[논문]LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포에 대한 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물의 항염증 효과

우현심; 이선민; 허정두; 이민성; 김영수; 김대욱

doi:10.7732/kjpr.2018.31.5.466

LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포에 대한 헛개나무(Hovenia dulcis) 추출물의 항염증 효과
Anti-inflammatory Activity of Extracts of Hovenia dulcis on Lipopolysaccharides-stimulated RAW264.7 Cells 원문보기

韓國資源植物學會誌 = Korean journal of plant resources, v.31 no.5, 2018년, pp.466 - 477

우현심 (국립경상대학교 응용생명과학부) , 이선민 (안전성평가연구소) , 허정두 (안전성평가연구소) , 이민성 (국립백두대간수목원) , 김영수 (국립백두대간수목원) , 김대욱 (국립백두대간수목원)

초록
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본 연구는 헛개나무 잎, 줄기, 뿌리로부터 얻어진 메탄올 추출물의 항염증 효과를 구명하기 위해서 수행되었다. LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포 내 부위별 추출물을 동시에 처리하여 염증 매개성 물질인 NO 생성량 분석 결과 $40{\mu}g/m{\ell}$농도에서 뿌리(94.7%)와 줄기(42.6%)에서는 효과가 있는 반면 잎에서는 효과가 없는 것으로 확인되었다. 이 중 탁월한 효과를 보인 뿌리 추출물(RE)의 항염증 효과 및 관련 분자적 기전을 확인하였다. 그 결과, 염증 반응의 주요 경로인 NF-kB 및 MAPK 신호전달경로에서 RE가 LPS로 유도된 NF-kB의 핵 이동을 억제하고, ERK, JNK, p38의 인산화를 억제함으로써 iNOS, COX-2의 발현이 감소되고, NO와 pro-inflammatory cytokine (IL-6, $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$)의 생성이 억제됨을 확인하였다. 또한 RE는 대식세포에서 Nrf2를 활성화시켜 항염증성 단백질인 HO-1 발현을 유도하여 항염증 효과를 나타내었다. 또한, RE로부터 주요 성분을 분리한 후 NMR과 MS 기기를 이용하여 구조 동정된 27-O-protocatechuoylbetulinic acid 화합물에서도 높은 항염증 효과를 확인하였다. 이러한 연구결과는 헛개나무뿌리와 그 주요성분은 의약품 소재 및 기능성 식품 등의 기능성 소재로 활용될 수 있는 기초적인 정보를 제공할 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the anti-inflammatory activities of the extracts of different parts of Hovenia dulcis such as leaves, stems, and roots were investigated. Among them, the roots extract (RE) showed the most potent suppressive effect against pro-inflammatory mediators in LPS-stimulated mouse macrophage cells. RE induced dose-dependent reduction of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) and concomitantly reduced the production of NO and $PGE_2$. Additionally, pre-treatment with RE significantly suppressed the production of inflammatory cytokines, such as tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$), interleukin $(IL)-1{\beta}$, and IL-6, as well as mRNA levels. Moreover, phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear translocation of nuclear factor-kappa B (NF-kB) were also strongly attenuated by RE in RAW264.7 cell. Furthermore, RE induced HO-1 expression through nuclear translocation of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) and increase HO-1 activity in RAW264.7 macrophages. Therefore, these results indicate that RE strongly inhibits LPS-induced inflammatory responses by blocking NF-kB activation, inhibiting MAPKs phosphorylation, and enhancing HO-1 expression in macrophages, suggesting that RE of H. dulicis and a major component, 27-O-protocatechuoylbetulinic acid could be applied as a valuable natural anti-inflammatory material.

주제어

표/그림 (10)

표 Table 1. Primer sequences used in this study
표 Table 2. HPLC conditions for separation of different part extract and major compound from H. dulcis
표 Table 3. Cell viability and in vitro decrease of nitric oxide production of different part of extract in LPS-stimulated RAW264.7 cells
그림 Fig. 1. Effects of RE on NO and PGE2 production, iNOS mRNA and COX-2 mRNA expression in LPS-stimulated RAW264.7 cells. RAW264.7 cells were stimulated with the indicated concentrations of RE in the presence or absence of LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h: (A) amounts of NO were determined using the Griess reaction in culture medium. (B) PGE₂ levels in the cell culture medium were detected by ELISA assay. (C and D) The iNOS and COX-2 protein levels were determined 6 h after LPS stimulation. GAPDH was used as an internal control for the real-time PCR assay (n = 4). The data represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.
그림 Fig. 2. Effects of RE on LPS-induced pro-inflammatory cytokine expression in RAW264.7 cells. Cells were treated with the indicated concentration of RE and/or LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h (for mRNA): (A) the protein levels of IL-6, IL-1β, and TNF-α in the culture medium were measured using ELISA. (B) The mRNA levels of IL-6, IL-1β, and TNF-α were determined using RT-PCR with specific primers. (C) Cell viability after treatment with RE for 24 h was evaluated by CCK-8 kit assay, and the results are expressed as percentages relative to the untreated control. Date represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.
$Fig. 3. Effects of RE on the activation of the NF-kB pathway in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Cells were pretreated for 30 min with the indicated concentrations of RE before LPS (1 ㎍/㎖) treatment for 5 min. Nuclear and cytosolic proteins were subjected to Western blot analysis with the indicated antibodies. β-Actin was used as internal controls for the cytosolic and nuclear fractions, respectively. Date represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.$ 그림 Fig. 3. Effects of RE on the activation of the NF-kB pathway in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Cells were pretreated for 30 min with the indicated concentrations of RE before LPS (1 ㎍/㎖) treatment for 5 min. Nuclear and cytosolic proteins were subjected to Western blot analysis with the indicated antibodies. β-Actin was used as internal controls for the cytosolic and nuclear fractions, respectively. Date represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.
그림 Fig. 4. Effect of RE on LPS-stimulated MAPKs activation in RAW264.7cells. Phosphorylation and total protein expression of ERK, p38, and JNK were extracts prepared from the cells RE treated with LPS-stimulated analyzed by western blot. Date represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.
그림 Fig. 5. Effect of RE on Cytosolic Nrf2, Nuclear Nrf2 and HO-1 expression in LPS-stimulated RAW264.7cells. Cells were pretreated for 1 h with various concentrations of RE (10-40 ㎍/㎖) and stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h. The Cytosolic Nrf2, Nuclear Nrf2 and HO-1 protein expression were analyzed by western blot analysis. The mRNA level was analyzed by real-time PCR. Date represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.
그림 Fig. 6. Effect of RE on iNOS, COX-2, HO-1 and Nrf2 expression in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Cell were pretreated with 10 μM SnPP for 1h prior to with various concentrations of RE (10-40 ㎍/㎖) and stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h. The iNOS, COX-2, HO-1 and Nrf2 protein expression were analyzed by western blot analysis. Date represent the mean ± S.D of three experiments. *p<0.05, **p<0.001 compared to LPS alone.
그림 Fig. 7. Representative HPLC chromatogram detected at 254 ㎚ for different parts extracts (A) and major compound (B) of H. dulcis (insert) Structure of 27-O-protocatechuoylbetulinic acid (1).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 헛개나무 부위별(잎, 줄기, 뿌리) 추출물의 NO 생성 억제효과에서 탁월한 뿌리 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 NO, PGE2의 생성량과 전염성 cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) 분비를 측정하였고, 그 조절 기전으로 HO-1과 MAPKs, Ik-Bα를 조사하였다. 또한, 헛개나무뿌리 추출물로부터 유효성분 분리 및 정제하여 분광학적 방법으로 화학 구조 동정에 대한 연구를 진행하고자 하였다.
본 연구에서는 헛개나무 부위별(잎, 줄기, 뿌리) 추출물의 NO 생성 억제효과에서 탁월한 뿌리 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 NO, PGE2의 생성량과 전염성 cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) 분비를 측정하였고, 그 조절 기전으로 HO-1과 MAPKs, Ik-Bα를 조사하였다. 또한, 헛개나무뿌리 추출물로부터 유효성분 분리 및 정제하여 분광학적 방법으로 화학 구조 동정에 대한 연구를 진행하고자 하였다.

제안 방법

뿌리추출물(RE)의 세포독성 유무를 알아보기 위하여 Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan)을 이용하여 측정하였다. RAW264.7 세포를 96 well plate에 2x10⁴ cells/㎖로 분주하고 24시간 배양한 다음, 뿌리 추출물(RE)를 농도별(0, 10, 20, 그리고 40 ㎍/㎖)로 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well 당 10 ㎕의 CCK-8 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂조건에서 2시간 반응시킨 후 microplate Reader (BioTek, Winooski, VT, USA)을 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
이중 HR4를 EtOAc:MeOH(30:1)의 혼합 용매로 preparative TLC를 실시하고 Sephadex LH-20 (95% MeOH)로 정제하여 화합물 1 (30 ㎎)을 얻었다. 최종 정제된 뿌리 추출물의 주요 성분은 Q Exactive plus Orbitrap LC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 와 900 MHz Bruker AVANCE II NMR(Bruker, MA, USA)을 통하여 얻은 화학 구조상의 수소 및 탄소 골격에 대한 정보를 얻어 정제된 주요 성분의 구조를 동정하였다.

대상 데이터

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 동결 상태로 구입하여 10% feta bovine serum (FBS)과 1% antibiotics(100 U/㎖ penicillin G, 100 ㎍/㎖ streptomycin)을 첨가한 DMEM 배지로 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 헛개나무 시료는 2017년 8월에 경남 고성군 일대의 야산에서 채취하였으며, 정확히 감정한 후에 음건·세절하여 실험에 사용하였으며, 표본은 국립백두대간수목원 자원식물 산업실에 보관하고 있다(PE01708130066). 분쇄된 헛개나무 잎, 줄기, 뿌리 건조 시료 1.

데이터처리

모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean±SE로 나타내었으며, 실험 결과에 대한 통계처리는 GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 Two-way ANOVA에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

성능/효과

또한 LPS를 처리한 군에서 Ik-Bα의 degradation이 무처리군과 비교하여 뚜렷이 나타났으며, RE에서는 LPS 처리 군과 비교하여 IkB-α의 degradation의 농도 의존적으로 발현을 감소하였다. 결과적으로 RE은 전사 인자인 NF-kB의 활성화를 감소시키고, downstream signaling molecule인 iNOS와 COX-2의 전사를 억제하며, NO의 생성을 감소시켜 항염증 효과를 나타냄을 유추할 수 있었다.
9는 protocatechuoyl group의 carboxy carbon을 확인할 수 있었다. 따라서 NMR 분광분석 및 MS 분석에 의하여 헛개나무뿌리 주요 성분의 화학구조가 lupane 계의 triterpenoid인 27-O-protocatechuoylbetulinic acid 임을 규명할 수 있었다(Kang et al., 2017).
RE의 첨가량이 높아질수록 인산화된 ERK, JNK, p-38의 발현이 LPS 처리 군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 RE는 MAPK의 활성화를 억제함으로써 항염증성 cytokine, NO, prostaglandin (PG)s와 같은 여러 염증성 매개인자들의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다.
2B). 이 결과들로 통해 RE는 TNF-α, IL-1β및 IL-6의 생성을 감소시킴으로써 iNOS의 발현을 조절하여 NO 생성을 억제하는 항염증 효과를 나타낸다는 것으로 확인하였다. 모든 실험에 사용된 RE의 농도별 세포독성 여부를 MTT assay를 통하여 알아보았으며 사용된 모든 농도에서 90% 이상의 생존율을 보여 RE은 RAW264.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	HO-1는 무엇인가?	Heme oxygenase (HO)의 대사를 조절하는 효소인 HO-1은 세포의 heme을 분해하여 carbon monoxide (CO), ferrous iron 및 biliverdin으로 전환하게 되고, biliverdin은 다시 환원효소에 의해 bilirubin으로 환원된다(Elbirt and Bonkovsky, 1999). HO-1과 생성된 부산물들은 항염증 및 항세포사멸에 관련된 유전자 발현과 효소의 활성에 영향과 산화적 스트레스로부터 세포와 조직을 보호하는 효소로 인식되고 있다(Gozzelino et al.
	헛개나무의 약리활성으로는 어떤 것들이 있는가?	, 2015). 지금까지 보고된 약리활성으로 단맛 억제 효과, 간세포 보호 효과, 근육 이완 억제 효과, 이뇨작용, 항산화 작용, 항암작용 및 당뇨 치료 효과 등이 보고되고 있다(Yand et al., 2013).
	헛개나무는 무엇인가?	헛개나무(Hovenia dulcis Thunb.)는 갈매나무과의 낙엽 활엽교목으로 내한성과 내음성이 강하고 맹아력이 강한 수종으로, 우리나라에서는 설악산, 오대산, 지리산 및 한라산 등에 주로 자라며, 중북부 지방보다는 남쪽 지방에서 잘 생육한다. 헛개나무의 많은 화학성분이 알려졌으며 주요 활성물질로는 saponins 계열의 Hovenoside I-VII, Hovacerboside A1,Hovenidulcioside A1, A2, B1, B2, Hoduloside III등과 Flavonoid 계열의 Quercetin, Kaempferol, (+) Ampelosin, Hovenitin I~III, Hovenodulinol 등이 분리되어 구조가 연구되었다(Park et al.

참고문헌 (19)

Elbirt, K.K. and H.L. Bonkovsky. 1999. Heme oxygenase: recent advances in understanding its regulation and role. Proc. Assoc. Am. Physicians 111:438-447.

상세보기
Forstermann, U. and W.C. Sessa. 2012. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33:829-837.

상세보기
Horwood, N.J., T.H. Page, J.P. McDaid, C.D. Palmer, J. Campbell, T. Mahon, F.M. Brennan, D. Webster and B.M. Foxwell. 2006. Bruton's tyrosine kinase is required for TLR2 and TLR4-induced TNF production, but not IL-6, production. J. Immunol. 176:3635-3641.

상세보기
Ghosh, G., V.Y. Wang, D.B. Huang and A. Fusco. 2012. NF- ${\kappa}B$ regulation: lessons from structures. Immunol. Rev. 246:36-38.

상세보기
Gozzelino, R.,V. Jeney and M.P. Soares. 2010. Mechanisms of cell protection by heme oxygenase-1. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 50:323-354.

상세보기
Jang, B.C., J.H. Paik, S.P. Kim, D.H. Shin, D.K. Song, J.G. Park and S.I. Suh. 2005. Catalase induced expression of inflammatory mediators via activation of NF-kappaB, PI3K/AKT, p70S6K, and JNKs in BV2 microglia. Cell. Signal. 17:625-633.

상세보기
Jeong, D.H., K.B. Kim, M.J. Kim, B.K. Kang and D.H. Ahn. 2014. Anti-inflammatory activity of methanol extract and n-hexane fraction mojabanchromanol b from Myagropsis myagroides. Life Sci. 114:12-19.

상세보기
Kang, K.B., J.B. Jun, J.W. Kim, H.W. Kim and S.H. Sung. 2017. Ceanothane-and lupine-type triterpene esters from the roots of Hovenia dulcis and their antiproliferative activity on HSC-T6 Cells. Phytochemistry 142:60-67.

상세보기
Kaur, G, M.N. Hughes, C.J. Green, P. Naughton, R. Foresti and R. Motterlini. 2003. Interaction of bilirubin and biliverdin with reactive nitrogen species. FEBS Lett. 543:113-119.

상세보기
Kim, B.H., Y.T. Lee and K.H. Kang. 2010. Codonopsis lanceolate inhibits inflammation through regulation of MAPK in LPS stimulated RAW264.7 cells. Korean J. Oriental Physiol. Pathol. 24:80-84.
Kim, D.H., J.H. Chung, J.S. Yoon, Y.M. Ha, S. Bae, E.K. Lee, K.J. Jung, M.S. Kim, Y.J. Kim and M.K. Kim. 2013. Ginsenoside Rd inhibits the expressions of iNOS and COX-2 by suppressing NF- ${\kappa}B$ in LPS-stimulated RAW264.7 cells and mouse liver. J. Ginseng Res. 37:54-63.

원문보기 상세보기
Kim, H.N., S.B. Park, G.H. Park, H.J. Eo, J.H. Song, H.Y. Kwon and J.B. Jeong. 2018. Anti-inflammatory effects of the root extracts from Hibiscus syriacus in LPS-stimulated RAW264.7 cells. Korean J. Plant Res. 31:211-217.
Lee, J.W. and Y.J. Kang. 2018. Anti-inflammatory effects of Abeliopyllum distichum flower extract and associated MAPKs and NF-kB pathway in Raw264.7 cells. Korean J. Plant Res. 31:202-210.
Majdalawieh, A. and H.S. Ro. 2010. Regulation of $I{\kappa}B{\alpha}$ function and NF- ${\kappa}B$ signaling: AEBP1 is a novel proinflammatory mediator in macrophages. Mediators Inflamm. 2010:823821.
Park, J.S., I.S. Kim, S.U. Rehman, C.S. Na and H.H. Yoo. 2015. HPLC determination of bioactive flavonoids in Hovenia dulcis fruit extracts. J Chromatogr Sci. 54:130-135.
Park, J.Y., J.Y. Moon, S.D. Park, W.H. Park, H. Kim and J.E. Kim. 2016. Fruits extracts of Hovenia dulcis Thunb. suppresses lipopolysaccharide-stimulated inflammatory responses through nuclear factor-kappaB pathway in Raw264.7 cells Asian Pac J Trop Med. 9:357-365.

상세보기
Tsan, M.F., J.E. White and C.L. Rosano. 1989. Modulation of endothelial GSH concentrations: effect of exogenous GSH and GSH monoethyl ester. J. Appl. Physiol. 66:1029-1034.

상세보기
Yang, H., K.H. Oh and Y.C. Yoo. 2015. Anti-inflammatory effect of hot water extract of Aronia fruits in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. J Korean Soc Food Sci. Nutr. 44:7-13.

원문보기 상세보기
Yang, J., S. Wu and C. Li. 2013. High efficiency secondary somatic embryogenesis in Hovenia dulcis Thunb. through solid and liquid cultures. Sci. World J. 718754:1-6.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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