선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 연구에서는 생성한 입자의 암세포 치료제로의 활용 가능성을 보기 위해 여러 조건의 pH buffer에서의 안정성 변화 실험을 수행하였다. 나노 입자는 흡수와 반응을 위한 표면적 접근성을 유지하면서도 넓은 범위의 buffer 조건에서 안정성을 유지해야 한다[12].
- 이 연구에서는 DLS을 이용하는 기구인 Zetasizer(Nano zs90, Malvern Instruments, UK)를 이용하여 나노 입자의평균 크기, 표면 전하(zeta potential), PDI를 측정하였다. 이러한 특성 외에도 FTIR을 이용하여 PLGA, PEG가 실제로 합성한 나노 입자에 존재하는지 알아보았다. 또한 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP를 비교하여 양전하를 띈나노 입자에 PEI이 존재하는지 확인하였다.
- 생성한 나노 입자의 암세포 치료제로서의 활용 가능성을 보기 위해 나노 입자가 실제 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 이를 확인하기 위해 MCF-7 세포에 나노 입자가 유입되는 것을 형광 현미경으로 확인하였다.
제안 방법
- PEG solution(1.48M, 증류수 용매)에PEI solution (2.06 × 10-5 M, 증류수 용매)을 추가하고, 혼합물을 교반하면서 RhB가 추가된 PLGA solution(1.85 ×10-5 ~2.63×10-5 M, Acetonitrile 용매)을 drop-let 방식으로 넣었다.
- 실험에 이용하기 위해 MCF-7 세포 8×10-4개를 각각의 confocal dish에 10% FBS (Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) 배지와 함께 seeding하였다.
- 예를 들어, 양전하를 띄는 입자는 음전하를 띄는 세포막에 더 잘 부착하여 세포 내 흡수를 촉진하는 것으로 알려져 있는데[11], 이처럼 나노 입자의 표면 전하는 나노 입자의 효과를 결정하는 중요한 특성 중 하나이다. 이 연구에서는 화학적 조성을 다양하게 변화시켜 크기와 전하가 다른 나노 입자를 설계하고 제작하여 그 기능과 영향에서의 차이를 비교하였다.
- PDI는 입자의 안정한 정도와 입자가 얼마나 균일하게 형성되었는지를 나타내는 지표이다[14]. 이 외에도 생성한 나노 입자가 실제 암세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 MCF-7 인간 유방암 세포를 이용하여 나노 입자가 세포와 상호작용하는 형상을 관찰하고 세포 독성 실험을 수행하였다.
- 나노 입자를 염색하기 위해 18:1 Rhodamine B(RhB) (lissamine rhodamine B sulfonyl, ammonium salt, Mw 1301, Avanti)을 사용하였고, 세포 핵을 염색하기 위해 DAPI(D9542 SIGMA, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA)을 사용하였다. PLGA와 PEG로 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP을 합성하였고 PLGA, PEG, PEI을 이용하여 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP을 준비하였다. 나노 입자는 모두 Nanoprecipitation method을 활용하여 합성하였다[8].
- 이 연구에서는 DLS을 이용하는 기구인 Zetasizer(Nano zs90, Malvern Instruments, UK)를 이용하여 나노 입자의평균 크기, 표면 전하(zeta potential), PDI를 측정하였다. 이러한 특성 외에도 FTIR을 이용하여 PLGA, PEG가 실제로 합성한 나노 입자에 존재하는지 알아보았다.
- 이러한 특성 외에도 FTIR을 이용하여 PLGA, PEG가 실제로 합성한 나노 입자에 존재하는지 알아보았다. 또한 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP를 비교하여 양전하를 띈나노 입자에 PEI이 존재하는지 확인하였다.
- 생성한 나노 입자가 여러 pH 조건에서 안정성이 어떻게 변하는지를 보기 위해 증류수와 pH 5, 7, 9의 TE buffer에서의 나노 입자의 평균 크기와 PDI의 변화를 34일동안 추적하였다. 평균 크기와 PDI는 Zetasizer로 측정하였다.
- 생성한 나노 입자가 여러 pH 조건에서 안정성이 어떻게 변하는지를 보기 위해 증류수와 pH 5, 7, 9의 TE buffer에서의 나노 입자의 평균 크기와 PDI의 변화를 34일동안 추적하였다. 평균 크기와 PDI는 Zetasizer로 측정하였다.
- 생성한 나노 입자가 실제 암세포에 어떻게 작용하는지 확인하기 위해 in vitro cell uptake 실험을 수행하였다. 세포는 인간 유방암 세포인 MCF-7을 이용하였다.
- 실험에 이용하기 위해 MCF-7 세포 8×10-4개를 각각의 confocal dish에 10% FBS (Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) 배지와 함께 seeding하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후에 배지를 제거하고 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지를 추가하였다. 그 후 세포에 농도가 18.
- CCK-8 test를 위해 MCF-7세포 5×10-3개를 96 well plate에 10% FBS를 포함한 DMEM 배지와 함께 seeding하였다.
- 나노 입자를 첨가하지 않은 대조군(control)의 흡광도를 기준(100%)으로 실험군의 흡광도 백분율을 계산하였다.
- 이렇게 처리한 세포를 DAPI로 염색하여 형광 현미경(Nikon Eclipse Ti-U, Nikon Instruments, Kanagawa, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 세포 핵의 DAPI 신호에 UV-2A filter (Excitation: 340 nm-380 nm, Emission: 420nm-),나노 입자의 RhB 신호에 G-2A filter (Excitation: 510 nm-560 nm, Emission: 590 nm-)을 사용하였다.
- 생성한 나노 입자가 실제 암세포에 미치는 영향을 파악하기 위해 세포 독성 실험의 일종인 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) test를 수행하였다. CCK-8 test를 위해 MCF-7세포 5×10-3개를 96 well plate에 10% FBS를 포함한 DMEM 배지와 함께 seeding하였다.
- 24시간 동안 배양한 후에 배지를 제거하고, DMEM 배지와 RhB을 적재한 나노 입자를 각각의 well에 첨가하였다. 나노 입자는 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP을 각각 0.07 mg/ml, 0.13 mg/ml, 0.25 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 24시간 후 각각의 well에 CCK-8 용액 10 µl를 추가하고 1시간 후 450 nm의 파장대에서 흡광도를 측정하였다.
- 그림 5. MCF-7 세포를 이용한 PLGA-PEG-PEI NP와 PLGA-PEG NP의 세포독성 평가.
- 이 연구에서는 화학적 조성을 다르게 하여 크기와 전하특성이 다른 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP를 생성하였다. 합성한 나노 입자의 기본적인 특성인 평균 크기, 표면 전하, 안정성 정도를 Zetasizer을 통해 측정한 결과 PLGA-PEG NP의 평균 크기는 134.
- 167이었다. 또한 FTIR 분석을 통해 합성한 나노 입자가 PLGA와 PEG로 구성되었다는 것과 PLGA-PEG-PEI NP에서 PEI의 존재를 확인하였다.
- 생성한 나노 입자의 DDS를 위한 생체 내 안정성을 평가하기 위해 여러 pH 조건의 buffer(증류수, pH 5, 7, 9의TE buffer)에서 시간에 따른 나노 입자의 안정성을 추적하였다. 나노 입자의 안정성은 입자의 평균 크기와 PDI로 평가하였다.
- 생성한 나노 입자의 암세포 치료제로서의 활용 가능성을 보기 위해 나노 입자가 실제 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 이를 확인하기 위해 MCF-7 세포에 나노 입자가 유입되는 것을 형광 현미경으로 확인하였다. 실험 결과 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP가 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP보다 더 많이 세포에 유입되는 것을 확인하였다.
대상 데이터
- 나노 입자 합성에 사용된 재료는 Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) (acid terminated, lactide:glycolide 50:50, Mw 38,000-54,000) (719900 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA), Poly (ethylene glycol) dimethacrylate (PEG)(average Mn 750) (437468 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA), Polyethylenimine branched (PEI) (average Mw ~25,000) (408727 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA)이다. 나노 입자를 염색하기 위해 18:1 Rhodamine B(RhB) (lissamine rhodamine B sulfonyl, ammonium salt, Mw 1301, Avanti)을 사용하였고, 세포 핵을 염색하기 위해 DAPI(D9542 SIGMA, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA)을 사용하였다.
- 나노 입자 합성에 사용된 재료는 Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) (acid terminated, lactide:glycolide 50:50, Mw 38,000-54,000) (719900 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA), Poly (ethylene glycol) dimethacrylate (PEG)(average Mn 750) (437468 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA), Polyethylenimine branched (PEI) (average Mw ~25,000) (408727 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA)이다. 나노 입자를 염색하기 위해 18:1 Rhodamine B(RhB) (lissamine rhodamine B sulfonyl, ammonium salt, Mw 1301, Avanti)을 사용하였고, 세포 핵을 염색하기 위해 DAPI(D9542 SIGMA, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA)을 사용하였다. PLGA와 PEG로 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP을 합성하였고 PLGA, PEG, PEI을 이용하여 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP을 준비하였다.
- 생성한 나노 입자가 실제 암세포에 어떻게 작용하는지 확인하기 위해 in vitro cell uptake 실험을 수행하였다. 세포는 인간 유방암 세포인 MCF-7을 이용하였다. 실험에 이용하기 위해 MCF-7 세포 8×10-4개를 각각의 confocal dish에 10% FBS (Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) 배지와 함께 seeding하였다.
데이터처리
- 그림 5는 MCF-7 세포를 이용한 CCK-8 test 결과를 나타낸 것이다. 모든 경우에 대하여 3회 반복한 결과의 평균과 표준편차를 표시하였다. PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP 모두 나노 입자의 농도가 증가함에 따라 대체적으로 세포의 수가 감소하였다.
- 생성한 나노 입자의 DDS를 위한 생체 내 안정성을 평가하기 위해 여러 pH 조건의 buffer(증류수, pH 5, 7, 9의TE buffer)에서 시간에 따른 나노 입자의 안정성을 추적하였다. 나노 입자의 안정성은 입자의 평균 크기와 PDI로 평가하였다. PLGA-PEG NP는 모든 조건의 용액에서 34일동안 안정성을 보였고 PLGA-PEG-PEI NP는 pH 9의 TE buffer에서 약 2주 후부터 불안정해짐을 보였다.
이론/모형
- 이러한 이유로 나노 입자의 여러 pH 환경에서의 안정성 변화는 DDS에 있어서 중요한 요소가 된다. 본 연구에서 나노 입자의 안정성은 나노 입자의 크기와 Polydispersity index (PDI)를 지표로 평가하였다. PDI는 입자의 안정한 정도와 입자가 얼마나 균일하게 형성되었는지를 나타내는 지표이다[14].
- PLGA와 PEG로 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP을 합성하였고 PLGA, PEG, PEI을 이용하여 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP을 준비하였다. 나노 입자는 모두 Nanoprecipitation method을 활용하여 합성하였다[8].
- 일반적으로 PLGA와 PEG는 자기 조립(self-assembly)형태로 중합체(copolymer)구조를 이루는데, 이 연구에서는 PLGA-PEG 나노 입자를 만드는 주요한 방법 중 하나인 ‘Nano-precipitation’ 방식을 이용하여 나노 입자를 생성하였다[8].
성능/효과
- 약물 전달에 나노 입자를 활용하면 특정 세포에 특이적으로 약물을 전달할 수 있으며, 지용성 약물의 전달을 향상시키고 상피와 내피장벽을 통과하여 약물을 전달하거나 큰 약물도 세포 내로 전달할 수 있다[6,7]. 나노 입자에 항암제를 적재하여 투여하면항암제만 단독으로 투여했을 때 보다 효과적으로 암 치료가 가능하며 부작용도 줄일 수 있다. 예를 들어, Stigliano et al.
- 모든 경우에 대하여 3회 반복한 결과의 평균과 표준편차를 표시하였다. PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP 모두 나노 입자의 농도가 증가함에 따라 대체적으로 세포의 수가 감소하였다. 이를 통해 나노 입자의 농도가 높을수록 세포 독성이 커진다는 것을 알 수 있다.
- 이를 통해 나노 입자의 농도가 높을수록 세포 독성이 커진다는 것을 알 수 있다. 또한 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP을 비교하였을때, PLGA-PEG-PEI NP을 처리한 세포의 생존율이 낮아지는 것으로 보아 PLGA-PEG-PEI NP가 PLGA-PEG NP에 비해 세포 독성이 높다는 것을 알 수 있다. 이를 uptake 결과와 같이 고려하면, 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP가 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP에 비해 입자의 크기는 더 크지만 세포에 더 많이 유입되었으며, 또한 세포에 더 강한 독성을 나타낸다고 할 수 있다.
- 또한 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP을 비교하였을때, PLGA-PEG-PEI NP을 처리한 세포의 생존율이 낮아지는 것으로 보아 PLGA-PEG-PEI NP가 PLGA-PEG NP에 비해 세포 독성이 높다는 것을 알 수 있다. 이를 uptake 결과와 같이 고려하면, 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP가 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP에 비해 입자의 크기는 더 크지만 세포에 더 많이 유입되었으며, 또한 세포에 더 강한 독성을 나타낸다고 할 수 있다.
- 이 연구에서는 화학적 조성을 다르게 하여 크기와 전하특성이 다른 PLGA-PEG NP와 PLGA-PEG-PEI NP를 생성하였다. 합성한 나노 입자의 기본적인 특성인 평균 크기, 표면 전하, 안정성 정도를 Zetasizer을 통해 측정한 결과 PLGA-PEG NP의 평균 크기는 134.9 nm, zeta potential은 -30.3 mV, PDI은 0.244이고 PLGA-PEG-PEI NP의 평균 크기는 326.4 nm, zeta potential은 53.5 mV, PDI은 0.167이었다. 또한 FTIR 분석을 통해 합성한 나노 입자가 PLGA와 PEG로 구성되었다는 것과 PLGA-PEG-PEI NP에서 PEI의 존재를 확인하였다.
- 나노 입자의 안정성은 입자의 평균 크기와 PDI로 평가하였다. PLGA-PEG NP는 모든 조건의 용액에서 34일동안 안정성을 보였고 PLGA-PEG-PEI NP는 pH 9의 TE buffer에서 약 2주 후부터 불안정해짐을 보였다.
- 이를 확인하기 위해 MCF-7 세포에 나노 입자가 유입되는 것을 형광 현미경으로 확인하였다. 실험 결과 양전하를 띄는 PLGA-PEG-PEI NP가 음전하를 띄는 PLGA-PEG NP보다 더 많이 세포에 유입되는 것을 확인하였다. 또한 PLGA-PEG-PEI NP가 PLGA-PEG NP에 비해 그 세포 독성이 더 강하였다.
- 또한 PLGA-PEG-PEI NP가 PLGA-PEG NP에 비해 그 세포 독성이 더 강하였다. 즉, 본 실험에서 양전하 입자의 경우, 크기는 음전하 입자보다 크지만, 암세포에 유입되는 효과가 음전하 입자보다 높았기 때문에 DDS 효과가 좋다고 예상할 수 있다. 하지만 생체 내 안정성에서는 음전하 입자가 더 좋기 때문에 실제적인 암세포에 도달하는 입자의 수는 양전하 입자가 더 높다고 예상하기는 힘들다.
- 결론적으로 본 연구에서는 나노 입자를 합성하는데 있어서 표면의 특성 변화가 신체 내에서 DDS를 실현시키는데 있어 매우 큰 영향을 줄 수 있다는 것을 확인하였고, 나노입자의 합성에 있어 이러한 요소들을 섬세하게 고려하여 평균 크기와 전하의 특징을 조절하고, 그러한 특징이 달라짐에 따라 나노 입자의 안정성이나 세포 독성의 영향이 크게 달라진다는 것을 확인하였다. 이러한 연구를 바탕으로 향후항암 치료를 위한 개선된 나노 입자의 개발을 위해서는 나노 입자의 특성을 미세하게 조절하는 공학적 디자인과 그에 따른 분석이 필요하다는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 결론적으로 본 연구에서는 나노 입자를 합성하는데 있어서 표면의 특성 변화가 신체 내에서 DDS를 실현시키는데 있어 매우 큰 영향을 줄 수 있다는 것을 확인하였고, 나노입자의 합성에 있어 이러한 요소들을 섬세하게 고려하여 평균 크기와 전하의 특징을 조절하고, 그러한 특징이 달라짐에 따라 나노 입자의 안정성이나 세포 독성의 영향이 크게 달라진다는 것을 확인하였다. 이러한 연구를 바탕으로 향후항암 치료를 위한 개선된 나노 입자의 개발을 위해서는 나노 입자의 특성을 미세하게 조절하는 공학적 디자인과 그에 따른 분석이 필요하다는 것을 알 수 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.