[논문]RAW 264.7 세포에서의 단풍잎돼지풀 추출물의 항염증 활성 검증

유단희; 이진영

doi:10.4014/mbl.1910.10004

RAW 264.7 세포에서의 단풍잎돼지풀 추출물의 항염증 활성 검증
Anti-inflammatory Activities Verification of Ambrosia trifida L. extract in RAW 264.7 Cells 원문보기

Microbiology and biotechnology letters = 한국미생물·생명공학회지, v.48 no.1, 2020년, pp.79 - 89

유단희 (호서대학교 한방화장품과학과) , 이진영 (호서대학교 한방화장품과학과)

초록
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본 연구는 단풍잎돼지풀 70% 에탄올 추출물의 항염증 활성을 검증하기 위해 수행되었다. 단풍잎돼지풀 70% 에탄올 추출물의 전자공여능 측정과 ABTS⁺ 라디칼 소거능을 측정한 결과, 1,000 ㎍/ml 농도에서 각각 84.1%와 92.5%의 효과를 나타냈고, 수렴활성 측정을 한 결과 1,000 ㎍/ml 농도에서 94.7%의 효과를 보였다. 단풍잎돼지풀 70% 에탄올 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위해 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 RAW 264.7세포를 사용하여 효과를 측정하였다. 세포에서 단풍잎돼지풀 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 500 ㎍/ml 농도에서 90% 이상의 생존율을 보였다. Nitric oxide 생산을 억제하는 효과를 측정한 결과, 단풍잎돼지풀 추출물에서 농도가 증가할수록 NO 생성이 감소되는 효과를 확인하였다. 단풍잎돼지풀 추출물의 단백질 발현효과를 western blot을 통해 25, 50, 100 ㎍/ml 농도에서 측정하였고, 양성 대조군으로 β-actin을 사용하였다. 그 결과, inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 단백질 발현효과는 100 ㎍/ml 농도에서 8.6%, 25.1%의 감소됨을 확인하였다. ERK1/2, p38, JNK와 Iκ-Bα의 단백질발현 효과는 인산화를 통해 확인하였고, 농도의존적으로 감소하였음을 확인하였다. mRNA 발현 억제 효과를 RT-PCR을 통해 25, 50, 100 ㎍/ml의 농도에서 측정하였고, 양성 대조군으로 GAPDH를 사용하였다. 그 결과, LPS로 유도된 대식세포에서 iNOS, COX-2, interleukin (IL)-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현 억제 효과는 농도가 증가할수록 발현이 감소됨을 확인하였다. 결론적으로 단풍잎돼지풀 추출물은 염증을 억제할 수 있는 가능성이 있는 항염증 소재의 가능성을 증명하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was performed to evaluate the anti-inflammatory activities of 70% ethanol extract from Ambrosia trifida L. (AT). The electron donating ability and ABTS+ radical scavenging ability of extract from AT was shown to be 84.1% and 92.5% at 1,000 ㎍/ml concentration. The astringent effect of extract from AT was shown to be 94.7% at 1,000 ㎍/ml. The anti- inflammatory activities of extract of AT were investigated using RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS). The cell toxicity effect of AT extract on RAW 264.7 performed MTT assay. As a result of the measured cell toxicity effect, 90% or more was shown with cell viability at a 500 ㎍/ml concentration. In nitric oxide synthesis inhibition effect, it was shown that extract from AT concentration dependent inhibited nitric oxide production. The protein expression inhibitory effect of AT extract was measured by western blot at 25, 50, and 100 ㎍/ml concentration and the β-actin used as a positive control. Consequently, the inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2 protein expression inhibitory effect was decreased by 8.6%, 25.1% at 100 ㎍/ml concentration. The phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2, p38, c-Jun NH2-terminal kinase and Iκ-Bα protein expression inhibitory effect was a decreased dependent concentration. The mRNA expression inhibitory effect was measured by reverse transcription - polymerase chain reaction at 25, 50, and 100 ㎍/ml concentration and the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase used as a positive control. Consequently, the iNOS, COX-2, interleukin (IL)-1β, IL-6 and tumor necrosis factor-α mRNA expression inhibition effect was a decreased dependent concentration in an LPS-activated macrophage. In conclusion, AT extract may have some effects on inflammatory factors as potential anti-inflammatory agents and natural substance for cosmetics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 논문에서는 아직까지 여러 가지 연구가 진행 되지 않은 생태계교란식물인 단풍잎돼지풀을 새로운 식물자원으로 활용하기 위해 항염증 메커니즘을 연구하고, 화장품 천연물 소재로서의 가능성을 검토하였다.

제안 방법

전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 Blois의 방법[17]을 변형하여 측정하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 60 μl와 농도별로 조제한 추출물을 120 μl씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 단풍잎돼지풀은 경기도산림환경연구소에서 경기도 오산시 인근에서 6월에 채취한 재료를 사용하였다. 채취한 시료는 분쇄한 시료의 중량의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.

데이터처리

실험결과는 Mean ± SD (Standard diviation)으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA를 실시하여 유의성이 있을 경우에 post-hoc test로 Tukey range test를 실시하여 95% 수준에서 유의성을 검증하였다.

이론/모형

ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS⁺ cation decolorization assay의 방법에 의하여 측정하였다[18]. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.
LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증유발 인자인 iNOS, COX-2와 pro-inflammatoty cytokine인 IL-1β,IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현 억제 효과를 mRNA의 수준에서 조절되는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 실험하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH을 positive control로 사용하였다.
단풍잎돼지풀 추출물이 염증유발 인자인 iNOS, COX-2,IκB-α, MAPKs 단백질의 발현억제에 기인하여 생성을 억제시키는지에 대해 알아보기 위하여 western blot을 진행하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다.

성능/효과

MAPKs의 활성화는 각각의 인산화를 통해 이루어진다. 그 결과 Fig. 7과 같이 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 단풍잎돼지풀 추출물을 처리한 군에서 ERK1/2, p38, JNK-1의 인산화가 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. NF-κB 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 IκBα의 분해 정도를 측정하여 Fig.
2와 같이 나타내었다. 단풍잎돼지풀 추출물은 1,000 μg/ml 농도에서 92.5%의 소거능을 보였으며, 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때 유의한 결과를 나타내었다. 이는 Park의 연구[27]에서 씀바귀의 에탄올 추출물이 1,000 μg/ml 농도에서 8.
3과 같이 나타내었다. 단풍잎돼지풀 추출물의 astringent 저해활성은 1,000 μg/ml에서 94.7%의 저해활성을 나타내었다. 이는 Lee 등[19]의 함초 추출물을 이용한 연구에서 10,000 μg/ml에서 50%의 수렴효과를 나타낸 것과 비교하였을 때 단풍잎돼지풀 추출물의 활성이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
1과 같이 나타내었다. 단풍잎돼지풀 추출물의 농도가 증가함에 따라 전자공여능이 증가되는 것을 나타내었고, 1,000 μg/ml에서 84.1%의 활성을 나타내었다. Cha 등[24]의 두릅 순수용성 추출물의 전자공여능을 측정한 결과 1,000 μg/ml 농도에서 28.
10에 나타내었다. 단풍잎돼지풀 추출물의 처리한 농도가 높아질수록 mRNA 발현양이 억제되는 것을 확인하였으며, 대조군인 Vit. C와 비교하였을 때, IL1β는 대조군에 비해 감소하는 결과를 나타내었고, IL-6와TNF-α는 대조군에 비해서 감소하지는 않았지만 유의한 결과를 확인하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	면역체계에서 대식세포는 어떠한 역할을 하는가?	면역 반응의 일종인 염증반응은 미생물이나 화합물 등에 의해 유해한 자극이 가해진 후의 인체의 방어기전으로, 자극의 제거 및 손상된 조직의 수복과정까지의 모든 과정을 가리킨다[3]. 면역체계에서 대식세포(macrophage)는 염증반응과 면역기능을 조절하며, 항상성을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다. Lipopolysaccharide (LPS)의 자극에 의해 활성이 증가하며, 이 LPS는 외부의 항원과 공유결합으로 결합된 지질과 다당류의 복합체로서 주로 그람음성균(Gram-negative bacteria)의 외막 성분으로 존재하는 내독소(endotoxin)이다[4, 5].
	염증반응이란 무엇인가?	면역 반응의 일종인 염증반응은 미생물이나 화합물 등에 의해 유해한 자극이 가해진 후의 인체의 방어기전으로, 자극의 제거 및 손상된 조직의 수복과정까지의 모든 과정을 가리킨다[3]. 면역체계에서 대식세포(macrophage)는 염증반응과 면역기능을 조절하며, 항상성을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다.
	대식세포는 어떤 내독소의 자극에 의해 활성이 증가될 수 있는가?	면역체계에서 대식세포(macrophage)는 염증반응과 면역기능을 조절하며, 항상성을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다. Lipopolysaccharide (LPS)의 자극에 의해 활성이 증가하며, 이 LPS는 외부의 항원과 공유결합으로 결합된 지질과 다당류의 복합체로서 주로 그람음성균(Gram-negative bacteria)의 외막 성분으로 존재하는 내독소(endotoxin)이다[4, 5]. 손상된 조직에 있는 세포나 단백질들은 사이토카인의 분비를 촉진시키면서 다른 세포들과 작용하여 면역반응이 시작되고 염증상태가 유도된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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