[논문]Enterobacter sp. YB-46의 myo-Inositol dehydrogenase 유전자 클로닝과 특성분석

박찬영; 김광규; 윤기홍

doi:10.4014/mbl.1805.05001

[국내논문] Enterobacter sp. YB-46의 myo-Inositol dehydrogenase 유전자 클로닝과 특성분석
Molecular Cloning and Characterization of myo-Inositol Dehydrogenase from Enterobacter sp. YB-46 원문보기

Microbiology and biotechnology letters = 한국미생물·생명공학회지, v.46 no.2, 2018년, pp.102 - 110

박찬영 (우송대학교 바이오식품과학전공) , 김광규 ((주)디와이내츄럴) , 윤기홍 (우송대학교 바이오식품과학전공)

초록
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myo-Inositol (MI)을 대사하여 다른 물질로 전환하는 미생물을 과수원 토양으로부터 분리하였다. 분리균 YB-46은 유일한 탄소원으로 MI이 첨가된 배지에서 성장하였고 16S rDNA 염기서열에 따라 Enterobacter 속의 균주로 추정되었다. Fosmid pCC1FOS 벡터를 사용하여 제조된 거대 유전체 은행으로부터 MI을 미지의 대사 물질로 전환하는 Escherichia coli 형질전환주를 선발하였다. 이로부터 플라스미드를 분리하고 삽입된 유전자의 일부 염기서열을 결정한 결과 336 아미노 잔기로 구성된 myo-inositol dehytrogenase (IolG)를 암호화하는 iolG 유전자가 발견되었다. 분리균 YB-46의 IolG는 E. aerogenes와 Bacillus subtilis의 IolG와 약 50% 수준의 상동성을 보였다. 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged IoG (HtIolG)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtIolG를 정제하였다. 정제된 HtIolG는 $45^{\circ}C$와 pH 10.5에서 최대 활성을 보였고 MI과 D-glucose에 대한 활성이 가장 높았으며 D-chiro-inositol, D-mannitol 및 D-xylose에도 90% 이상의 활성을 보였다. 최적 반응조건에서 MI을 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 $K_m$과 $V_{max}$가 1.83 mM과 $0.724{\mu}mol/min/mg$로 확인되었다. HtIolG의 활성은 $Zn^{2+}$에 의해 1.7배 증가하였으며, $Co^{2+}$와 SDS에 의해서는 크게 감소하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

A bacterial strain capable of metabolizing myo-inositol (MI) and converting to other substances was isolated from soil of orchard. The isolate, named YB-46, was grown on minimal medium supplemented with MI as the sole carbon source and was presumed to belonging to genus Enterobacter according to the 16S rDNA sequence. Escherichia coli transformant converting MI into unknown metabolites was selected from a metagenomic library prepared with fosmid pCC1FOS vector. Plasmid was isolated from the transformant, and the inserted gene was partially sequenced. From the nucleotide sequence, an iolG gene was identified to encode myo-inositol dehydrogenase (IolG) consisting of 336 amino residues. The IolG showed amino acid sequence similarity of about 50% with IolG of Enterobacter aerogenes and Bacillus subtilis. The His-tagged IolG (HtIolG) fused with hexahistidine at C-terminus was produced and purified from cell extract of recombinant E. coli. The purified HtIolG showed maximal activity at $45^{\circ}C$ and pH 10.5 with the highest activity for MI and D-glucose, and more than 90% of maximal activity for D-chiro-inositol, D-mannitol and D-xylose. $K_m$ and $V_{max}$ values of the HtIolG for MI were 1.83 mM and $0.724{\mu}mol/min/mg$ under the optimal reaction condition, respectively. The activity of HtIolG was increased 1.7 folds by $Zn^{2+}$, but was significantly inhibited by $Co^{2+}$ and SDS.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

kaustophilus HTA426도 MI, SI 및 DCI을 유일한 탄소원으로 하여 성장하며 이들의 대사에 관여하는 유전자는 iolIDEBCAJ 오페론과 3종류의 inositol dehydrogenases 유전자에 해당하는 gk1897-1898-1899 오페론으로 존재한다[5]. 본 연구에서는 과수원 토양에서 MI을 다른 대사산물로 전환하는 미생물을 분리하고 inositol 대사에 관여하는 유전자를 클로닝하였으며 이들 중 iolG 유전자와 효소의 특성을 조사하였다.

제안 방법

이들 primers로 증폭된 유전자 단편을 NdeI과 XhoI으로 절단하여 동일한 효소로 처리한 pET23a(+)에 도입하여 재조합 플라스미드 pE8LiG1을 제조하였다. His-tagged IolG (HtIolG)의 유전자를 과잉 발현시키기 위해 pE8LiG1을 E. coli BL21 (DE3)에 도입하여 얻은 형질전환주를 LB 액체 배지에 접종하고 37℃에서 하룻 밤 진탕 배양한 후, 동일배지 300 ml을 함유한 baffled flask 에 1%가 되도록 접종하였다. 37℃에서 진탕 배양하면서 흡광도(OD₆₀₀)가 0.
0)로 세척하였다. HtIolG를 300 mM imidazole을 함유한 완충액으로 추출하고 각 분획의 IolG 활성분석과 SDS-PAGE 분석을 통해 활성이 높고 단일 단백질이 포함된 분획을 골라 10 mM sodium phosphate 완충액(pH 8.0)에서 투석하여 정제 효소로 사용하였다.
iolG 유전자를 과잉발현 시키기 위해 pET23a의 T7 promoter 하단에 도입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. IolG의 카르복시 말단에 His-tag이 융합된 형태로 발현시키기 위해 2종류의 primers P8iolG-F1 (TCAACATATGACTTTAAA AGCAGGTATTGTGG; 밑줄은 NdeI 위치)과 P8iolG-nR (TGAACTCGAGCTTGTAGAACGCAGGTTTCGCT; 밑줄은 XhoI 위치)을 제조하였다. 이들 primers로 증폭된 유전자 단편을 NdeI과 XhoI으로 절단하여 동일한 효소로 처리한 pET23a(+)에 도입하여 재조합 플라스미드 pE8LiG1을 제조하였다.
IolG의 활성은 0.5 mM NAD+ 를 조효소로 하고 50 mM 기질과 100 mM 완충액을 포함한 반응액에 적정량의 효소를 첨가하여 45℃에서 30분간 반응한 후 340 nm에서 흡광도의 증가에 따른 NADH의 생성량을 측정함으로써 결정하였다. 효소 활성에 미치는 반응 온도의 영향을 조사하기 위하여 25−50℃와 pH 6.
Ligated DNA를 70℃에서 10분간 열처리하고 MaxPlax Lambda Packaging Eextracts와 혼합하여 최종적으로 E. coli EPI300으로 형질 도입한 후 chloramphenicol (12.5 μg/ml)이 첨가된 LB 평판 배지에 도말하였다.
MI을 대사하는 형질전환주로부터 플라스미드를 분리하여 pMU118로 명명하고 삽입된 유전자의 염기서열을 분석하기 위해 EcoRI, PstI, BamHI과 HindIII로 각각 절단된 단편들 중 클로닝된 유전자로부터 유래된 단편을 추출하고 이를 동일한 효소로 절단된 pUC19에 도입하여 그 염기서열을 결정하였다. 그 결과 pMU118에 클로닝된 DNA의 부분적인 염기서열이 결정되었으며 밝혀진 염기서열을 기반으로 하여 orf를 조사한 결과 336 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,011 bp 크기의 iolG 유전자가 관찰되었다(Fig.
MI의 대사 유전자를 함유한 형질전환주를 효과적으로 탐색하기 위해 1% MI이 첨가된 LB 액상배지에 10개의 형질전환주를 동시에 접종하고 혼합 배양한 후 배양 상등액을 TLC로 분석하여 1개 집단의 배양액에서 MI이 소모되고 미지의 대사산물이 생성된 것을 확인하였다. 그러므로 이 집단에 포함된 10개의 형질전환주를 각각 동일한 배지에서 배양 한 후 배양 상등액을 분석함으로써 최종적으로 MI을 대사하여 분리균 YB-46과 동일하게 미지의 대사산물을 생산하는 단일한 형질전환주를 선발하였다(Fig.
자연계에 풍부하게 존재하는 MI을 유일 탄소원으로 이용하는 토양균이 다수 보고된 바 있다. MI의 대사능이 있는 미생물을 탐색하기 위해 과수원 토양으로부터 분리된 미생물을 MI이 첨가된 LB 배지에 배양하여 배양산물을 TLC로 분석하였다. 다수의 토양 세균이 MI을 이용하지 못하였으며, 분리균 YB-46은 배지의 MI을 이용하여 미지의 대사물질을 생산하는 것으로 나타났다(Fig.
5%)이 첨가된 LB 액체배지에 접종하고 3일간 진탕 배양한 후 배양 상등액에 존재하는 물질을 박층크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC)로 분석함으로써 MI이 다른 물질로 전환된 균주를 탐색하였다. TLC는 배양 상등액을 적정량 취해 silica gel-precoated thin layer glass plate (Merck Kiesegel, 60F254, Merck Millipore Co., Germany)에 점적하고 methanol, chloroform과 증류수(5:5:1-v/v/v)의 혼합용액으로 전개한 후 이를 2% KMnO₄ 용액으로 5초간 염색하고 열풍으로 말려 관찰하였다. MI와 pinitol은 Sigma-Aldrich.
YB-46으로부터 MI의 대사에 관련된 유전자를 클로닝하기 위해 크기가 큰 DNA 단편의 삽입에 적합한 pCC1FOSTM fosmid vector로 metagenomic library를 제조함으로써 약 700개의 형질전환주 얻었다.
iolG 유전자를 과잉발현 시키기 위해 pET23a의 T7 promoter 하단에 도입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. IolG의 카르복시 말단에 His-tag이 융합된 형태로 발현시키기 위해 2종류의 primers P8iolG-F1 (TCAACATATGACTTTAAA AGCAGGTATTGTGG; 밑줄은 NdeI 위치)과 P8iolG-nR (TGAACTCGAGCTTGTAGAACGCAGGTTTCGCT; 밑줄은 XhoI 위치)을 제조하였다.
그람 염색을 실시하여 분리균의 형태적 특성을 관찰하였으며, LB 액체 배지에서 배양한 균체를 0.85% NaCl 용액에 현탁한 후 제조사의 지침에 따라 API 20E와 API 50 CHE (Biomerieux, France) kits에 접종하고 30℃에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 관찰하였다. 분리균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하기 위해서 총 유전체 DNA를 주형으로 하고, 5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3' (Escherichia coli 16S rRNA 유전자 염기서열 8−27)과 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (E.
coli BL21 (DE3)에 도입하고 그 형질전환주를 IPTG로 처리하여 HtIolG의 유전자를 과잉 발현한 결과 IPTG 첨가 후 37℃에서 배양하였을 때 발현된 HtIolG이 대부분 불용성 단백질로 존재하였으나 25℃로 배양하였을 때는 수용성 단백질로 발현된 양이 증가하였다. 그러므로 IPTG 첨가 후 25℃에서 배양된 균체를 파쇄하고 Ni-NTA 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 HtIolG를 정제하였다. 정제된 HtIolG를 SDS-PAGE로 분석한 결과 분자량이 약 38−40 kDa으로 나타났으며(Fig.
MI의 대사 유전자를 함유한 형질전환주를 효과적으로 탐색하기 위해 1% MI이 첨가된 LB 액상배지에 10개의 형질전환주를 동시에 접종하고 혼합 배양한 후 배양 상등액을 TLC로 분석하여 1개 집단의 배양액에서 MI이 소모되고 미지의 대사산물이 생성된 것을 확인하였다. 그러므로 이 집단에 포함된 10개의 형질전환주를 각각 동일한 배지에서 배양 한 후 배양 상등액을 분석함으로써 최종적으로 MI을 대사하여 분리균 YB-46과 동일하게 미지의 대사산물을 생산하는 단일한 형질전환주를 선발하였다(Fig. 2C).
열안정성은 25−50℃ 범위의 온도에서 IolG 효소액을 30분 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였다. 금속이온과 화합물이 효소 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해서는 최종 농도가 5 mM이 되도록 반응액에 첨가하고 효소활성을 측정하였다.
분리균 YB-46의 형태적 특성을 관찰한 결과 그람 음성 간균으로 확인되어 API 20E와 API 50CHE kit를 사용하여 생화학적 특성과 당 이용능을 조사하였다. 그 결과 YB-46은 βgalactosidase의 활성과 citrate의 이용능을 보였고 indole과 유기산을 생성하였으며, arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, urease와 tryptophan deaminase 활성 및 acetoin과 황화수소의 생성능은 모두 없었다.
분리균의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하기 위해서 총 유전체 DNA를 주형으로 하고, 5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3' (Escherichia coli 16S rRNA 유전자 염기서열 8−27)과 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열 1,492−1,510)을 primers로 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시함으로써 증폭된 DNA 단편을 정제한 후 염기서열 분석에 사용하였다.
분리된 유전체 DNA를 pipetting하여 물리적 충격을 가함으로써 적절한 크기의 단편으로(30−50 kb) 절단한 후 End-Repair Enzyme Mix (Epicentre Biotechnologies, USA)를 사용하여 절단 단편의 평활화와 5’ 인산화를 실시하였다.
열안정성은 25−50℃ 범위의 온도에서 IolG 효소액을 30분 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였다.
열안정성을 조사하기 위해 25−50℃ 범위에서 30분간 방치한 후에 HtIolG의 잔존활성을 조사하였다.
IolG의 카르복시 말단에 His-tag이 융합된 형태로 발현시키기 위해 2종류의 primers P8iolG-F1 (TCAACATATGACTTTAAA AGCAGGTATTGTGG; 밑줄은 NdeI 위치)과 P8iolG-nR (TGAACTCGAGCTTGTAGAACGCAGGTTTCGCT; 밑줄은 XhoI 위치)을 제조하였다. 이들 primers로 증폭된 유전자 단편을 NdeI과 XhoI으로 절단하여 동일한 효소로 처리한 pET23a(+)에 도입하여 재조합 플라스미드 pE8LiG1을 제조하였다. His-tagged IolG (HtIolG)의 유전자를 과잉 발현시키기 위해 pE8LiG1을 E.
분리된 유전체 DNA를 pipetting하여 물리적 충격을 가함으로써 적절한 크기의 단편으로(30−50 kb) 절단한 후 End-Repair Enzyme Mix (Epicentre Biotechnologies, USA)를 사용하여 절단 단편의 평활화와 5’ 인산화를 실시하였다. 전기 영동을 수행하여 약 40 kb 크기의 DNA 단편을 GELase로 추출한 후 Fast-Link DNA ligase를 사용하여 pCC1FOS vector와 ligation하였다. Ligated DNA를 70℃에서 10분간 열처리하고 MaxPlax Lambda Packaging Eextracts와 혼합하여 최종적으로 E.
aerogenes와 Bacillus subtilis의 IolG와 약 50% 수준의 상동성을 보였다. 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결 되도록 제조한 His-tagged IoG (HtIolG)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtIolG를 정제하였다. 정제된 HtIolG는 45℃와 pH 10.
MI을 대사하여 다른 대사산물로 전환하는 미생물을 선발 하기 위해 충청북도와 경상북도의 과수원에서 채취한 토양을 생리식염수로 희석한 후 LB 평판배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g; water, 1 L)에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 콜로니의 모양이 서로 다른 균주를 선별하여 MI (0.5%)이 첨가된 LB 액체배지에 접종하고 3일간 진탕 배양한 후 배양 상등액에 존재하는 물질을 박층크로마토그래피(Thin-layer chromatography, TLC)로 분석함으로써 MI이 다른 물질로 전환된 균주를 탐색하였다. TLC는 배양 상등액을 적정량 취해 silica gel-precoated thin layer glass plate (Merck Kiesegel, 60F254, Merck Millipore Co.
효소 활성에 미치는 반응 온도의 영향을 조사하기 위하여 25−50℃와 pH 6.0−11.5의 범위에서 IolG 활성을 각각 측정하였다.

대상 데이터

분리균 YB-46은 유일한 탄소원으로 MI이 첨가된 배지에서 성장하였고 16SrDNA 염기서열에 따라 Enterobacter 속의 균주로 추정되었다. Fosmid pCC1FOS 벡터를 사용하여 제조된 거대 유전체 은행으로부터 MI을 미지의 대사 물질로 전환하는 Escherichia coli 형질전환주를 선발하였다. 이로부터 플라스미드를 분리하고 삽입된 유전자의 일부 염기서열을 결정한 결과 336 아미노 잔기로 구성된 myo-inositol dehytrogenase (IolG)를 암호화하는 iolG 유전자가 발견되었다.
MI을 대사하여 다른 대사산물로 전환하는 미생물을 선발 하기 위해 충청북도와 경상북도의 과수원에서 채취한 토양을 생리식염수로 희석한 후 LB 평판배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g; water, 1 L)에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 콜로니의 모양이 서로 다른 균주를 선별하여 MI (0.

이론/모형

분리균의 배양 균체로부터 총 유전체 DNA는 Biofact Co. (Korea)의 Bacterial Genomic DNA Preparation kit를 사용하여 지침서에 따라 분리하였다. 유전자 은행을 제조하기 위해서는 Epicentre Biotechnologies (USA)의 CopyControl^TM Fosmid pCC1FOSTM Library Production kit를 다음과 같이 사용하였다.
(Korea)의 Bacterial Genomic DNA Preparation kit를 사용하여 지침서에 따라 분리하였다. 유전자 은행을 제조하기 위해서는 Epicentre Biotechnologies (USA)의 CopyControl^TM Fosmid pCC1FOSTM Library Production kit를 다음과 같이 사용하였다. 분리된 유전체 DNA를 pipetting하여 물리적 충격을 가함으로써 적절한 크기의 단편으로(30−50 kb) 절단한 후 End-Repair Enzyme Mix (Epicentre Biotechnologies, USA)를 사용하여 절단 단편의 평활화와 5’ 인산화를 실시하였다.

성능/효과

IolG의 최적 반응 조건에서 NAD+는 0.5 mM로 고정하고 기질인 MI의 농도를 2−10 mM의 범위로 달리하여 HtIolG의 초기 반응속도를 구해 Lineweaver-Burk plot에서 Km과 Vmax 값을 결정한 결과 1.83 mM과 0.724 μmol/min/mg로 측정되었다.
2A). MI의 첨가량을 달리하여 배양한 후 MI의 이용 정도를 조사한 결과 MI이 0.5% 첨가된 배지에서는 MI이 완전히 이용되어 미지의 물질이 생산되었으나, MI의 첨가량을 증가시켰을 경우 MI은 일정량만 소모되고 배지에 잔존하였으며 생성된 대사 물질의 양도 크게 증가하지 않았다(Fig. 2B).
YBIolG 카르복시 말단에 His tag을 융합한 His-tagged YBIolG (HtIolG)의 유전자가 과잉 발현되도록 제조된 pE8LiG1을 E. coli BL21 (DE3)에 도입하고 그 형질전환주를 IPTG로 처리하여 HtIolG의 유전자를 과잉 발현한 결과 IPTG 첨가 후 37℃에서 배양하였을 때 발현된 HtIolG이 대부분 불용성 단백질로 존재하였으나 25℃로 배양하였을 때는 수용성 단백질로 발현된 양이 증가하였다.
그 결과 YB-46은 βgalactosidase의 활성과 citrate의 이용능을 보였고 indole과 유기산을 생성하였으며, arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, urease와 tryptophan deaminase 활성 및 acetoin과 황화수소의 생성능은 모두 없었다.
그 결과 pMU118에 클로닝된 DNA의 부분적인 염기서열이 결정되었으며 밝혀진 염기서열을 기반으로 하여 orf를 조사한 결과 336 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,011 bp 크기의 iolG 유전자가 관찰되었다(Fig. 3).
와 SDS에 의해서는 크게 감소하였다. 그러나 K⁺, Na⁺, Cu²⁺, EDTA와 dithiothreitol은 효소 활성에 영향을 미치지 않았으며 효소 활성을 완전하게 저해한 Hg²⁺을 제외한 다른 금속 이온들에 의해서는 20% 이하의 활성이 감소한 것으로 나타났다.
기질 특이성을 조사하기 위해서는 NAD+의 농도를 0.5 mM로 하고 여러 종류의 당을 동일한 농도(50 mM)로 사용하여 반응을 실시한 결과 HtIolG는 MI과 D-glucose에 대해 0.629 μmol/min/mg으로 동일하게 최대 활성으로 보였으며 DCI, D-mannitol 및 D-xylose에도 90% 이상의 활성을 나타냈다.
MI의 대사능이 있는 미생물을 탐색하기 위해 과수원 토양으로부터 분리된 미생물을 MI이 첨가된 LB 배지에 배양하여 배양산물을 TLC로 분석하였다. 다수의 토양 세균이 MI을 이용하지 못하였으며, 분리균 YB-46은 배지의 MI을 이용하여 미지의 대사물질을 생산하는 것으로 나타났다(Fig. 2A). MI의 첨가량을 달리하여 배양한 후 MI의 이용 정도를 조사한 결과 MI이 0.
또한 B.subtilis IolG의 233−235번째 잔기인 YGY는 기질인 inositol의 인식 부위 주변에서 소수성 공간을 형성하는데 YBIolG 는 232−234번째 잔기에서 이와 동일한 배열을 보였고 L. casei BL23의 IolG2는 HGY로 배열되어 다른 균의 효소와는 차이가 있었다.
myo-Inositol (MI)을 대사하여 다른 물질로 전환하는 미생물을 과수원 토양으로부터 분리하였다. 분리균 YB-46은 유일한 탄소원으로 MI이 첨가된 배지에서 성장하였고 16SrDNA 염기서열에 따라 Enterobacter 속의 균주로 추정되었다. Fosmid pCC1FOS 벡터를 사용하여 제조된 거대 유전체 은행으로부터 MI을 미지의 대사 물질로 전환하는 Escherichia coli 형질전환주를 선발하였다.
이로부터 플라스미드를 분리하고 삽입된 유전자의 일부 염기서열을 결정한 결과 336 아미노 잔기로 구성된 myo-inositol dehytrogenase (IolG)를 암호화하는 iolG 유전자가 발견되었다. 분리균 YB-46의 IolG는 E. aerogenes와 Bacillus subtilis의 IolG와 약 50% 수준의 상동성을 보였다. 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결 되도록 제조한 His-tagged IoG (HtIolG)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtIolG를 정제하였다.
유전자 염기서열로부터 유추된 YB-46 유래 IolG (YBIolG)의 아미노산 배열을 미국의 NCBI database에 등록된 다른 효소와 비교한 결과 S. enterica의 inositol 2-dehydrogenase (WP_000172704)와 상동성이 93%로 가장 높았으며 E. coli ED1a (CAR06517)와 Citrobacter werkmanii (WP_085048442)의 IolG와도 92%의 높은 상동성을 보였다. 이들 효소는 모두 YBIolG와 동일하게 336 아미노산 잔기로 구성되어 있는데 효소의 특성에 대해 보고된 바는 없다.
YB-46으로부터 MI의 대사에 관련된 유전자를 클로닝하기 위해 크기가 큰 DNA 단편의 삽입에 적합한 pCC1FOS^TM fosmid vector로 metagenomic library를 제조함으로써 약 700개의 형질전환주 얻었다. 임의로 5개의 형질전환주로부터 재조합 플라스 미드를 분리한 후 여러 종류의 제한 효소로 절단하여 삽입 된 크기를 예측한 결과 약 40 kb 크기의 DNA 단편이 삽입 된 것으로 판단되었으며 이로 보아 YB-46의 metagenomic library는 총 28 Mb 수준의 유전체를 함유한 것으로 추정된다.
카르복실 말단에 hexahistidine이 연결 되도록 제조한 His-tagged IoG (HtIolG)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtIolG를 정제하였다. 정제된 HtIolG는 45℃와 pH 10.5에서 최대 활성을 보였고 MI과 D-glucose에 대한 활성이 가장 높았으며 D-chiro-inositol, D-mannitol 및 D-xylose에도 90% 이상의 활성을 보였다. 최적 반응조건에서 MI을 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 K_m과 V_max가 1.
정제된 HtIolG를 SDS-PAGE로 분석한 결과 분자량이 약 38−40 kDa으로 나타났으며(Fig. 5), 이는 iolG 유전자의 염기서열로부터 예측된 YBIolG와 카르복시 말단에 융합된 6개의 His 잔기를 포함한 HtIolG의 분자량(38 kDa)과 유사하였다.
정제된 HtIolG를 사용하여 반응 온도와 pH에 따른 효소 활성을 조사한 결과 최적 반응 온도는 45℃이며 pH 10.5에서 최대 활성을 보였고 pH 8.0에서 약 25%, pH 11에서 약 70% 이상의 활성을 나타냈다(Fig. 6). Acetomonas oxydans와 Gluconobacter oxydans ATCC 621H의 IolG는 각각 pH 6.
최적 반응조건에서 MI을 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 Km과 Vmax가 1.83 mM과 0.724 μmol/min/mg로 확인되었다.
탄소원으로 glucose, fructose와 MI이 각각 1% 첨가된 M9최소배지에 분리균 YB-46을 접종하여 30℃에서 1일간 진탕배양한 결과 glucose와 fructose가 첨가된 배지에서는 순조롭게 성장하였고 MI이 첨가된 배지에서는 거의 성장이 일어나지 않았으나 배양 2일째는 성장도가 glucose와 fructose가 첨가된 배지와 유사한 수준을 보였다. 이로 보아 YB-46은 MI을 유일 탄소원으로 이용하여 성장하지만 유도기가 24시간이상으로 길었으며, Salmonella enterica도 최소 배지에서 MI을 유일 탄소원으로 사용하였을 때 40−60시간의 유도기를 갖는 것으로 알려졌다[8, 18].
3%로 가장 높았다. 한편 PCR로 16S rDNA 단편을 증폭하고 1,510 bp 크기의 염기서열을 결정한 후 미국 NCBI의 BLAST 검색방법으로 기존에 등록 된 세균들의 상응하는 염기서열과 비교한 결과 Enterobacter bugandensis와 1510 bp 중 1495 bp가 동일하여 상동성이 가장 높았으며, Enterobacter cancerogenus 및 Klebsiella oxytoca와 1494 bp가 동일하였다. 한편 생화학적 특성에서 가장 유사도가 높았던 Pantoea 속 균주 중에서는 가장 높은 상동성을 보이는 균주는 Pantoea agglomerans JCM 1236이며 1451 bp 중 1427 bp가 동일하여 Enterobacter 속 균주 보다 상동성이 낮았다.
한편 생화학적 특성에서 가장 유사도가 높았던 Pantoea 속 균주 중에서는 가장 높은 상동성을 보이는 균주는 Pantoea agglomerans JCM 1236이며 1451 bp 중 1427 bp가 동일하여 Enterobacter 속 균주 보다 상동성이 낮았다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	MI 대사의 첫 단계는 무엇으로 시작하는가?	Fig. 1에 나타낸 바와 같이 MI 대사의 첫 단계는 iolG 유전자 산물인 myo-inositol dehydrogenase (IolG)에 의해 MI이 scyllo-inosose (SIS)로 전환되는 과정이며 이때 NAD+가 조효소로 작용된다[14]. 또한 IolG는 DCI에도 작용하여 1-keto-D-chiro-inositol을 생성하고 이는 iolI 유전자 산물인 inosose isomerase에 의해 SIS로 전환된다.
	myo-inositol은 무엇으로부터 생산되는가?	Inositol (1,2,3,4,5,6-cyclohexanehexol)은 6개의 수산화기의 에피머화에 의해 9 종류의 입체이성질체로 존재하며 이들 중 myo-inositol (cis-1,2,3,5-trans-4,6-cyclohexanehexol; MI)이 자연에 가장 풍부하게 존재한다. 주로 콩과 식물과 곡류에서 인산의 저장물질인 phytic acid (myo-inositol hexakisphosphate)는 MI을 함유하고 있으며 이들 식물로부터 MI이 산업적으로 생산된다. MI을 제외한 다른 이성질체는 자연계에서 희소량 존재하는데 이들 중 D-chiro-inositol (DCI)은 고혈당증이나 다낭성 난소증후군 증상을 개선하며 [1], scyllo-inositol (SI)은 알츠하이머 증상을 완화시키는 효과가 있는 것으로 알려졌다[2].
	myo-inositol을 유일 탄소원으로 성장할 수 있는 세균은 무엇이 있는가?	MI을 유일 탄소원으로 하여 성장할 수 있는 세균으로 Aerobacter aerogenes (Enterobacter aerogenes로 재분류) [3], Bacillus subtilis [4], Geobacillus kaustophilus [5], Lactobacillus casei BL23 [6], Rhizobium leguminosarum [7], Salmonella typhimurium [8], Sinorhizobium fredii [9]와 S. meliloti [10]가 알려졌으며 이들의 MI 대사에 관여하는 효소계와 그 유전자 및 발현 조절 기작이 연구되었다. MI을 비롯하여 그 이성질체인 DCI 및 SI을 산화하는 dehydrogenase는 해당 inositol에 의해 생산이 유도되는 것으로 알려졌다[5, 8, 11].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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