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문제 정의
- 본 연구에서는 쏙 효소가수분해물을 이용하여 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 생성되는 NO와 cytokine 생성량을 측정하여 쏙 효소가수분해물의 면역 증진 효과 및 면역증강 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 쏙의 α-Chy 가수분해물의 <3 kDa 분획물과 10 kDa 분획물의 cytokine 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성량을 측정하였으며, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다.
제안 방법
- 0.2 N sodium citrate buffer (pH 4.2)로 정용하여 0.2 μm membrane filter로 여과한 후, 아미노산전용분석기(S43000; Sykam, Eresing, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- 24시간 후 양성대조군으로 LPS를 1 μg/mL 처리한 후, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.
- 7 세포는 10% heat-inactivated FBS, 1% penicil-lin 및 streptomycin을 포함한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. RAW 264.7 세포에서 쏙 효소가수분해물의 독성 여부를 확인하기 위해 WST-1 용액을 이용하여 460 nm에서 Microplate reader (BioTek, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 면역 반응에 관여하는 핵심 물질인 nitric oxide (NO)의 활성화되는 능력을 확인하기 위하여 쏙의 6종류의 효소가수분해물의 NO 생성 능력을 측정하였다(Fig. 1). 쏙 효소가수분해물의 NO 생성능을 평가하기에 앞서 6 종류의 효소가수분해물의 RAW 264.
- 면역 증강 효능 검증 및 활성 소재를 발굴하기 위하여 쏙 α-Chy 가수분해물로부터 3 kDa과 10 kDa의 membrane filter를 이용하여 분획을 하였으며, 각각의 분획물 (<3 kDa 분획물, 3-10 kDa 분획물, >10 kDa 분획물)을 구성하고 있는 아미노산의 함량을 확인하고자 총 아미노산 함량을 분석하였다(Table 2).
- 배양액 내 PGE2, TNF-α, IL-6, IL-1β 생성량은 ELISA assay kit를 이용하여 Microplate reader (BioTek, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 쏙의 α-Chy 가수분해물의 3개의 분획물 중 NO 생성능을 나타낸 <3 kDa 분획물과 >10 kDa 분획물의 RAW 264.7 세포에서 PGE2 생성에 대한 효과를 측정하였다(Fig. 3).
- 쏙 동결건조물 각 10 g씩에 6 종류의 효소(Alc, α-Chy, Try, Pep, Neu, Pro)를 처리하였으며, 효소량은 쏙 단백질 함량 대비 1%를 처리하였다.
- 1). 쏙 효소가수분해물의 NO 생성능을 평가하기에 앞서 6 종류의 효소가수분해물의 RAW 264.7 세포에 대한 세포독성을 측정하였다. 6 종류의 효소가수분해물은 1 mg/mL 이하의 농도에서 RAW 264.
- 쏙의 효소가수분해물을 10 mL 증류수에 녹인 후 3 kDa와 10 kDa 두 개의 Ultrafiltration membranes (Amicon Ultra-filter devices; Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 3,000 rpm에서 20분간 반복적으로 원심분리하여 분자량별로 각각 분획하였다(10 kDa).
- 쏙의 효소가수분해물의 가수분해도는 Adler-Nissen (1979)법을 변형하여 측정하였다. 7.
대상 데이터
- Alcalase® 2.4L (Alc), α-chymotrypsin (α-Chy), trypsin (Try), pepsin (Pep), serine, ο-phthaldialdehyde (OPA), disodium tetraborate decahyarate, sodium dodecyl sulfate (SDS), dithiothreitol (DTT), lipopoly-saccharides (LPS), griess reagent, cell proliferation reagent WST-1는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, Neutrase (Neu), Protamex (Pro)은 Novo Co. (Novozyme Laboratories, Copenhagen, Denmark)에서 구입하였다.
- PGE2, TNF-α, IL-6, IL-1β 측정용 kit는 R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- fetal bovine se-rum (FBS), dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM)은 Gibco (Gibco BRL, USA)에서 구입하였다. Penicillin-strepto-mycin solution은 Cellgro (Herndon, VA, USA)에서 구입하였다. PGE2, TNF-α, IL-6, IL-1β 측정용 kit는 R&D Systems Inc.
- RAW 264.7 세포는 10% heat-inactivated FBS, 1% penicil-lin 및 streptomycin을 포함한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. RAW 264.
- (Novozyme Laboratories, Copenhagen, Denmark)에서 구입하였다. RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. fetal bovine se-rum (FBS), dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM)은 Gibco (Gibco BRL, USA)에서 구입하였다.
- fetal bovine se-rum (FBS), dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM)은 Gibco (Gibco BRL, USA)에서 구입하였다.
- 쏙(U. major)은 2016년 3월에 충남 보령 갯벌에서 채집하였다. 쏙은 세척한 후 전체를 동결건조한 후 분쇄하여, -20℃에서 보관하여 사용하였다.
- 상등액 100 μL와 동량의 Griess 시약을 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 Microplate reader기(BioTek, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 표준곡선의 작성은 sodium nitrite를 이용하였다.
데이터처리
- 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며, 두 개의 군 간의 차이의 유의성을 평가하기 위하여 Student t-test를 수행하였으며, 차이는 P 값이 <0.05일 때와 P 값이 <0.01일 때 유의성을 나타내는 것으로 하였다.
이론/모형
- 쏙을 각종 효소로 가수분해하기 위하여 Kjeldahl법을 이용하여 단백질 함량을 측정하였으며, 그 단백질 함량은 41.39±0.69%로 나타났다.
성능/효과
- <3 kDa 분획물 처리군은 LPS 무처리군(Blank)과 비교하였을 때 12.5-50 μg/mL의 농도에서 PGE2의 생성은 농도증가에 따라 유의적으로 증가하였으며, >10 kDa 분획물 또한 2.5-10 μg/mL의 농도에서 PGE2의 생성이 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다.
- 7 세포에 대한 세포독성을 측정하였다. 6 종류의 효소가수분해물은 1 mg/mL 이하의 농도에서 RAW 264.7 세포에서 90% 이상의 생존율을 나타내어 세포 독성이 나타나지 않았음을 확인하였다(데이터 제시하지 않았음). 세포독성이 나타나지 않은 6 종류의 효소가수분해물을 RAW 264.
- RAW 264.7 세포에서 쏙의 α-Chy 가수분해물의 <3 kDa 분획물과 >10 kDa 분획물의 처리로 발현된 IL-6은 <3 kDa 분획물 처리군은 LPS 무처리군과 비교하였을 때 12.5-50 μg/mL의 농도에서, >10 kDa 분획물은 2.5-10 μg/mL의 농도에서 농도증가에 따라 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다.
- , 2016). 본 연구 결과 세 개의 분획물을 구성하고 있는 아미노산 중 Asp, Glu, Leu, Phe, His의 함량은 높은 반면, Cys, Met의 함량은 낮은 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 RAW 264.7 세포에 쏙의 α-Chy 가수분해물의 3개의 분획물을 세포독성이 나타나지 않은 농도 범위로 처리한 결과, <3 kDa 분획물 처리군은 LPS 무처리군(Blank)과 비교하였을 때 12.5-50 μg/mL의 농도에서 NO의 생성이 농도의존적으로 유의적인 증가를 나타내는 것으로 확인하였으며, >10 kDa 분획물은 2.5-10 μg/mL의 농도에서 농도의존적으로 NO의 생성을 유도하는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 세포독성이 나타나지 않은 6 종류의 효소가수분해물을 RAW 264.7 세포 1 mg/mL 이하의 농도로 처리한 후, LPS 무처리군(Blank)과 비교하였을 때 0.25-1 mg/mL의 농도에서 농도의존적으로 유의적인 증가를 나타내는 것으로 확인하였으며, 이들 중, α-Chy 가수분해물은 면역에 관여하는 NO의 생성을 가장 많이 유도하는 것으로 나타났다.
- 쏙의 α-Chy 가수분해물 분획물로 RAW 264.7 세포에서 유도된 TNF-α 양은 <3 kDa 분획물 처리군은 LPS 무처리군과 비교하였을 때 12.5-50 μg/mL의 농도에서 TNF-α의 생성은 농도증가에 따라 유의적으로 증가하였으며, >10 kDa 분획물은 2.5-10 μg/mL의 농도에서 TNF-α의 생성이 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다.
- 쏙의 α-Chy 가수분해물의 <3 kDa 분획물과 >10 kDa 분획물의 처리로 RAW 264.7 세포에서 생성된 IL-1β은 <3 kDa 분획물 처리군은 LPS 무처리군과 비교하였을 때 12.5-50 μg/mL의 농도에서 농도의존적으로 유의적인 증가를 나타내었다.
- 쏙의 α-Chy 가수분해물의 3개의 분획물의 RAW 264.7 세포에서 세포 독성을 한 결과, <3 kDa 분획물과 3-10 kDa 분획물은 0-50 μg/mL의 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었으며, >10 kDa 분획물은 0-10 μg/mL의 농도에서 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).
후속연구
- 이들 결과로부터 쏙의 α-Chy 가수분해물과 분획물은 RAW 264.7 세포에서 면역증강에 중요한 역할을 하는 NO와 PGE2와 면역반응에 작용하는 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β)를 자극하여 활성화시키는 면역 활성 인자로 작용하는 것으로 나타나 쏙효소가수분해물은 면역 증진에 도움이 되는 소재로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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