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문제 정의
- 본 연구에서는 AAH의 항암작용을 알아보기 위하여 인간 유래 난소암 세포주인 ovarian cancer cell(carcinoma)을 사용하여, 세포주에 AAH를 투여한 후 세포 증식률에 미치는 영향, 세포 사멸의 양상과 관련 기전을 살펴보았으며, 동물실험에서는 생쥐 유래 carcinoma 세포를 사용하여 고형암을 유발시킨 후, 암종 크기 변화 및 생쥐의 생존율에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 이에 본 저자는 AAH이 난소암세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 난소암 세포주에 AAH를 투여한 후 세포 증식률에 미치는 영향, 세포 사멸 양상과 관련된 기전, 암종의 크기 변화 및 생쥐의 생존율에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 생쥐에 암종을 유발하기 위하여 미리 준비된 생쥐 유래 carcinoma 세포를 마리당 1×106개씩 우측 옆구리 부분에 주사하였다. 1주일 뒤, 고형암이 생기지 않은 개체는 실험에서 배제하고 적절히 실험군을 분류한 다음 저농도군(LOW)과 고농도군(HIGH)으로 나누어 각각 0.5과 2.5 g/kg으로 총 3주간 투여하였다. 실험군은 다음과 같다
- AAH가 유발하는 cell death가 apoptosis에 해당하는지 확인하기 위해 Annexin V와 7-AAD를 이용하여 double staining을 시행하였다. 먼저 100 mm dish(SPL, Korea) 에 5×106 cell/well의 농도로 세포를 분주하고 overnight incubation을 시행하였다.
- Ovarian cancer cell(carcinoma)에 AAH를 투여하고 24시간 뒤 역상 현미경과 카메라(Nikon ELWD, Japan)를 이용하여 세포 형태를 관찰하였다(40x).
- 배양이 끝난 후, 배양액을 제거하고, 세포를 수거하여, 75% 에탄올에 고정하였다. 고정이 끝난 후 40 μg/ml 의 RNase를 함유하고 있는 인산완충액에 부유시키고 10 μg/ml의 PI(BD Biosciences, USA)와 함께 실온에서 30분간 반응시킨 후 유세포 분석을 시행하였다.
- 난소암세포주인 ovarian cancer cell(carcinoma)의 생육 배지로는 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지에 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco, USA) 와 penicillin-streptomycin(100 units/ml, 100 μg/μl, Sigma, USA)를 첨가하여 사용하였으며, 생쥐 유래 carcinoma 세포의 생육 배지로는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)에 10% fetal bovine serum와 penicillin-streptomycin을 첨가 하여 사용하였고, 37℃, 5% CO2가 공여되는 환경에서 유지시켰다.
- 의 방법을 이용하였다. 생쥐에 암종을 유발하기 위하여 미리 준비된 생쥐 유래 carcinoma 세포를 마리당 1×106개씩 우측 옆구리 부분에 주사하였다. 1주일 뒤, 고형암이 생기지 않은 개체는 실험에서 배제하고 적절히 실험군을 분류한 다음 저농도군(LOW)과 고농도군(HIGH)으로 나누어 각각 0.
- 세포 주기에 미치는 영향은 Krtolica 등23)의 방법을 적절히 변형하여 사용하였다. 100 mm dish(SPL, Korea)에 5×106 cell/well의 농도로 세포를 분주하고 overnight incubation 을 시행한 다음, AAH를 처리하고 24시간을 배양하였다.
- 암종 크기에 미치는 영향의 측정이 끝난 후, AAH의 투여를 중단하고 계속 관찰하면서 개체의 생존율에 미치는 영향을 측정하였다.
- 이렇듯 난소암 세포에 대하여 항암효과가 확인된 AAH가 생체 내에서도 항암작용에 관여하는지 살펴보기 위하여 allograft 모델을 이용한 in vivo 연구를 수행하였다. 본 연구에서 총 4주간의 관찰기간 동안 대조군과 비교하여 특이한 체중 변화는 관찰되지 않았으며(Fig.
- 표면적으로 암종의 크기를 잴 수 있는 기간인 실험 14일 차부터 주 1회 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo, Japan)를 이용하여 암종의 크기를 쟀으며, 다음의 공식에 의하여 크기를 계산하였다.
대상 데이터
- 7주령 된 암컷 Balb/c 생쥐를 샘타코(Incheon, Korea)에서 구입하였으며, 모든 실험동물은 일주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 온도와 습도가 조절되는 환경(24±3℃, 12-hr light-dark cycle)에서 고형사료와 물을 마음껏 섭취하게 하며 실험에 사용하였다.
- AAH는 경남 산청 지역에서 수확된 지상부로 동신대학교 부속 목포 한방병원을 통하여 구입 정제하여 사용하였다.
- 인간 유래 난소암세포주인 ovarian cancer cell(A2780, carcinoma)는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 냉동상태로 구매하여 사용하였으며, 생쥐 유래 carcinoma 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 구매하였고, 두 세포주 모두 일주일 이상 계대 배양하여 실험 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- ) 를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준 편차(mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- AAH가 ovarian cancer cell(carcinoma) 의 증식율에 미치는 영향 측정은 MTT assay 를 이용하여 확인하였다. 24-well plate에 5×105 cell/well의 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2 환경에서 overnight incubation을 시행 후 다음날, AAH를 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
- AAH의 항암 효과를 살펴보기 위하여 Kollmar 등24)의 방법을 이용하였다. 생쥐에 암종을 유발하기 위하여 미리 준비된 생쥐 유래 carcinoma 세포를 마리당 1×106개씩 우측 옆구리 부분에 주사하였다.
- 얻어진 상층액 내에 있는 단백질 함량은 Bicinchoninic acid(BCA)법을 이용해 정량한 다음 200 mg의 단백질을 이용하여 caspase 3 및 caspase 6의 활성을 측정하였다. Caspase 3 및 caspase 6의 활성은 colorimetric method를 이용하여 측정되었으며, 먼저 50 μl의 샘플과 10% 의 DTT를 함유하고 있는 50 μl의 reaction buffer와 5 μl의 4 mm DEVD-p-NA substrate를 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시킨 후, Microplate reader(Bio-rad, USA)을 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 수거한 세포는 3, 000 rpm에서 5분간 원심분리한 다음, kit에 포함된 cell lysis buffer와 함께 ice 위에서 10분간 반응시켜 세포를 파괴한 후, 3, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액 내에 있는 단백질 함량은 Bicinchoninic acid(BCA)법을 이용해 정량한 다음 200 mg의 단백질을 이용하여 caspase 3 및 caspase 6의 활성을 측정하였다. Caspase 3 및 caspase 6의 활성은 colorimetric method를 이용하여 측정되었으며, 먼저 50 μl의 샘플과 10% 의 DTT를 함유하고 있는 50 μl의 reaction buffer와 5 μl의 4 mm DEVD-p-NA substrate를 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시킨 후, Microplate reader(Bio-rad, USA)을 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 1. 난소암 세포 증식률의 유의한 감소, 세포 수 감소 및 세포 형태의 변화가 다수 관찰되어 AAH가 난소암 세포의 사멸에 관여함을 확인하였다.
- 100 μg/ml, 200 μg/ml 및 400 μg/ml 투여군에서 유의한 세포 증식률 감소가 관찰되었으며, 증식 억제 효과는 농도 의존적이었다(Fig. 1).
- 2. AAH가 일으키는 세포사는 apoptosis 이며, 난소암 세포의 cell cycle에는 특별한 영향을 미치지 않았다.
- 3. AAH는 caspase 3 및 caspase 6의 활성도를 유의한 수준으로 상승시켰으며 apoptosis가 내인성 경로의 활성화와 관계있음을 확인하였다.
- 4. AAH의 항암작용은 p38 경로 억제와 관련 있을 가능성을 시사한다.
- 5. AAH는 저농도 및 고농도 투여군에서 유의한 수준의 생존율 연장효과를 보였다.
- 일반적으로 7-AAD는 정상세포와 necrosis 또는 apoptosis를 일으키고 있는 세포의 구분에도 사용된다30) . AAH가 일으키는 세포사가 어떤 종류인지 살펴보기 위하여 annexin V와 7-AAD double stain을 시행한 결과 농도 의존적으로 apoptosis가 늘어나는 경향을 보였으며, 특히 late apoptosis에서 농도 의존적 양상이 두드러졌다(Fig. 3, 4).
- 이러한 결과는 AAH가 시험관 내 뿐만 아니라 생체 내에서도 항암작용이 있음을 시사한다. 마지막으로 암종이 주사된 개체의 생존율에 미치는 영향을 관찰한 결과 저농도 및 고농도 투여군에서 유의한 수준의 생존율 연장효과를 보였다(Fig. 11).
- 세포 사멸의 형태를 관찰한 결과 농도 의존적으로 apoptosis가 증가되는 경향을 보였다. Early apoptosis(Q2)의 경우 50 μg/ml에서 최대치를 보였다가 100 μg/ml 투여군에서는 감소되었으며, late apoptosis (Q3)의 경우 농도 의존적으로 증가되는 경향을 보였다(Fig.
- 세포 증식률에 미치는 영향과 동일한 세포 수의 감소와 함께 동그랗게 응축된 형태의 사멸된 세포들이 관찰되었으며, 사멸된 세포의 수 역시 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 2).
후속연구
- 이상의 실험결과를 통하여, AAH은 난소암 세포의 증식율 감소, 세포 수 감소 등 난소암 세포의 사멸에 영향을 미치는 항암효과가 있는 것으로 보이며, 향후 AAH의 항암효과에 대한 다양하고 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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