비지는 대두 가공 시 생산되는 부산물로 대부분 폐기되고 있는 실정이지만, 최근 비지를 유용한 자원으로 이용하기 위한 기능성 연구가 진행되고 있다. 그러나 비지의 항염증에 대한 연구가 미비하여 본 연구진은 비지추출물이 마우스 대식세포인 RAW264.7에 LPS에 의한 염증 반응에 미치는 영향을 평가하였다. 본 연구에서 비지추출물은 NF-${\kappa}B$와 p38의 활성 억제를 통해 만성염증 유발인자인 NO, iNOS, $PGE_2$, COX-2, TNF-${\alpha}$ 및 IL-$1{\beta}$의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서 비지는 독성과 부작용이 적은 항염증 관련 식의약 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
비지는 대두 가공 시 생산되는 부산물로 대부분 폐기되고 있는 실정이지만, 최근 비지를 유용한 자원으로 이용하기 위한 기능성 연구가 진행되고 있다. 그러나 비지의 항염증에 대한 연구가 미비하여 본 연구진은 비지추출물이 마우스 대식세포인 RAW264.7에 LPS에 의한 염증 반응에 미치는 영향을 평가하였다. 본 연구에서 비지추출물은 NF-${\kappa}B$와 p38의 활성 억제를 통해 만성염증 유발인자인 NO, iNOS, $PGE_2$, COX-2, TNF-${\alpha}$ 및 IL-$1{\beta}$의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서 비지는 독성과 부작용이 적은 항염증 관련 식의약 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
In this study, we evaluated anti-inflammatory effect of biji in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Biji inhibited the generation of NO and $PGE_2$ through the suppression of iNOS and COX-2 expression. In addition, biji attenuated the expression of TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\bet...
In this study, we evaluated anti-inflammatory effect of biji in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Biji inhibited the generation of NO and $PGE_2$ through the suppression of iNOS and COX-2 expression. In addition, biji attenuated the expression of TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ induced by LPS. Biji blocked LPS-mediated $I{\kappa}B-{\alpha}$ degradation and subsequently inhibited p65 nucleus accumulation in RAW264.7 cells, which indicates that biji inhibits NF-${\kappa}B$ signaling. In addition, biji suppressed p38 phosphorylation induced by LPS. Our results suggests that biji may exert anti-inflammatory activity through blocking the generation of the inflammatory mediators such as NO, $PGE_2$, iNOS, COX-2, TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ via the inhibiting the activation of NF-${\kappa}B$ and p38. From these findings, biji has potential to be a candidate for the development of chemoprevention or therapeutic agents for inflammatory diseases.
In this study, we evaluated anti-inflammatory effect of biji in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Biji inhibited the generation of NO and $PGE_2$ through the suppression of iNOS and COX-2 expression. In addition, biji attenuated the expression of TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ induced by LPS. Biji blocked LPS-mediated $I{\kappa}B-{\alpha}$ degradation and subsequently inhibited p65 nucleus accumulation in RAW264.7 cells, which indicates that biji inhibits NF-${\kappa}B$ signaling. In addition, biji suppressed p38 phosphorylation induced by LPS. Our results suggests that biji may exert anti-inflammatory activity through blocking the generation of the inflammatory mediators such as NO, $PGE_2$, iNOS, COX-2, TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ via the inhibiting the activation of NF-${\kappa}B$ and p38. From these findings, biji has potential to be a candidate for the development of chemoprevention or therapeutic agents for inflammatory diseases.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
비지는 대두 가공 시 생산되는 부산물로 대부분 폐기되고 있는 실정이지만, 최근 비지를 유용한 자원으로 이용하기 위한 기능성 연구가 진행되고 있다. 그러나 비지의 항염증에 대한 연구가 미비하여 본 연구진은 비지추출물이 마우스 대식세포인 RAW264.7에 LPS에 의한 염증 반응에 미치는 영향을 평가하였다. 본 연구에서 비지추출물은 NF-κB와 p38의 활성 억제를 통해 만성염증 유발인자인 NO, iNOS, PGE2, COX-2, TNF-α및 IL-1β의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.
본 연구는 비지의 항염증 관련 식의약 소재 적용을 위해 기초 자료를 확보하고자 비지 추출물의 세포기반 항염증 활성을 측정하였다.
제안 방법
7을 12-well plate 에 5 × 105 /well이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후 비지 추출물을 0, 0.2, 0.4, 0.8 또는 1.6 ㎎/㎖ 농도로 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 2 시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 18시간 배양하였다.
7을 12-well plate 에 5 × 105 /well이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후 비지 추출물을 0, 0.2, 0.4, 0.8 또는 1.6 ㎎/㎖ 농도로 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 2 시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 18시간 배양하였다.
NO는 Namkoong 등의 방법(Namkoong et al., 2015)을 변경하여 측정하였다. 마우스 대식세포 RAW264.
1A and 1B). NO와 PGE2의 생성은 각각iNOS와 COX-2에 의해 생성되기 때문에, 비지추출물의 NO와 PGE2 생성 억제가 iNOS와 COX-2 발현억제에 기인하는지 확인하기 위해 RT-PCR 방법으로 유전자 발현을 조사하였다. 그 결과, 비지추출물은 NO와 PGE2 생성억제와 유사하게 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하였다(Fig.
PGE2는 Namkoong 등의 방법(Namkoong et al., 2015)을 변경하여 측정하였다. 마우스 대식세포 RAW264.
Total RNA 추출은 비지추출물과 LPS가 처리된 RAW264.7 세포로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 수행되었고, cDNA는 1 ㎍의 total RNA를 Verso cDNA kit (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA)를 이용하여 제조되었다. PCR은 PCR master mix kit (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 수행되었고, 사용된 primer는 Table 1과 같다.
05% tween-20이 포함된 tris-buffered saline (TBS-T)로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 2차 항체는 5% non-fat dry milk에 용해 시켜 membrane에 상온에서 1시간 처리하였고, TBS-T로 5분간 3회 세척 후 membrane은 ECL western blotting substrate (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 단백질을 확인하였다.
비지추출물과 LPS가 처리된 RAW264.7 세포에서 단백질을 추출하기 위해서 세포를 1×phosphate-buffered saline (PBS)로 3회 세척한 후, protease inhibitor cocktail (SigmaAldrich)과 phosphatase inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)이 포함된 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Boston Bio Products, Ashland, MA, USA)를 4℃에서 30분간 처리하여 lysis시켜 단백질을 얻었다.
, Korea) 하여 사용하였다. 비지추출물은 건조된 비지를 증류수로 비지 무게 당 20배를 첨가하여 4℃에서 48시간 교반하면서 추출(Shaking Incubator, Hyang Scientific Equipment Co., LTD, Korea)하였다. 추출 후 상등액을 동결건조(EYELA Freeze Dryer, SUNIL EYELA CO.
, 2010). 비지추출물의 MAPK 의 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해, MAPK 구성인자인 ERK1/2와 p38의 인산화를 조사하였다. 비지추출물은 LPS에 의해서 유도되는 ERK1/2의 인산화에 대한 억제활성이 없었으 나 p38의 인산화는 비지추출물에 의해서 농도의존적으로 급격히 억제되는 것을 확인하였다(Fig.
비지추출물의 NF-κB 신호 전달 억제활성을 평가하기 위해 비지추출물의 LPS 유도 IκB-α 분해와 p65의 핵 내 전이 억제를 조사하였다.
비지추출물이 TNF-α와 IL-1β의 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해, LPS가 처리된 RAW264.7 세포에서의 비지추출물의 TNF-α와 IL-1β의 mRNA 발현조절을 조사하였다.
대상 데이터
Lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매되었고 western blot 분석을 위한 항체인 IκB-α, p65, p-ERK1/2, total-ERK1/2, p-p38, total-p38, TBP 및 β-actin은 Cell Signaling (Bervely, MA, USA)에서 구매되었다.
마우스 대식세포 RAW264.7의 배양을 위해 사용된 배지인 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/F-12 1:1 Modified Medium (DMEM/F-12)는 Lonza (Walkersville, MD, USA)에서 구매하였다.
, LTD, Korea) 하여 실험재료로 사용하였다. 본 연구에 사용된 비지원료인 청자콩은 중원대학교 박재호 교수에 의해 동정되었으며, 시료의 표본은(표본번호 Jeong-1001 (ANH)) 안동대학교 생약자원학과에 보관하고 있다.
본 연구에서 사용된 마우스 대식세포 RAW264.7은 한국세포주은행에서 구매되었고, RAW264.7세포는 Namkoong 등의 방법(Namkoong et al., 2015)에 따라 배양하였다. RAW264.
본 연구에서 사용된 비지는 경북 안동에 위치한 안동농협더햇식품사업소에서 국내산 청자콩(Glycine max, cv. Cheongjakong)을 이용하여 두부 생산 공정 중 두유와 비지를 분리하는 작업에서 배출된 생비지를 열풍건조(Forced Convenction Oven, Program-type, ENBIO Lab., Korea) 하여 사용하였다. 비지추출물은 건조된 비지를 증류수로 비지 무게 당 20배를 첨가하여 4℃에서 48시간 교반하면서 추출(Shaking Incubator, Hyang Scientific Equipment Co.
, LTD, Korea)하였다. 추출 후 상등액을 동결건조(EYELA Freeze Dryer, SUNIL EYELA CO., LTD, Korea) 하여 실험재료로 사용하였다. 본 연구에 사용된 비지원료인 청자콩은 중원대학교 박재호 교수에 의해 동정되었으며, 시료의 표본은(표본번호 Jeong-1001 (ANH)) 안동대학교 생약자원학과에 보관하고 있다.
데이터처리
모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 처리간 유의성은 Student’s t-test로 검증하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다(Microsoft Exel 2010).
이론/모형
2 시간 후 LPS를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 18시간 배양하였다. Nitric oxide의 측정은 Griess reagent system (Promoga)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
NO와 PGE2의 생성은 각각iNOS와 COX-2에 의해 생성되기 때문에, 비지추출물의 NO와 PGE2 생성 억제가 iNOS와 COX-2 발현억제에 기인하는지 확인하기 위해 RT-PCR 방법으로 유전자 발현을 조사하였다. 그 결과, 비지추출물은 NO와 PGE2 생성억제와 유사하게 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하였다(Fig. 1C). 염증반응을 유도하는 인자인 NO와 PGE2, 그리고 이 염증인자의 생성을 조절하는 iNOS와 COX-2의 조절은 항염증 관련 타겟으로 중요하다고 여겨지고 있기 때문에 비지추출 물의 iNOS와 COX-2발현 조절을 통한 NO와 PGE2 생성 억제는 비지추출물의 항염증 소재 적용에 대한 가능성을 보여주는 것 으로 판단된다
4). 본 결과는 비지추출물은 MAPK에서 p38의 활성화 억제를 통해 항염증 활성을 나타내는 것을 보여준다.
본 결과는 비지추출물은 NF-κB 신호전달 억제를 통해 항염증 활성을 나타내는 것을 보여준다
본 결과는 비지추출물이 TNF-α와 IL-1β의 mRNA 발현을 억제하여 항염증 활성을 나타내는 것으로 판단된다.
본 연구에서 비지추출물은 NF-κB와 p38의 활성 억제를 통해 만성염증 유발인자인 NO, iNOS, PGE2, COX-2, TNF-α및 IL-1β의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.
비지추출물의 MAPK 의 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해, MAPK 구성인자인 ERK1/2와 p38의 인산화를 조사하였다. 비지추출물은 LPS에 의해서 유도되는 ERK1/2의 인산화에 대한 억제활성이 없었으 나 p38의 인산화는 비지추출물에 의해서 농도의존적으로 급격히 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 본 결과는 비지추출물은 MAPK에서 p38의 활성화 억제를 통해 항염증 활성을 나타내는 것을 보여준다.
, 2002). 비지추출물의 NO와 PGE2 생성 억제효과를 측정한 결과, 비지추출물은 LPS가 처리된 RAW264.7 세포에서 농도의존적으로 NO와 PGE2의 생성을 억제하였다(Fig. 1A and 1B). NO와 PGE2의 생성은 각각iNOS와 COX-2에 의해 생성되기 때문에, 비지추출물의 NO와 PGE2 생성 억제가 iNOS와 COX-2 발현억제에 기인하는지 확인하기 위해 RT-PCR 방법으로 유전자 발현을 조사하였다.
1C). 염증반응을 유도하는 인자인 NO와 PGE2, 그리고 이 염증인자의 생성을 조절하는 iNOS와 COX-2의 조절은 항염증 관련 타겟으로 중요하다고 여겨지고 있기 때문에 비지추출 물의 iNOS와 COX-2발현 조절을 통한 NO와 PGE2 생성 억제는 비지추출물의 항염증 소재 적용에 대한 가능성을 보여주는 것 으로 판단된다
후속연구
본 연구에서 비지추출물은 NF-κB와 p38의 활성 억제를 통해 만성염증 유발인자인 NO, iNOS, PGE2, COX-2, TNF-α및 IL-1β의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서 비지는 독성과 부작용이 적은 항염증 관련 식의약 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비지란?
비지(Biji)는 두부 또는 두유를 제조하는 과정에서 생산되는 부산물로 제조과정에서 대두로부터 수용성물질이 빠져나간 상태이지만 인체에 유용한 성분이 남아 있는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 1996).
비지가 대부분 폐기물로 처리되는 이유는?
, 1996). 그러나 비지는 동물용 사료로 일부 활용되고 있으나 쉽게 부패되어 대부분은 폐기물로 처리되고 있는 실정이다(Kim et al., 1996).
염증을 줄이기 위한 항염증제의 종류는?
현존하는 항염증제는 히드로코르티손, 베타메타손 등의 스테로이드계와 아스피린, 이부르로펜 등의 비스테로이드계로 이들 항염증제는 위염, 신장염, 심장질환 등의 부작용을 초래하여 천연으로부터 안전한 항염증 관련 식의약소재 개발에 대한 연구가 진행되고 있다(Makins and Ballinger, 2003; Dogne et al., 2006).
참고문헌 (24)
Bogdan, C. 2001. Nitric oxide and the immune response. Nat. Immunol. 2:2907-2916.
Choi, M.S., J.I. Kim, J.B. Jeong, S.B. Lee, J.N. Jeong, H.J. Jeong, E.W. Seo, T.Y. Kim, O.J. Kwon and J.H. Lim. 2011. Suppressive effect of by-product extracts from soybean on adipocyte differentiation and expression of obesity-related genes in 3T3-L1 adipocytes. J. Life Sci. 21:358-367.
Delgado, A.V., A.T. McManus and J.P. Chambers. 2003. Production of tumor necrosis factor- ${\alpha}$ , Interleukin 1- ${\beta}$ , interleukin 2, and interleukin 6 by rat leukocyte subpopulations after exposure to substance. Proc. Neuropeptides. 37:355-361.
DuBois, R.N., M. Tsujii and P. Bishop. 1994. Cloning and characterization of a growth factor-inducible cyclooxygenase gene from rat intestinal epithelial cells. Am. J. Physiol. 266:822-827.
Gi, X., X. Liang, G. Luo, Q. Yu, H. Li, D. Wang, R. Li and X. Deng. 2010. Regulation of inflammatory mediators in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells by 2"-hydroxy-3"-en-anhydroicaritin involves down-regulation of NF-kappa B and MAPK expression. Int. Immunopharmacol. 10:995-1002.
Gracie, J.A., R.J. Forsey, W.L. Chan, A. Gilmour, B.P. Leung, M.R. Greer, K. Kennedy, R. Carter, X.O. Wei, D. Xu, M. Field, A. Foulis, F.Y. Liew and I.B. Mclnnes. 1999. A proinflammatory role for IL-18 in rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 104:1393-1401.
Kim, D.S., M.H. Seol and D.H. Kim. 1996. Changes in quality of soybean curd residue as affected by different drying methods. J. Korean Soc. Food Nutr. 25:453-459.
Kinne, R.W., R. Bruer, B. Stuhlmller, E. Palombo-Kinne and G.R. Burmester. 2000. Macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Res. 2:189-202.
Laskin, D. and K.J. Pendino. 1998. Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury. Annu. Rev. Pharmacol. 35:655-677.
Lee, H.N., D.Y. Lim, S.S. Lim, J.D. Kim and J.H.Y. Park. 2011. Anti-inflammatory effect of ethanol extract from Eupatorium japonicum. Korean J. Food Sci. Technol. 43:65-71.
Mariathasan, S. and D.M. Monack. 2007. Inflammasome adaptors and sensors: intracellular regulators of infection and inflammation. Nature Reviews. Immunology. 7:31-40.
Matsumoto, K., Y. Watanabe and S.I. Yokoyama. 2007. Okara, soybean residue, prevents obesity in a diet-induced murine obesity model. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71:720-727.
Namkoong S., S.A. Jang, E.H. Sohn, J.P. Bak, E. Sohn, H.J. Koo, W.J. Yoon, J.E. Kwon, Y.J. Jeong, X. Meng, H.S. Han and S.C. Kang. 2015. Comparative study of Litsea japonica leaf and fruit extract on the anti-inflammatory effects. Korean J. Plant Res. 28(2):145-152.
Park, S.M., S.H. Byun, Y.W. Kim, I.J. Cho and S.C. Kim. 2012. Inhibitory effect of Mori Folium ethanol extract on proinflammator mediator in lipopolysaccharide-activated RAW264.7 cells. Kor. J. Herbology 27(3):31-38.
Shi, M., Y. Yang, D. Guan, Y. Zhang and Z. Zhang. 2012. Bioactivity of the crude polysaccharides from fermented soybean curd residue by Flammulina velutipes. Carbohydr. Polym. 89:1268-1276.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.