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가설 설정
- E/I ratio of GABA and Glutamate from cerebellum or cerebrum. A: Intracellular E/I ratio in cerebellar astrocytes. B:Intracellular E/I ratio in cerebral astrocytes (p value: 0.
- G: Extracellular glutamine concentration in cerebellar astrocyte. H: Extracellular glutamine concentration in cerebral astrocyte.
- G: Extracellular glycine concentration in cerebellar astrocyte. H: Extracellular glycine concentration in cerebral astrocyte. I: Intracellular taurine concentration in cerebellar astrocyte (p value: 0.
제안 방법
- HPLC (High performance liquid chromatography)는 서울대학교 내부에 있는 연구기관인 서울대학교 농생명과학 공동기기원(NICEM)에 의뢰하여 분석하였다. HPLC는 Ultimate 3000 (pump, auto sampler, oven and UV / Thermo dionex, USA)를 사용하여 진행했고, fluorescence detector로는 emission 450 nm, excitation 340 nm (OPA)과 emission 305 nm, excitation 266 nm (FMOC)를 사용했으며 UV detector를 이용했다.
- HPLC 분석을 위한 최소 용매의 부피를 200 μl으로 맞추기 위해 세포 외 신경아교전달물질 샘플에는 배지 200 μl를 추가하여 충분히 섞어주고 세포 내의 신경아교전달물질 샘플에는 RIPA buffer 200 μl를 추가하여 각각의 농도를 1/5로 희석하여 분석을 의뢰하였다.
- 각 PCR 조성은 총 부피가 50 μl로 i-starTaqTM PCR core kit (Intronbio, Cat# 25161)를 사용하여 추출하였다.
- 아미노산 분석은 aspartic acid, glutamic acid, asparagine, serine, glutamine, histidine, glycine, threonine, arginine, alanine, taurine, GABA, tyrosine, valine, methionine, tryptophan, phenylalanine, isoleucine, leucine, lysine, proline 물질들을 조사하였다. 그 중 glutamate, glutamine, glycine, taurine 위주로 분석하였으며, 유전자형별 세포 내부(cell lysate)와 외부(media)로 나누어 진행하였다.
- 따라서 본 논문에서는 GIT1 생쥐의 유전형(genotype)별 별아교세포가 생성 및 분비하는 GABA를 비롯한 여러 종류의 신경아교전달물질(gliotransmitter)에 차이가 있을 것이라 예상하고 GIT1 (ADHD 모델) 생쥐의 유전형별로 별아교세포 배양(astrocyte primary culture)을 한 후 세포 내/외의 신경아교전달물질을 비교하였다. 또한 대뇌와 소뇌에서 발현되는 신경아교전달물질에도 차이가 있을 수 있으므로 각각을 분리하여 실험을 진행하였다.
- 따라서 본 논문에서는 GIT1 생쥐의 유전형(genotype)별 별아교세포가 생성 및 분비하는 GABA를 비롯한 여러 종류의 신경아교전달물질(gliotransmitter)에 차이가 있을 것이라 예상하고 GIT1 (ADHD 모델) 생쥐의 유전형별로 별아교세포 배양(astrocyte primary culture)을 한 후 세포 내/외의 신경아교전달물질을 비교하였다. 또한 대뇌와 소뇌에서 발현되는 신경아교전달물질에도 차이가 있을 수 있으므로 각각을 분리하여 실험을 진행하였다.
- 먼저 중추신경계 대표적 흥분성 신경전달물질인 glutamate와 원료가 되는 glutamine을 소뇌에서 세포내외, 대뇌에서 세포내외 별로 분석하였다. Glutamate는 소뇌에서 세포내외 모두 HE에서 가장 많이 존재하였으며 대뇌에서도 HE에서 가장 많이 존재하였다(Fig.
- 배양을 진행하기 전, 별아교세포가 배양 접시(culture dish)에 잘 달라붙게 하기 위해 dish (60x10 nm)에 PDL (poly-D-lysine, Corning biocoat, Cat# 54210) 코팅을 진행 했다. PDL 코팅은 별아교세포의 세포 결합을 강화하여 세포의 부착, 성장을 돕는다.
- 배양한 별아교세포의 배지와 세포에서 얻은 lysate을 샘플로 하여 NICEM (서울대학교 농생명과학 공동기기원)에 아미노산 분석을 의뢰했다. 아미노산 분석은 aspartic acid, glutamic acid, asparagine, serine, glutamine, histidine, glycine, threonine, arginine, alanine, taurine, GABA, tyrosine, valine, methionine, tryptophan, phenylalanine, isoleucine, leucine, lysine, proline 물질들을 조사하였다.
- 소뇌와 대뇌 모두 세포 안팎의 아교세포전달물질의 차이를 보기 위해 새 배지로 교체한 후 4일 뒤에 추출했다. 별아교세포가 가득 차면 RIPA (radio immunoprecipitation assay) buffer를 사용하여 접시 안의 별아교세포를 떼어낸 후 샘플 추출을 진행한다.
- 샘플 추출은 배양한 날을 기준으로 8일차인 그 다음 주에 진행되었다. 소뇌와 대뇌 모두 세포 안팎의 아교세포전달물질의 차이를 보기 위해 새 배지로 교체한 후 4일 뒤에 추출했다. 별아교세포가 가득 차면 RIPA (radio immunoprecipitation assay) buffer를 사용하여 접시 안의 별아교세포를 떼어낸 후 샘플 추출을 진행한다.
- 배양한 별아교세포의 배지와 세포에서 얻은 lysate을 샘플로 하여 NICEM (서울대학교 농생명과학 공동기기원)에 아미노산 분석을 의뢰했다. 아미노산 분석은 aspartic acid, glutamic acid, asparagine, serine, glutamine, histidine, glycine, threonine, arginine, alanine, taurine, GABA, tyrosine, valine, methionine, tryptophan, phenylalanine, isoleucine, leucine, lysine, proline 물질들을 조사하였다. 그 중 glutamate, glutamine, glycine, taurine 위주로 분석하였으며, 유전자형별 세포 내부(cell lysate)와 외부(media)로 나누어 진행하였다.
- 억제성 신경전달물질로는 GABA와 glycine 그리고 taurine을 위주로 분석하였다. 분석결과, 이 세가지 억제성 신경전달물질 모두 비슷한 경향을 보였는데, 소뇌의 세포외 taurine과 대뇌 세포 외 GABA를 제외한 모든 부위에서 억제성 신경전달물질이 HE에서 가장 높은 수치를 나타냈다(Fig.
- 1A). 유전형별 신경아교전달물질의 차이를 보기 위해 배양 전 생쥐의 꼬리에서 추출한 DNA에 WT과 KO에 대한 primer를 이용하여 DNA를 증폭 시킨 후 2% agarose gel에 전기영동하여 유전자형을 확인했다(Fig. 1B). 예를 들어, 그림의 별아교세포 배양을 진행한 8마리의 유전형 분석 결과에서 1번, 2번과 5번 생쥐는 WT primer를 사용한 lane에서만 밴드가 나타났고 band size가 500 bp이므로 WT의 유전형을 갖고 있다.
- 유전형별 신경아교전달물질의 차이를 보기 위해서 cell culture를 진행하기 전 꼬리 끝부분을 잘라 DNA를 추출하여 PCR을 통해 증폭시킨 뒤 전기영동으로 확인하였다. 야생형(WT)과 넉아웃형(KO)에 대한 각각의 primer (10 pmole/μl)를 사용한다.
- 억제성 신경전달물질과 흥분성 신경전달물질을 분석한 결과, 소뇌와 대뇌의 결과는 차이를 보였다. 흥분성과 억제성의 전체적 균형을 살펴 보기 위해 glutamate와 GABA를 기준으로 E/I (excitatory/inhibitory) ratio를 분석하였다(Fig. 4). 그 결과, 비록 통계적으로 유의하지는 않지만 소뇌에서는 KO이 가장 높은 E/I ratio를 가지고 있었다(Fig.
대상 데이터
- GIT 생쥐 모델은 Git1 유전자와 ADHD의 연관성을 보고한 KAIST 김은준 교수 연구팀(현 IBS 시냅스 뇌질환 연구단)[13]에서 각 유전자형을 분양 받아 mating cage를 만들어 개체 수를 늘린 후 실험에 사용 되었다. 실험에 사용된 GIT1 생쥐모델로는 야생형(WT, wild Type(+/+))과 이종형(HE, hetero Type(+/-)), 넉아웃형(KO, knock Out(-/-))의 세 종류가 있다.
- HPLC (High performance liquid chromatography)는 서울대학교 내부에 있는 연구기관인 서울대학교 농생명과학 공동기기원(NICEM)에 의뢰하여 분석하였다. HPLC는 Ultimate 3000 (pump, auto sampler, oven and UV / Thermo dionex, USA)를 사용하여 진행했고, fluorescence detector로는 emission 450 nm, excitation 340 nm (OPA)과 emission 305 nm, excitation 266 nm (FMOC)를 사용했으며 UV detector를 이용했다. 과정은 다음과 같다.
- GIT 생쥐 모델은 Git1 유전자와 ADHD의 연관성을 보고한 KAIST 김은준 교수 연구팀(현 IBS 시냅스 뇌질환 연구단)[13]에서 각 유전자형을 분양 받아 mating cage를 만들어 개체 수를 늘린 후 실험에 사용 되었다. 실험에 사용된 GIT1 생쥐모델로는 야생형(WT, wild Type(+/+))과 이종형(HE, hetero Type(+/-)), 넉아웃형(KO, knock Out(-/-))의 세 종류가 있다. 모든 동물실험은 단국대학교 동물실험윤리위원회의 기준을 따랐다(동물 실험 승인 번호: DKU-17-022).
데이터처리
- HPLC 결과 분석은 T-test를 이용하여 유전형 간의 차이를 보았다. 또한 유전형별로 흥분성/억제성(excitatory/inhibitory) 비율 분석을 위해서는 ANOVA (analysis of variance) test를 진행하였다(p<0.
- 또한 유전형별로 흥분성/억제성(excitatory/inhibitory) 비율 분석을 위해서는 ANOVA (analysis of variance) test를 진행하였다(p<0.05 (*), p<0.01(**), p<0.001(***)).
성능/효과
- 예를 들어, 그림의 별아교세포 배양을 진행한 8마리의 유전형 분석 결과에서 1번, 2번과 5번 생쥐는 WT primer를 사용한 lane에서만 밴드가 나타났고 band size가 500 bp이므로 WT의 유전형을 갖고 있다. 6번, 7번과 8번 생쥐는 KO primer를 사용한 lane에서만 600~700 bp 사이의 밴드가 나타났으므로 KO의 유전형을 갖고 있으며, 3번과 4번 생쥐는 WT과 KO 둘 모두에서 밴드가 나타났으므로 HE의 유전형을 갖고 있다고 판별 할 수 있었다(Fig. 1C).
- 4). 그 결과, 비록 통계적으로 유의하지는 않지만 소뇌에서는 KO이 가장 높은 E/I ratio를 가지고 있었다(Fig. 4A, Fig. 4C). 물질분석에서 glutamate와 GABA은 세포내와 세포외 모두 HE가 가장 많은 양으로 존재했지만(Fig.
- 따라서 소뇌의 세포 내에서 KO이 WT보다 더 많은 흥분성 전달물질을 가지며(Fig. 2A, Fig. 2E) 세포 외에서는 KO보다는 WT에 더 많은 양을 가지는 경향을 보였다(Fig. 2C, Fig. 2G). 대뇌 또한 세포내에서 KO이 WT보다 더 많은 흥분성을 가지고 있는 경향을 보였다(Fig.
- 이는 GIT1 KO의 소뇌 피질에서 방출되는 GABA의 양이 감소되는 것을 확인한 선행 연구 결과와 차이가 있어 보이는데[7], KO의 소뇌에서 GABA 분비가 제대로 이루어지지 않거나 혹은 상호보완적으로 더 많은 양의 억제성 신경전달물질을 합성한다는 가능성을 제시할 수 있다. 또한 대뇌의 세포 내에서는 KO에서 가장 적은 양의 GABA가 존재했지만, 세포외에서는 다른 억제성 신경전달물질들과는 달리 HE가 아닌 KO에서 GABA가 가장 많이 존재했다(Fig. 3D). 이는 대뇌에서 분비하는 억제성 신경전달 물질이 흥분성을 억제하기위해 억제성 신경전달물질의 분비를 증가시키거나 또는 세포 외에 존재하는 억제성 신경전달물질의 재흡수가 제대로 이루어지지 않을 가능성을 제시할 수 있다(Fig.
- 3). 먼저, 소뇌를 살펴보면, 세포내에서는 억제성 신경전달물질이 HE에서 가장 많이 존재했으며 KO이 WT보다 많은 양을 가졌다(Fig. 3A, Fig. 3E, Fig. 3I). 반면 세포 외에서는 비록 통계적으로 유의미하지는 않지만 WT이 KO보다 많은 양을 가지고 있었다(Fig.
- 4C). 물질분석에서 glutamate와 GABA은 세포내와 세포외 모두 HE가 가장 많은 양으로 존재했지만(Fig. 2A, Fig. 2C, Fig. 3A, Fig. 3C) E/I ratio는 KO이 가장 높은 것으로 나타나 GIT1이 제거된 생쥐는 흥분성이 증가해 있고 따라서 과잉행동을 보이는 ADHD의 특성을 뒷받침할 수 있을 것이다.
- 반면 대뇌에서는 HE가 가장 높은 E/I ratio를 보였으며 세포내에서는 KO이 WT보다 높아 더 흥분성이 증가된 것으로 보이나, 세포외에서는 WT이 KO보다 더 큰 흥분성을 가지고 있었다(Fig. 4B, Fig. 4D). 이에 따라, 앞서 제시한 GIT1 KO은 세포내에서 세포외로 흥분성 신경전달물질을 내보내는 과정이나 흥분성 신경전달물질 수용체에 WT과 차이가 있을 가능성을 제시한다.
- 억제성 신경전달물질로는 GABA와 glycine 그리고 taurine을 위주로 분석하였다. 분석결과, 이 세가지 억제성 신경전달물질 모두 비슷한 경향을 보였는데, 소뇌의 세포외 taurine과 대뇌 세포 외 GABA를 제외한 모든 부위에서 억제성 신경전달물질이 HE에서 가장 높은 수치를 나타냈다(Fig. 3). 먼저, 소뇌를 살펴보면, 세포내에서는 억제성 신경전달물질이 HE에서 가장 많이 존재했으며 KO이 WT보다 많은 양을 가졌다(Fig.
- 억제성 신경전달물질과 흥분성 신경전달물질을 분석한 결과, 소뇌와 대뇌의 결과는 차이를 보였다. 흥분성과 억제성의 전체적 균형을 살펴 보기 위해 glutamate와 GABA를 기준으로 E/I (excitatory/inhibitory) ratio를 분석하였다(Fig.
- 2G). 이 결과를 종합하였을 때, KO이 WT보다 세포 내에서 더 많은 흥분성 전달물질을 지니며 이는 ADHD 모델의 세포 내에서 합성되는 흥분성전달물질의 양이 WT보다 증가되어 축적되는 거라 여겨진다.
후속연구
- 본 연구는 별아교세포 특이적 배양을 진행했기 때문에 실제 뇌에 존재하는 다른 세포들과의 상호작용이 배제되었고 in vivo 환경과 차이가 있다는 한계가 있다. 따라서 다음 연구에서는 뉴런(neuron)과 교세포(glial cell)의 공동배양(co-culture)을 진행하여 신경세포와 교세포의 상호작용을 바탕으로 한 보다 거시적인 분석을 할 수 있을 것이다.
- 또한 이 실험에 사용한 생쥐들의 성별을 토대로 임상에서 남아가 여아보다 ADHD 발병률이 높은 문제에 대해서도 별아교세포 유래 신경전달물질의 차이를 분석해 볼 수 있을 것이다.
- 본 연구는 별아교세포 특이적 배양을 진행했기 때문에 실제 뇌에 존재하는 다른 세포들과의 상호작용이 배제되었고 in vivo 환경과 차이가 있다는 한계가 있다. 따라서 다음 연구에서는 뉴런(neuron)과 교세포(glial cell)의 공동배양(co-culture)을 진행하여 신경세포와 교세포의 상호작용을 바탕으로 한 보다 거시적인 분석을 할 수 있을 것이다.
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