RAW 264.7 세포에서 긴병꽃풀 에탄올 추출물의 항염증 활성 검증 Verification of Anti-inflammatory Activities of the Ethanol Extracts of Glechoma hederacea var. longituba in RAW 264.7 Cells원문보기
본 연구에서는 긴병꽃풀에 대한 항염증 효과를 검증함으로써 천연 기능성 소재로서의 사용 가능성을 검토하고자 하였다. 대식세포(Raw264.7)에서 긴병꽃풀 70% 에탄올 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과 $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서 95.8%의 생존율을 보였고, 특히 $1,000{\mu}g/ml$의 농도에서 37.4%의 Nitric oxide (NO) 발현을 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다. Western blot과 RT-PCR을 이용한 실험에서는 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때 긴병꽃풀 추출물에서 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 본 연구결과를 종합하였을 때 긴병꽃풀 추출물의 항염증 소재로서의 가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 긴병꽃풀에 대한 항염증 효과를 검증함으로써 천연 기능성 소재로서의 사용 가능성을 검토하고자 하였다. 대식세포(Raw264.7)에서 긴병꽃풀 70% 에탄올 추출물의 세포 생존율을 확인한 결과 $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서 95.8%의 생존율을 보였고, 특히 $1,000{\mu}g/ml$의 농도에서 37.4%의 Nitric oxide (NO) 발현을 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다. Western blot과 RT-PCR을 이용한 실험에서는 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때 긴병꽃풀 추출물에서 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 본 연구결과를 종합하였을 때 긴병꽃풀 추출물의 항염증 소재로서의 가능성을 확인하였다.
In this study, we investigated the potential of Glechoma hederacea var. longituba 70% ethanol extract as a natural functional material by examining the anti-inflammatory effect of it. Macrophages results in (Raw 264.7) induced by lipopolysaccharide (LPS). Confirming the viability of the macrophages ...
In this study, we investigated the potential of Glechoma hederacea var. longituba 70% ethanol extract as a natural functional material by examining the anti-inflammatory effect of it. Macrophages results in (Raw 264.7) induced by lipopolysaccharide (LPS). Confirming the viability of the macrophages Glechoma hederacea var. longituba 70% ethanol extract showed a 95.8% survival rate at $1,000{\mu}g/ml$ concentration. Anti-inflammatory activity was examined the inhibitory tests on the production of LPS included nitric oxide (NO) in RAW 264.7 cells by Griess assay. The result showed that NO production deterrent effect of 37.4% at a concentration of $1,000{\mu}g/ml$. The deterrent effect of GG 70% ethanol extract on protein expression of inducible NOS (iNOS) and Cyclooxygenase-2 (COX-2) was measured by Western blotting using the concentrations 50, 100 and $500{\mu}g/ml$, with ${\beta}$-actin used as the positive control. The inhibitory effect of iNOS and COX-2 mRNA expression was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using 50, 100 and $500{\mu}g/ml$ concentration of GG 70% ethanol extract, with GAPDH used as the positive control. In experiments using Western blot and RT-PCR when compared with the control group vitamin C it was confirmed that the 70% ethanol extract from GG suppressed. When compiling the results of this study, we confirmed the possibility of GG 70% ethanol extract as an anti-inflammatory material.
In this study, we investigated the potential of Glechoma hederacea var. longituba 70% ethanol extract as a natural functional material by examining the anti-inflammatory effect of it. Macrophages results in (Raw 264.7) induced by lipopolysaccharide (LPS). Confirming the viability of the macrophages Glechoma hederacea var. longituba 70% ethanol extract showed a 95.8% survival rate at $1,000{\mu}g/ml$ concentration. Anti-inflammatory activity was examined the inhibitory tests on the production of LPS included nitric oxide (NO) in RAW 264.7 cells by Griess assay. The result showed that NO production deterrent effect of 37.4% at a concentration of $1,000{\mu}g/ml$. The deterrent effect of GG 70% ethanol extract on protein expression of inducible NOS (iNOS) and Cyclooxygenase-2 (COX-2) was measured by Western blotting using the concentrations 50, 100 and $500{\mu}g/ml$, with ${\beta}$-actin used as the positive control. The inhibitory effect of iNOS and COX-2 mRNA expression was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using 50, 100 and $500{\mu}g/ml$ concentration of GG 70% ethanol extract, with GAPDH used as the positive control. In experiments using Western blot and RT-PCR when compared with the control group vitamin C it was confirmed that the 70% ethanol extract from GG suppressed. When compiling the results of this study, we confirmed the possibility of GG 70% ethanol extract as an anti-inflammatory material.
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문제 정의
지금까지 개발된 항염증제는 안전성 면에서 문제점이 있어서 사용 일부를 제안하고 있으므로 면역 작용을 천연물질로부터 보다 안전하게 증진하려는 연구에 대한 관심이 부각되고 있으며, 천연물질로 인해 유래된 면역 증강제는 면역 반응을 강화하거나 저하된 면역력을 회복시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다. 따라서 본 연구에서는 긴병꽃풀 추출물을 RAW264.7 세포에서 LPS를 이용하여 염증 반응을 유도한 후, 긴병꽃풀 추출물의 항염증 효과를 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 긴병풀꽃 추출물의 효과를 알아보았다. 그 결과 Fig.
제안 방법
iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다. PCR tube에 5X green Go taq flexi buffer, MgCl2, PCR nucleotide mix (10mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다.
긴병꽃풀 추출물이 iNOS와 COX-2 인자의 mRNA 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 긴병꽃풀 추출물을 농도별로 50, 100, 500 μg/ml 처리하여 RT-PCR을 진행하여 mRNA 발현을 확인하였다. 이 때, mRNA 발현양을 비교하기 위하여 housekeeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였으며, 대조군으로써 vitamin C를 사용하였다.
7 세포에 독성이 매우 낮다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 세포 독성이 영향을 미치지 않는 구간인 50, 100, 500 μg/ml을 설정하여 관련 실험을 진행하였다.
대상 데이터
실험에 사용된 긴병꽃풀의 줄기와 잎은 오산 일원에서 채취하여 열풍건조 후 분쇄하였다. 분쇄한 시료에 시료 중량의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
실험에 사용한 세포주인 RAW 264.7 cell은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)으로부터 구입하였으며, 세포 배양에 사용한 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), penicillin/streptomycin, trypsin은 Thermo Scientific Hyclone(USA) 및 Gibco BRL Co. (Grand Island, USA)에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
RAW 264.7 cell로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법[5]에 따라 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 Raw 264.
따라서 긴병꽃풀 추출물이 iNOS, COX-2인자의 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해서 western blot을 이용하여 실험하였다. 단백질 발현양을 비교하기 위하여 housekeeping gene인 β-actine을 positive control로 사용하였고, 대조구로서는 vitamin C를 사용하였다.
세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[1]에 따라 측정하였다. RAW 264.
성능/효과
MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정한 결과 Fig. 1와같이 긴병꽃풀 추출물을 RAW 264.7에 처리하였을 때 농도가 500 μg/ml 구간에서 생존율은 95.8%로 측정됨에 따라 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았기 때문에 RAW 264.7 세포에 독성이 매우 낮다는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 세포 독성이 영향을 미치지 않는 구간인 50, 100, 500 μg/ml을 설정하여 관련 실험을 진행하였다.
그 결과 Fig. 2와 같이 LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 보였으며, 긴병풀꽃 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 500 μg/ml의 농도에서 41.
Fig. 3에 나타난 결과와 같이 긴병꽃풀 추출물을 처리한 세포군에서 긴병꽃풀 추출물의 최고 농도인 500 μg/ml에서 iNOS와 COX-2는 각각 92.73%, 26.90%의 발현 정도를 보였고 농도가 증가함에 따라 iNOS와 COX-2의 대조군인 vitamin C와 비교했을 때 iNOS의 단백질 발현과 유의한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, COX-2는 대조군보다 우수함을 나타내었다.
Fig. 4에 나타난 결과와 같이 긴병꽃풀 추출물을 처리한 세포군에서 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현양이 감소하여 500 μg/ml 농도에서 각각 82.08%, 84.61%의 발현 억제를 보여주었고 대조군인 vitamin C와 비교해 보았을 때 긴병꽃풀 추출물과 대조군의 mRNA 발현이 iNOS의 발현은 유의함을 나타내었고, COX-2는 발현이 우수함을 확인할 수 있었다.
2와 같이 LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 보였으며, 긴병풀꽃 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 500 μg/ml의 농도에서 41.2%의 저해율을 나타낸 것을 확인하였으며, 대식 세포주에서의 LPS로 염증을 과발현 시켰으며, 이를 우수한 결과로 염증을 억제시킴으로써 긴병꽃풀 에탄올 추출물이 염증억제에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
후속연구
지금까지 개발된 항염증제는 안전성 면에서 문제점이 있어서 사용 일부를 제안하고 있으므로 면역 작용을 천연물질로부터 보다 안전하게 증진하려는 연구에 대한 관심이 부각되고 있으며, 천연물질로 인해 유래된 면역 증강제는 면역 반응을 강화하거나 저하된 면역력을 회복시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다. 따라서 본 연구에서는 긴병꽃풀 추출물을 RAW264.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
면역이란 무엇인가?
아시아에서 생약재는 오랜 기간 동안 많은 질병 치료에 효과적으로 사용되어 왔으며, 생약재 내의 유효한 성분은 인체의 면역 시스템 중 보체계(complement system)의 활성화 등 질병에 대한 생체방어 시스템을 보강하는 등 인체의 생체 항상성(homeostasis)에 큰 영향을 미친다[13]. 면역이란 인체가 외부로부터 미생물의 침입 과정에서 스스로를 지키기 위한 일종의 보호기작으로 세포, 분자, 조직들이 감염원에 대하여 기관들을 보호하는 것이다. 선천 면역계에서 대식세포는 숙주의 방어기구의 일부로서 면역계에서 매우 중요한 역할을 수행하여 외부물질의 침입으로 대식세포가 활성화되면 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) 염증성 cytokine 생성의 향상 및 암세포, 각종 유해군의 성장을 억제할 수 있다[8, 21].
면역반응에서 활성화된 대식세포의 기능은 무엇인가?
면역이란 인체가 외부로부터 미생물의 침입 과정에서 스스로를 지키기 위한 일종의 보호기작으로 세포, 분자, 조직들이 감염원에 대하여 기관들을 보호하는 것이다. 선천 면역계에서 대식세포는 숙주의 방어기구의 일부로서 면역계에서 매우 중요한 역할을 수행하여 외부물질의 침입으로 대식세포가 활성화되면 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) 염증성 cytokine 생성의 향상 및 암세포, 각종 유해군의 성장을 억제할 수 있다[8, 21]. 그러나 지속적이며 과도한 만성 염증반응은 체내의 조직 손상을 유발하며 이와 관련된 염증성 cytokine 또는 활성 산소종으로 인해서 내독소 자극을 포함한 다양한 질병의 매개체로써 중요한 역할을 한다[2].
nuclear factor-κB (NF-κB)가 활성화되어 핵으로 이동 시, 역할은 무엇인가?
염증반응의 대표적 예로는, 대식세포에서 염증성 매개물질 중 하나인 lipopolysaccharide (LPS)를 toll like receptor 4 (TLR4)의 heterodimerization 형성으로 인식하고 세포내 전사인 nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성화를 유도한다[15]. NF-κB가 핵으로 이동 시 염증성 inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), cytokine의 유전자 발현을 유도하게 되며, nitric oxide synthase(NOS)에 의해서 염증반응 시 지표물질인 NO가 L-arginine으로부터 합성된다[19]. NO는 NOS 중 iNOS에 의한 생성이 절대적으로 많으며 과도한 NO 생성은 염증반응을 촉진하고 염증 매개체의 생합성을 촉진하며 염증을 심화시켜 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상 등을 일으킨다[6, 14].
참고문헌 (23)
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