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문제 정의
- 따라서 본 연구는 tight junction 유전자의 mRNA 발현에 미치는 蘇木과 그 지표물질 brazilin의 영향을 조사하였고, 추가적으로 蘇木과 brazilin 처리에 의한 인간 유래 각질 형성 세포(human keratinocyte cell line)인 HaCaT 세포의 세포-세포 부착 강도 강화 효과를 확인하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 蘇木이 피부를 구성하는 각질 형성 세포에서 피부 장벽과 밀접한 연관이 있는 tight junction에 미치는 영향을 알아보기 위해 대표적인 tight junction 관련 유전자의 발현량을 확인하였다. qRT-PCR을 통해 tight junction 유전자의 mRNA 발현 변화를 확인하기에 앞서 蘇木이 HaCaT 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 MTS assay를 통해 확인하여, 이후 HaCaT 세포에 처리할 수 있는 蘇木의 유효한 농도를 설정하였다.
- 앞 선 연구에서 蘇木의 처리에 의해 HaCaT 세포의 claudin3, caludin 6, ZO-2의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인하였다. HaCaT 세포의 tight junction 유전자 발현 변화에 미친 蘇木의효과가 蘇木 추출물에 포함된 다양한 유효 물질 중 대표적인 지표 물질인 brazilin과 연관이 있는 것인지 확인하기 위해 brazilin을 이용하여 같은 실험을 수행하였다. Brazilin 처리에 의해 HaCaT세포의 세포 생존율이 증가하는 것을 MTS assay를 통해 확인하였으며, 1 µg/ml에서 177.
- 본 연구에서는 열수 추출 방법으로 얻은 蘇木 추출물에 항산화 효능을 나타내는 蘇木의 유효성분들이 효과적으로 추출되었는지에 대한 물성 검증을 위해 蘇木과 brazilin의 항산화 효능을 ABTSassay로 검증하였고, 蘇木과 brazilin 모두 농도 의존적인 항산화 효능을 가지는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서 蘇木과 그 지표물질 brazilin에 의한 HaCaT 세포의 tight junction 유전자 발현에 변화와 항산화 효능 및HaCaT 세포의 세포-세포 부착 강도 강화 효과를 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid) assay를 이용하여 蘇木과 brazilin의 항산화 효능을 측정하였다.
- 추출한 RNA는 Qubit 2.0 fluorometer로 정량 하였고, 이렇게 추출하여 정량한 total RNA로 cDNA를 합성하기 위하여 total RNA 2 μg, dNTP mix (10 mM) 2 μL, random hexamer (100 pmol/μL) 2 μL를 넣은 후DEPC-treated water로 총 부피 20 μL가 되도록 하였다.
- 2X Prime Q-master mix 10 μL, 10pmol/μL의 forward primer와 reverse primer를 각각 1.5 μL,nuclease free water 2 μL, 합성한 후 1/5로 희석시킨 cDNA 5μL를 넣은 뒤 95℃에서 denaturation 20 s, 58℃에서 annealing 20 s, 72℃에서 elongation 20 s를 40 cycle 실시하는 조건 하에서 AriaMx 를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
- 65℃에서 5 min간 반응시킨 후 즉시 얼음에 냉각시킨 다음, 각각 5XM-MLV RT reaction buffer 8 μL, M-MLV reverse transcriptase 2 μL, RNase inhibitor 2 μL, DEPC-treated water 8 μL를 추가적으로 첨가해 주었다.
- 그 후 MTS 시약을 첨가하고 microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 시료를 처리한 세포의 생존율을 백분율로 표시하여 상대적인 독성을 측정하였다.
- 그 후 각각의 well에 蘇木과brazilin을 1 μg/ml로 처리하여 다시 48 h 동안 배양하였다. 시료가 첨가된 배지를 제거한 후 PBS로 세척한 뒤 RiboEx 1 ml로 세포를 lysis 한 다음, hybrid-R RNA purification kit (Geneall,Korea)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Qubit 2.
- 4 U/ml의 dispase II가 포함된 배지로 교환하고, 37℃에서 30 min 동안 배양하여 비 접착 세포 단층을 얻었다. 이후 dispase II가 포함된 배지를 제거하고, 세포 단층을 PBS로 조심스럽게 세척 한 후 12-well culture dish에 물리적인 충격을 주어 단편을 얻고 이를 디지털 카메라를 사용하여 사진을 촬영하였다. 각각의 well에서 얻은 단편의 개수를 센 후 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 蘇木과 brazilin을 처리한 단편의 수를 백분율로 표시하여 상대적인 단편의 수를 확인하였다.
- 이후 dispase II가 포함된 배지를 제거하고, 세포 단층을 PBS로 조심스럽게 세척 한 후 12-well culture dish에 물리적인 충격을 주어 단편을 얻고 이를 디지털 카메라를 사용하여 사진을 촬영하였다. 각각의 well에서 얻은 단편의 개수를 센 후 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 蘇木과 brazilin을 처리한 단편의 수를 백분율로 표시하여 상대적인 단편의 수를 확인하였다.
- . 우리는 蘇木의 다양한 유효 성분들이 열수 추출에 의해 효과적으로 추출되었는지 검증하기 위하여 ABTS assay를 통해 蘇木과 brazilin이 가지는 항산화 효능을 검증하였으며, 항산화 효능이 입증된 resveratrol을 이용하여 실험의 신뢰성을 확보하였다. 그 결과,resveratrol의 항산화 효능은 농도 의존적으로 증가하여 100 µM에서 81.
- 본 연구에서는 蘇木이 피부를 구성하는 각질 형성 세포에서 피부 장벽과 밀접한 연관이 있는 tight junction에 미치는 영향을 알아보기 위해 대표적인 tight junction 관련 유전자의 발현량을 확인하였다. qRT-PCR을 통해 tight junction 유전자의 mRNA 발현 변화를 확인하기에 앞서 蘇木이 HaCaT 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 MTS assay를 통해 확인하여, 이후 HaCaT 세포에 처리할 수 있는 蘇木의 유효한 농도를 설정하였다. 蘇木 처리에 의해 HaCaT 세포의 세포 생존율은 점차 증가하여 10µg/ml에서 141.
- 蘇木 처리에 의해 HaCaT 세포의 세포 생존율은 점차 증가하여 10µg/ml에서 141.43%로 가장 높은 세포 생존율을 보였고, 이 결과를 바탕으로 세포 증식에 영향을 주지 않으면서 蘇木의 효과를극대화 할 수 있는 농도인 1 µg/ml 조건 하에서 qRT-PCR을 진행하였다.
- 73배 증가하며 蘇木의 처리에 따른 claudin 3, claudin 6, ZO-2의mRNA 발현 변화와 유사한 결과를 얻었다. 또한 brazilin에 의한HaCaT 세포의 claduin 6 mRNA 발현 변화는 처리해 준 brazilin의 농도에 의존적인 증가 양상을 확인하였다.
- 이 전 연구를 통해 蘇木과 brazilin의 처리에 의해 HaCaT 세포의 tight junction 유전자 중 claudin 3, claudin 6, ZO-2 유전자의 mRNA 발현이 촉진되는 것을 확인하였다. 추가적으로, 蘇木과 brazilin이 세포-세포 부착 강도에 미치는 영향을 조사하기 위해 dispase 기반 해리 실험을 수행하였다. HaCaT 세포에 dispase를 처리하여 비 접착 세포 단층을 얻고, 물리적인 충격을 가하여 얻은 단편의 수를 측정한 결과 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 蘇木과 brazilin을 처리한 시료의 세포 단편이 각각 32.
- 이에 본 연구는 蘇木의 대표적인 지표물질 brazilin을 HaCaT세포에 처리하였고, 蘇木에 의한 claudin 3, claudin 6, ZO-2의mRNA 발현 변화와 유사한 결과가 재현되었다. Tight junction은 인접하는 표피 세포 사이를 서로 연결 및 접합하여 전해질과 수분의 이동을 조절하고, 세포 내 신호 전달 및 외부 환경으로부터 물리화학적인 공격을 방어하는 피부 장벽의 기능을 수행한다14,15).
- . Tight junction과 더불어 세포 사이의 결합을 연계하는 세포 부착 측면에서 蘇木과 brazilin의 역할을 알아보기 위해 dispase 기반 해리 분석을 수행하였다. 그 결과, dispase 처리와 물리적인 충격에 의해 생성된 HaCaT 세포 단편의 수가 蘇木과 brazilin 처리에 의해 감소하며 HaCaT 세포의 세포-세포 부착 강도가 강화된 것을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험을 위해서 Dulbecco's modified Eagle medium(WELGENE, Korea), fetal bovine serum (WELGENE, Korea),100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin (WELGENE,Korea), filter paper (Advantec No. 2, Japan), DPBS (Corning,USA), Trypsin-EDTA (WELGENE, Korea), potassium persulfate (Sigma, USA), ABTS (Sigma, USA), MTS solution(Promega, USA), eCube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea,Korea), 5X M-MLV RT reaction buffer (Promega, USA),M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), RNase inhibitor (Enzynomics, Korea), 2X Prime Q-mater Mix(GENET BIO, Korea), RiboEX 등이 사용되었다.
- 실험에 사용된 세포주는 HaCaT (Thermo Fisher Scientific,USA)으로 Dulbecco’s modified Eagle medium에 10% fetal bovine serum과 1% 항생제를 첨가하여 표준 세포 배양법인 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 실험에 사용된 蘇木은 한국 서울의 동양허브 주식회사로부터 2017년 8월에 구매 (NO; 2017-0812)하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과 대학 본초학교실에서 감정하였고, 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였고, brazilin은 ChemFaces (China)를 통해 개별 구매하여 실험에 사용하였다.
- 2, Japan), DPBS (Corning,USA), Trypsin-EDTA (WELGENE, Korea), potassium persulfate (Sigma, USA), ABTS (Sigma, USA), MTS solution(Promega, USA), eCube Tissue RNA Mini Kit (PhileKorea,Korea), 5X M-MLV RT reaction buffer (Promega, USA),M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), RNase inhibitor (Enzynomics, Korea), 2X Prime Q-mater Mix(GENET BIO, Korea), RiboEX 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Thermo Fisher Scientific, USA),water bath (HAAKE, Germany), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), ultrasonic cleaner (Branson, USA),microplate reader (Molecular Devices EMax Plus, USA), The Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, USA), AriaMx (Agilent,USA) 등이다.
이론/모형
- 蘇木과 brazilin이 HaCaT 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt) assay를 수행하였다. 96-well plat에 HaCaT 세포를 5,000 cells/well로 분주한 뒤 24 h 동안 배양한 뒤 각각의 well을 시료가 농도 별로 처리된 배지로 교환해 준 뒤 다시 24 h 동안 배양해 주었다.
- 추후 실험에는 이렇게 합성한 cDNA를 1/5로 희석시켜 사용하였다. 蘇木과 brazilin 처리에 의해 tight junction 관련 유전자의 mRNA 발현량을 비교해 보기 위하여 quantitative real-time PCR(qRT-PCR)을 실시하였다. 2X Prime Q-master mix 10 μL, 10pmol/μL의 forward primer와 reverse primer를 각각 1.
성능/효과
- 그 결과,resveratrol의 항산화 효능은 농도 의존적으로 증가하여 100 µM에서 81.23%로 나타났으며, 蘇木과 brazilin에서도 농도 의존적인항산화 효능이 보였으며 특히 50 µg/ml에서 각각 93.07%,84.20%의 항산화 효능을 보였다.
- 43%로 가장 높은 세포 생존율을 보였고, 이 결과를 바탕으로 세포 증식에 영향을 주지 않으면서 蘇木의 효과를극대화 할 수 있는 농도인 1 µg/ml 조건 하에서 qRT-PCR을 진행하였다. 蘇木을 처리하지 않은 대조군 대비 실험군의 tight jucntion 유전자의 mRNA 발현량을 비교해 본 결과, 蘇木의 처리에 의해 HaCaT 세포의 claudin 3, claudin 6, ZO-2의mRNA 발현량이 증가하였으며 특히 claudin 6의 mRNA 발현량은 蘇木 처리에 의해 4.06배로 크게 증가하였고, 蘇木 처리에 의한 HaCaT 세포의 claudin 6 mRNA 발현량은 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
- Brazilin 처리에 의해 HaCaT세포의 세포 생존율이 증가하는 것을 MTS assay를 통해 확인하였으며, 1 µg/ml에서 177.39%로 가장 높은 세포 생존율이 나타났다.
- MTS assay 결과를 바탕으로 세포 증식에 영향을 주지 않으면서 brazilin의 효과를 극대화 할 수 있는 1 µg/ml 농도 조건 하에서 brazilin을 처리하지 않은 대조군 대비 실험군의 mRNA 발현량을 비교하였고, HaCaT 세포의 claudin 3, claudin 6, ZO-2의mRNA 발현량이 brazilin에 의해 각각 1.98배, 3.00배, 1.73배 증가하며 蘇木의 처리에 따른 claudin 3, claudin 6, ZO-2의mRNA 발현 변화와 유사한 결과를 얻었다.
- 이 전 연구를 통해 蘇木과 brazilin의 처리에 의해 HaCaT 세포의 tight junction 유전자 중 claudin 3, claudin 6, ZO-2 유전자의 mRNA 발현이 촉진되는 것을 확인하였다. 추가적으로, 蘇木과 brazilin이 세포-세포 부착 강도에 미치는 영향을 조사하기 위해 dispase 기반 해리 실험을 수행하였다.
- 추가적으로, 蘇木과 brazilin이 세포-세포 부착 강도에 미치는 영향을 조사하기 위해 dispase 기반 해리 실험을 수행하였다. HaCaT 세포에 dispase를 처리하여 비 접착 세포 단층을 얻고, 물리적인 충격을 가하여 얻은 단편의 수를 측정한 결과 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 蘇木과 brazilin을 처리한 시료의 세포 단편이 각각 32.10%,43.67%로 감소하였다.
- 본 연구는 인간 유래 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에서 tight junction 유전자의 mRNA 발현 조절에 미치는 蘇木의 영향을 확인하였고, 蘇木에 의해 HaCaT 세포의 tight junction 유전자 중 caludin 3, claudin 6, ZO-2의 mRNA 발현량이 증가한 결과를 얻었다. Tight junction 유전자의 mRNA의 발현 변화에 미치는 蘇木의 효과를 여러 분야에 적용하여 연구 및 개발하기 위해서는 蘇木의 다양한 유효 성분 중 단일 화합물에 대한 연구가 필요하다.
- Tight junction과 더불어 세포 사이의 결합을 연계하는 세포 부착 측면에서 蘇木과 brazilin의 역할을 알아보기 위해 dispase 기반 해리 분석을 수행하였다. 그 결과, dispase 처리와 물리적인 충격에 의해 생성된 HaCaT 세포 단편의 수가 蘇木과 brazilin 처리에 의해 감소하며 HaCaT 세포의 세포-세포 부착 강도가 강화된 것을 확인하였다. 蘇木과 brazilin에 의해 강화된 세포-세포 부착 강도는 피부 장벽을 약화시키는 외부적인 요인들로 부터 피부의 조직을 유지하며 보호할 수 있을 것으로 기대된다.
- ABTS assay를 통해 蘇木과 brazilin의 농도 의존적인 radical 소거능이 확인되어 열수 추출 방법으로 얻은 蘇木과brazilin이 항산화 효능이 있음을 확인하였다.
- 蘇木이 HaCaT 세포의 tight junction 유전자 발현에 미치는 영향을 확인한 결과 蘇木의 처리에 의해 claudin 3, claudin 6,ZO-2의 mRNA 발현량이 각각 2.35, 4.06, 1.57 배 증가하였으며,蘇木의 대표적 지표물질인 brazilin 또한 HaCaT 세포의 claudin3, claudin 6, ZO-2의 mRNA 발현을 증가시키며 蘇木과 유사한 효과를 나타냈다.
- HaCaT 세포에 蘇木과 brazilin을 처리 한 후 dispase를 처리하여 얻은 비 접착 세포 단층을 얻고, 물리적인 충격을 가하여 얻은 단편의 수를 측정한 결과 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 蘇木과 brazilin을 처리한 시료의 세포 단편이 각각 32.10%, 43.67%로 감소하며 세포-세포 부착 강도 강화 효과를 확인하였다.
후속연구
- Tight junction은 인접하는 표피 세포 사이를 서로 연결 및 접합하여 전해질과 수분의 이동을 조절하고, 세포 내 신호 전달 및 외부 환경으로부터 물리화학적인 공격을 방어하는 피부 장벽의 기능을 수행한다14,15). 그러므로 이러한 결과는 tight junction 유전자의 발현에 영향을 미친 蘇木과 brazilin이 피부 장벽 강화에 유용한 소재 물질로 연구 및 개발할 가능성을 시사한다.
- 蘇木은 다양한 tight junction 유전자의 mRNA 발현에 영향을 일으키며, 이 결과는 蘇木을 구성하는 대표적인 단일 화합물인 brazilin에서 재현되었다. 향후 tight junction 유전자 발현 조절 및 세포-세포 부착 강도의 강화를 통한 피부 장벽 강화 및 보습에 미치는 brazilin의 효능에 대한 보다 깊은 연구가 필요한 것으로 생각되는 바이다.
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