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문제 정의
- 3) 이들 면역 조절물질의 분비를 증가시킨다. 발효 청국장 추출물에 의한 대식세포 활성화 실험 결과로부터 이 추출물은 LPS와는 다른 경로를 통해 대식세포를 활성화시키는 것으로 관찰되었으므로, 발효 청국장 추출물을 LPS와 함께 처리함으로써 대식세포 활성화의 시너지를 유도할 수 있는가를 조사하였다. 그 결과 발효 청국장 추출물은 LPS와의 병용처리에 의해 NO와 TNF-α 생성에 있어 시너지 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(Fig.
- 본 연구에서는 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 균주로 발효한 청국장 추출물이 대식세포를 자극하여 NO와 TNF-α와 같은 면역 조절물질을 분비하는 면역증강 활성이 있음을 제시하였다.
- 하지만 이 균주로 제조한 청국장에 대해 그 외의 생리활성에 대해서는 아직 보고된 바가 거의 없다. 본 연구에서는 B. amyloliquefaciens에 속하는 신규한 균주인 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730)로 발효한 청국장의 면역조절 활성을 조사하기 위하여 80% 주정에 의해 추출한 청국장 추출물을 이용하여 선천면역세포의 하나인 대식세포에 대한 면역 활성화 효과를 측정하고, 이에 관련된 세포 내 작용기전을 해석하였다.
- amyloliquefaciens SQR9 균주가 선천면역세포의 하나인 수지상세포의 성숙을 촉진하여 항원제시능을 높이며, 불활성화 조류 인플루엔자 백신(H9N2 type)에 대해 점막면역 백신의 adjuvant 효과를 갖는다고 보고하였다(31). 본 연구에서도 B. amyloliquefaciens 균종에 속하는 신규한 균주인 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730)로 발효한 청국장 추출물이 대식세포를 활성화한다는 연구 결과를 제시하였다. 이러한 결과는 이 균주가 선천면역세포를 자극하여 면역기능을 향상시키는 청국장 제조에 유용한 발효균주임을 시사한다.
제안 방법
- 이후 5% skim milk 용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고, P-p38, p38, PERK, ERK, P-JNK, JNK, P-IκB 및 IκB에 대한 항체인 rabbit monoclonal antibodies(BD Bioscience)를 1:5,000으로 희석하여 사용하였다. 2차 항체로는 horseradish peroxidase(HRP)가 결합된 anti-rabbit IgG를 1:5,000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고, TBST(TBS containing 0.05% Tween-20)로 5분씩 총 8회 세정하고 ECL 기질과 반응시킨 후 각각의 단백질 밴드를 Chemiluminescence imaging system을 이용하여 분석하였다.
- B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 균 발효 청국장 추출물의 RAW 264.7 대식세포에 대한 세포독성을 MTT assay에 의해 실시하여 독성을 나타내지 않는 농도를 결정하였다. Fig.
- B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 발효 청국장 추출물의 면역증강 활성의 기전을 해석하기 위한 일환으로 MAPK와 NF-κB의 활성화 여부를 조사하였다.
- RAW 264.7 세포(1×104 cells/well)를 96-well plate에 100 μL씩 분주하고 8시간 동안 안정화시킨 후 SRCM 100730 발효 청국장 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL)로 처리하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- RAW 264.7 세포는 5×104 cells/well 농도로 조절 후 48-well plate에 분주하고 37°C, 5% CO2 incubator에서 8시간 안정화한 다음 세포에 발효 청국장 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL)로 처리하여 24시간 배양하였다.
- 발효 청국장 추출물 혹은 positive control로 사용한 LPS(100 ng/mL)를 6시간 처리 후 원심분리기를 통해 상등액을 제거하고 RNA를 TRIzol reagent(iNtRON Biotechnology, Lynnwood, WA, USA)를 이용하여 분리하였다. RNA로부터 cDNA synthesis kits(Power cDNA synthesis kit, iNtRON Biotechnology, Kirkland, WA, USA)를 이용해 cDNA를 제작하였다. iNOS, TNF-α, β-actin에 대한 PCR primer는 Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다(Table 1).
- iNOS, TNF-α, β-actin에 대한 PCR primer는 Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다(Table 1). 각 단백질 밴드는 Chemiluminescence imaging system(BD Bioscience)을 이용하여 분석 하였다.
- 발효 조건은 37°C에서 80% 습도로 24시간 동안으로 진행하였다.
- 발효 청국장 추출물 처리에 의해 RAW 264.7 세포로부터 NO와 TNF-α의 생성이 유도되었으므로, 이들 면역조절물질의 합성에 관련된 iNOS(NO의 생합성 효소)와 TNF-α의 mRNA 발현 증가 여부를 조사하였다.
- 7 세포(5×105 cells/well)를 6-well plate에 분주하고 세포독성실험과 동일한 조건에서 배양하였다. 발효 청국장 추출물 혹은 positive control로 사용한 LPS(100 ng/mL)를 6시간 처리 후 원심분리기를 통해 상등액을 제거하고 RNA를 TRIzol reagent(iNtRON Biotechnology, Lynnwood, WA, USA)를 이용하여 분리하였다. RNA로부터 cDNA synthesis kits(Power cDNA synthesis kit, iNtRON Biotechnology, Kirkland, WA, USA)를 이용해 cDNA를 제작하였다.
- 발효 청국장 추출물에 의한 병용 효과를 조사하기 위하여 LPS(100 ng/mL)와 청국장 추출물을 함께 처리하고, 대식세포로부터 NO와 TNF-α의 분비가 LPS 단독처리에 비해 상승하는가를 ELISA kit을 통해 측정하였다.
- 발효 청국장 추출물의 면역세포 활성 효과를 확인하기 위해 청국장 추출물을 처리한 RAW 264.7 세포의 세포배양액으로부터 NO와 TNF-α를 측정하였다.
- 그 후 각 well에 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 생성된 formazan을 녹여 이를 20분간 shake 후 Microplate reader(ELx 800-PC, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 대조군에 대한 처리군의 흡광도 비를 백분율로 표시하여 계산하였다.
- 이후 5% skim milk 용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고, P-p38, p38, PERK, ERK, P-JNK, JNK, P-IκB 및 IκB에 대한 항체인 rabbit monoclonal antibodies(BD Bioscience)를 1:5,000으로 희석하여 사용하였다.
- 한편 NO를 측정한 세포배양액을 이용하여 대식세포로부터 분비되는 또 다른 면역조절 사이토카인인 TNF-α를 정량하였다.
대상 데이터
- Mitogen activated protein kinases(MAPK) 활성화 측정을 위한 항체 phospho-p38(P-p38), p38, phospho-ERK (extracellular signal-regulated kinase; P-ERK), ERK, phospho-JNK(c-Jun-terminal kinase; P-JNK), JNK, 그리고 NF-κB 활성화 측정을 위한 항체 phospho-IκB(inhibitor of kappa B, P-IkB), IκB는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구매하였다.
- RAW 264.7 세포배양 배지로는 Dulbecco’s modified Eagle’s minimum essential medium(DMEM)(WelGENE, Seoul, Korea)을 사용하였으며, fetal bovine serum(FBS) 과 antibiotics(streptomycin/penicillin)는 Gibco BRL Life Technologies(Grand Island, NY, USA)의 제품을 사용하였다.
- iNOS, TNF-α, β-actin에 대한 PCR primer는 Cosmo Genetech(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다(Table 1).
- 그리고 house keeping 단백질인 anti-β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받았다. 세포는 DMEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가해 만든 배지로 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였고, 실험과정에서 세포는 75~85% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였다.
- 세포는 DMEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가해 만든 배지로 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였고, 실험과정에서 세포는 75~85% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였다.
- 제조된 청국장을 추출하기 위하여 발효가 끝난 청국장을 60°C에서 24시간 건조한 후 파쇄하여 청국장 분말 시료로 사용하였다.
- 청국장 분말 시료의 10배수의 80% 발효주정을 이용하여 상온(25°C)에서 24시간 교반 추출하여 저온감압농축(N-4000S, Sunileyela, Seongnam, Korea) 및 동결건조(FDT-12050, Hanil Science Medical, Daejeon, Korea) 후 분말화하여 주정 추출물 시료로 사용하였다.
- 청국장 제조에 사용된 대두는 전북 순창군에서 수확되는 백태를 구입하여 사용하였으며, 균주는(재)발효미생물산업진흥원(Sunchang, Korea)이 보유하고 있는 전통 방법으로 제조된 고추장에서 분리한 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 균주를 사용하였다. 청국장은 백태 3.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 통계학적 유의성은 Student’s two-tailed t-test를 이용하여, P<0.05 수준 이상에서 검증하였다.
이론/모형
- Cells were treated with the indicated doses of the fermented cheonggukjang for 24 h. Cell viability was determined by MTT assay. Data were expressed as mean±standard errors.
- NO의 농도는 상층액 내의 nitrite 농도를 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
- 청국장 추출물의 세포독성은 MTT assay를 통해 측정하였다. RAW 264.
성능/효과
- 7 세포의 세포배양액으로부터 NO와 TNF-α를 측정하였다. Fig. 2A에서 나타난 결과와 같이 발효 청국장 추출물 처리에 의해 NO의 생성량이 control과 비교하여 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 대식세포 활성화 지표 중 하나인 NO는 사이토카인이나 미생물의 영향을 받아 대식세포에서 생성되는 반응질소 중간체로서 세포 내 감염을 일으키는 미생물과 암세포를 제어하는 것으로 보고되고 있고, NO가 과도하게 높은 농도로 생성될 경우에는 혈관 확장이나 염증반응에 의한 조직손상 등을 일으키는 것으로 알려져 있다(17,18).
- NF-κB의 활성화에 있어서도 MAPK와 동일하게 처리 후 10분 이내에 IκB의 인산화가 유도되기 시작하는 것으로 관찰되었다(Fig. 5).
- NO 생성과 동일하게 발효 청국장 추출물의 처리에 의해 대식세포로부터 TNF-α가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2B).
- RT-PCR법에 의해 이들 분자의 cDNA를 합성하고 PCR법에 의해 유전자의 발현량을 증폭하여 분석한 결과, SRCM 100730 발효 청국장 추출물 처리에 의해 iNOS 및 TNF-α의 mRNA 발현이 증가하는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
- 그 결과 발효 청국장 추출물은 LPS와의 병용처리에 의해 NO와 TNF-α 생성에 있어 시너지 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(Fig. 6).
- amyloliquefaciens(SRCM 100730) 발효 청국장 추출물의 면역증강 활성의 기전을 해석하기 위한 일환으로 MAPK와 NF-κB의 활성화 여부를 조사하였다. 그 결과 발효 청국장 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리함으로써 MAPK 중 ERK와 p38의 인산화가 강력하게 유도되는 것으로 나타났으며, 이들 분자의 인산화는 자극 후 10분 이내에 상승하여 20분 후부터는 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다(Fig. 4). 하지만 MAPK 관련분자 중 JNK는 아무런 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
- 6). 이 결과는 SRCM 100730 발효 청국장 추출물은 항원 노출에 의한 면역반응이나 혹은 면역세포의 활성화에 기여하는 면역자극물질에 의한 면역세포 활성화 과정에 함께 작용할 경우 상승적 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
- 5). 한편 positive control로 사용한 LPS (100 ng/mL로 20분간 처리)가 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 발효 청국장 추출물과는 달리 MAPK 분석에서 ERK, p38 및 JNK 등 모든 MAPK 관련분자를 인산화시킨 것으로 볼 때 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 발효 청국장 추출물은 LPS의 활성화 경로인 toll-like receptor4(TLR-4)와는 다른 경로를 통해 대식세포를 활성화할 가능성을 시사하였다. 일반적으로 세균을 포함하는 많은 천연물의 면역증강 활성은 균주 자체가 TLR 분자와 같은 수용체를 통해 면역세포를 활성화하거나 혹은 발효균주에 의한 기질의 분해 또는 형질전환을 통해 새롭게 생성된 물질에 의한 것으로 추정된다.
후속연구
- 일반적으로 세균을 포함하는 많은 천연물의 면역증강 활성은 균주 자체가 TLR 분자와 같은 수용체를 통해 면역세포를 활성화하거나 혹은 발효균주에 의한 기질의 분해 또는 형질전환을 통해 새롭게 생성된 물질에 의한 것으로 추정된다. 본 연구에서 사용한 청국장 추출물은 균주로부터의 성분은 물론 기질에 포함된 성분이 함께 혼합되어 있는 상태이므로 면역증강 활성과 관련된 기전을 명확하게 해석하기 위해서는 B. amyloliquefaciens(SRCM 100730) 발효 청국장 추출물의 성분에 대한 분석과 면역학적 특성에 대한 해석이 필요하다.
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