(앞니)는 6∼10개월, 상악 유측절치는 8∼13개월, 하악 유측절치는 10∼16개월, 유견치(송곳니)는 16∼23개월, 제1유구치(어금니)는 13∼19개월 정도에 맹출된다1).
Disc diffusion 분석법을 사용하여 구강청결티슈 성분을 관찰한 결과, 어떤 회사의 제품들이 구강 미생물 억제 능력을 나타냈는가?
actinomycetemcomitans를 도말하고 구강청결티슈 성분을 점적한 디스크를 배치하여 생육을 관찰하였다. 24시간 후 대조군과 비교했을 때 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분에 의한 구강미생물 생육억제 작용은 제한적으로 관찰된 반면 피셔프라이스와 닥터케네디 제품 성분은 높은 구강미생물 생육억제 작용을 나타내었다(Table 1). 이런 결과는 구강세포에서도 관찰되었는데 궁중비책, 마이비, 아이수 제품 성분이 함유된 배지로 배양된 구강상피세포와 구강섬유세포는 세포 모양 변화와 세포독성이 현저히 관찰되지 않았지만 피셔프라이스와 닥터케네디제품 성분이 함유된 배지로 배양된 구강상피는 위축된 세포모양이 관찰되었고 구강섬유세포는 짧아진 방추형을 나타내었다(Fig.
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