본 연구는 지질다당류에 의해 유도된 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 자화지정 추출물이 염증 매개체 생성에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 세포 생존 능력에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 또한, Bio-Plex 사이토카인 분석(cytokine assay)을 통하여 NO, 인터루킨 $(IL)-1{\beta}$, 종양 괴사 인자($TNF-{\alpha}$) 및 IL-6와 같은 다양한 사이토카인(cytokine)의 농도에 의한 자화지정 추출물의 항염증 효과를 조사 하였다. 자화지정 추출물은 LPS로 유도 된 대식세포에서 NO, $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ 및 IL-6의 농도를 $25{\mu}g/mL$ 이상으로 유의하게 저해하였으며 세포 생존율에는 변화가 없었다. 이러한 결과는 자화지정 추출물이 LPS로 유도된 대식세포에서 $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인(cytokine)의 억제와 관련된 항염증 효과를 갖는다는 것을 시사한다. 앞으로 자화지정을 이용한 염증질환에 관련된 치료제개발에 새로운 연구가 더 필요한 바이다.
본 연구는 지질다당류에 의해 유도된 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 자화지정 추출물이 염증 매개체 생성에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 세포 생존 능력에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 또한, Bio-Plex 사이토카인 분석(cytokine assay)을 통하여 NO, 인터루킨 $(IL)-1{\beta}$, 종양 괴사 인자($TNF-{\alpha}$) 및 IL-6와 같은 다양한 사이토카인(cytokine)의 농도에 의한 자화지정 추출물의 항염증 효과를 조사 하였다. 자화지정 추출물은 LPS로 유도 된 대식세포에서 NO, $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ 및 IL-6의 농도를 $25{\mu}g/mL$ 이상으로 유의하게 저해하였으며 세포 생존율에는 변화가 없었다. 이러한 결과는 자화지정 추출물이 LPS로 유도된 대식세포에서 $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인(cytokine)의 억제와 관련된 항염증 효과를 갖는다는 것을 시사한다. 앞으로 자화지정을 이용한 염증질환에 관련된 치료제개발에 새로운 연구가 더 필요한 바이다.
The purpose of this study was to investigate the effects of Violae Herba Water Extract (VH) on the proinflammatory factors of lipopolysaccharide (LPS)-induced on the production of inflammatory mediators in RAW 264.7 mouse macrophages cells. We examined effect of Violae Herba Water Extract on the cel...
The purpose of this study was to investigate the effects of Violae Herba Water Extract (VH) on the proinflammatory factors of lipopolysaccharide (LPS)-induced on the production of inflammatory mediators in RAW 264.7 mouse macrophages cells. We examined effect of Violae Herba Water Extract on the cell viability of RAW 264.7 mouse macrophages cells. Futhermore, After 24 hours treatment we investigated anti-inflammatory effect of Violae Herba Water Extract by the production of Bio-Plex cytokine assay, concentrations of various cytokines such NO, $interleukin(IL)-1{\beta}$, tumor necrosis factor ${\alpha}(TNF-{\alpha})$ and IL-6. The water extract of Violae Herba significantly inhibited the production of NO, $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ and IL-6 at the concentration of 25, 50, 100 and $200{\mu}g/mL$ in the LPS-induced RAW 264.7 mouse macrophages cells with no changes in the cell viability of them. These results suggest that water extract of Violae Herba has anti-inflammatory effect related with its inhibition of proinflammatory cytokines such as $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ and IL-6 in the LPS-induced RAW 264.7 mouse macrophages cells. Further research is needed to develop therapeutic agents for inflammatory diseases using Violae Herba.
The purpose of this study was to investigate the effects of Violae Herba Water Extract (VH) on the proinflammatory factors of lipopolysaccharide (LPS)-induced on the production of inflammatory mediators in RAW 264.7 mouse macrophages cells. We examined effect of Violae Herba Water Extract on the cell viability of RAW 264.7 mouse macrophages cells. Futhermore, After 24 hours treatment we investigated anti-inflammatory effect of Violae Herba Water Extract by the production of Bio-Plex cytokine assay, concentrations of various cytokines such NO, $interleukin(IL)-1{\beta}$, tumor necrosis factor ${\alpha}(TNF-{\alpha})$ and IL-6. The water extract of Violae Herba significantly inhibited the production of NO, $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ and IL-6 at the concentration of 25, 50, 100 and $200{\mu}g/mL$ in the LPS-induced RAW 264.7 mouse macrophages cells with no changes in the cell viability of them. These results suggest that water extract of Violae Herba has anti-inflammatory effect related with its inhibition of proinflammatory cytokines such as $IL-1{\beta}$, $TNF-{\alpha}$ and IL-6 in the LPS-induced RAW 264.7 mouse macrophages cells. Further research is needed to develop therapeutic agents for inflammatory diseases using Violae Herba.
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문제 정의
7 세포에 유의한 세포독성을 유발하지 않으면서도 LPS로 유발된 대식세포의 NO, IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성증가를 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL에서 통계적으로 유의성있게 억제시켰다. 이러한 결과는 자화지정 추출물 이 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 관련된 염증반응을 과도하게 줄이는 항염증효능이 있음을 시사하는 바이다.
이에 본 연구에서는 자화지정을 물추출하여 얻은 시료(VH)를 대상으로 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 세포생존율과 LPS로 유발된 NO, IL-1β, TNF-α, IL-6의 다양한 사이토카인(cytokine)의 생성증가에 대한 영향을 측정하였다.
이에 본 연구에서는 자화지정의 항염효능에 대하여 알아보기 위하여 자화지정을 물추출하여 제조한 시료 (VH = Violae Herba)를 대상으로 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 세포생존율(cell viability)과 LPS(lipopolysaccharide)로 유발된 NO(nitric oxide) 그리고 IL(interleukin)-1α, TNF-α(tumor necrosis factor α), IL-3 등의 사이토카인 (cytokine) 생성증가에 대한 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
1 ㎍/m의 LPS를 단독처리하거나 혹은 다양한 농도 (25, 50, 100, 200 ㎍/mL)별로 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 24시간 동안 37℃, 5 % CO2 배양기에서 배양한 후 세포배양 상등액 100 ㎕을 채취하여 여기에 그리스 시약(Griess reagent) 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시키고 흡광도(540nm)로 Microplate Reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다.
1×105 cells을 96 well에 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5 % CO2 배양기에서 배양시간을 24 시간으로 하여 오래된 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용 액으로 씻어준 후 각 well에 1 ㎍/m의 LLPS를 단독처리 (1 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도(25, 50, 100, 200 ㎍ /mL)별로 함께 배지에 담아 처리하고 24시간 동안 배양 하였다.
1×104 cells을 96 well에 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양시간을 24 시간으로 하여 오래된 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 세포 표면을 씻어주었다. 배양을 24시간 한 후 동량의 세포배양배지와 PBS에 녹인 자화지정 추 출물을 농도별 (25, 50, 100, 200 ㎍/mL)로 각 well에 처리 하였다. 세포배양을 마친 후 PBS에 녹여 100㎕씩 각 well 에 1 ㎎/mL MTT (Sigma, USA)를 처리한 후 빛을 막기 위하여 알루미늄호일로 덮어 같은 조건하에 2시간 동안 추가 배양하였다.
배양이 완료되면 3회 세척(wash buffer)한 뒤 각 well에 streptavidin-PE를 분주하고 실온에서 30 분간 300～500 rSB의 조건으로 진동배양한다. 배양이 완료되면 3회 세척(wash buffer)한 후 각 well에 120 ㎕의 reading buffer 를 분주하고 실온에서 5 분간 300～500 rSB의 조건으로 진동배양한 뒤 bio-plex array reader(Bio-Plex 200)를 이용하여 사이토카인(cytokine)류의 발현에 대한 영향을 계산 및 비교하였다.
본 연구에서는 자화지정 추출물(VH)을 대상으로 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 세포생존율과 LPS로 유발된 NO, IL-1β, TNF-α, IL-6의 다양한 사이토카인 (cytokine)의 생성증가에 대한 효과를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리하여 세포독성이 어느 정도 있는지를 알아보기 위하 여 Mosmann[19]의 방법을 응용하여 MTT assay를 실시 하였다. 1×104 cells을 96 well에 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양시간을 24 시간으로 하여 오래된 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 세포 표면을 씻어주었다.
측정하고자 하는 사이토카인(cytokine)의 분비량과 자화지정 추출물의 상관관계를 알아보기 위하여 Politch 등 [20]의 방법을 응용하여 Bio-Plex Cytokine Assay를 다음과 같이 시행하였다. 1×105 cells을 96 well에 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5 % CO2 배양기에서 배양시간을 24 시간으로 하여 오래된 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용 액으로 씻어준 후 각 well에 1 ㎍/m의 LLPS를 단독처리 (1 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도(25, 50, 100, 200 ㎍ /mL)별로 함께 배지에 담아 처리하고 24시간 동안 배양 하였다.
대상 데이터
대식세포주인 RAW 264.7 세포를 streptomycin (100 ㎍/mL), penicillin (100 U/mL), FBS가 첨가된 DMEM 배지로 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 대식세포주인 RAW 264.
각 시약의 품질은 분석용 등급 이상의 것으로 하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 기기는 Bio-Plex 200(Bio-Rad, USA), microplate reader (Bio-Rad, USA), CO2 incubator (Nuaire, USA), water bath (Intron Biotech, Korea), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), research microscope (Becton dickinson, USA), fume hood (Hanil, Korea), centrifuge (Hanil, Korea), clean bench (Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea), spectrofluorometer(Dynex, UK) vortex mixer (Vision Scientific Co, Korea) 등이다.
실험에 사용된 세포주는 RAW 264.7 세포(mouse macrophage)로서 한국세포주은행(KCLB, Korea)으로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 자화지정(Violae Herba)은 한국 서울의 동양허브 주식회사로부터 2017 년 6 월에 구입(NO; 2017-006)하였으며, 약재는 가천대학교 한의과대학 본초 학교실에서 감정하였고 실험에 사용한 약재는 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 깨끗하게 없애고 실험에 사용하였다.
데이터처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ± 표준편차로 나타내었으며, ANOVA test와 Student's t-test로 분석하였다.
성능/효과
7 세포의 각종 염증매개물질들 (inflammatory mediators) 생성증가를 통계적으로 유의성 있게 억제하였다. 결과적으로 자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 염증에 관련된 물질의 과다한 배출로 인한 다양한 염증질환을 완화시킬 수 있는 항염효능이 있음을 시사한다.
둘째, 자화지정 추출물은 LPS에 의해서 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 NO 생성증가를 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL 농도에서 통계적으로 유의성 있게 억제시켰다.
본 실험에서는 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 자화지정 추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리한 후 37℃에서 24 시간동안 배양한 뒤, 세포의 증식을 MTT assay를 이용하여 확인한 결과 자화지정 추출물은 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 유의한 독성을 유발하지 않았으며 이는 자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 유의성 있게 독성 유발하지 않는 것을 알 수 있다.
셋째, 자화지정 추출물은 LPS에 의해서 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 IL-1β, TNF-α, IL-6 생성 증가를 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL 농도에서 통계적으로 유의성 있게 억제시켰다.
이상의 결과, 자화지정 추출물은 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 유의한 세포독성을 유발하지 않으면서도 LPS로 유발된 대식세포의 NO, IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성증가를 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL에서 통계적으로 유의성있게 억제시켰다.
이상의 결과, 자화지정 추출물은 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 유의한 세포독성을 유발하지 않으면서도 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 NO, IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성증가를 25, 50, 100, 200 ㎍ /mL 농도에서 유의성 있게 억제시키는 등 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 관련된 염증반응을 조절할 수 있는 항염효능이 있는 것으로 판단된다.
이와 같이 자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 독성을 주지 않았으며 LPS로 인해 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 각종 염증매개물질들 (inflammatory mediators) 생성증가를 통계적으로 유의성 있게 억제하였다. 결과적으로 자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.
자화지정 추출물이 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 IL-1β 생성증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS와 함께 자화지정 추출물을 24 시간 동안 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리한 결과 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 IL-1β 생성증가를 유의성 있게 억제하였다.
자화지정 추출물이 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 IL-6 생성증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS와 함께 자화지정 추출물을 24 시간 동안 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리한 결과 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 IL-6 생성증가를 유의성 있게 억제하였다.
자화지정 추출물이 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 NO 생성증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS와 함께 자화지정 추출물을 24 시간 동안 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리한 결과 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의성 있게 억제하였다. 이와 같이 자화지정 추출물이 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.
자화지정 추출물이 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 NO 생성증가에 대한 효과를 알아보기 위하여 LPS(1 ug/mL)와 함께 자화지정 추출물을 처리한 결과(24 시간) 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의성(P<0.05) 있게 억제 하였다.
자화지정 추출물이 LPS로 유발된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 TNF-α 생성증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS와 함께 자화지정 추출물을 24 시간 동안 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리한 결과 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 TNF-α 생성 증가를 유의성 있게 억제하였다.
자화지정 추출물이 LPS로 활성화된 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 IL-1β 생성 증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS(1 ug/mL)와 함께 자화지정 추출물을 처리한 결과(24 시간) 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 IL-1β 생성증가를 유의성 있게 억제하였다.
자화지정 추출물이 LPS로 활성화된 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 IL-6 생성 증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS(1 ug/mL)와 함께 자화지정 추출물을 처리한 결과(24 시간) 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 IL-6 생성증가를 유의성 있게 억제하였다.
자화지정 추출물이 LPS로 활성화된 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 TNF-α 생성 증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 LPS(1 ug/mL)와 함께 자화지정 추출물을 처리한 결과(24 시간) 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에서 LPS에 의한 TNF-α 생성증가를 유의성 있게 억제하였다.
자화지정 추출물이 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 자화지정 추출물을 처리한 결과(24 시간) 25, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도에 따른 세포생존율이 증가하였다.
첫째, 자화지정 추출물은 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL 농도에서 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 통계적으로 유의성 있는 독성을 유발하지 않았다.
후속연구
7 세포와 관련된 염증반응을 조절할 수 있는 항염효능이 있는 것으로 판단된다. 앞으로 자화지정을 이용한 염증질환에 관련된 치료제개발에 새로운 연구가 더 필요하다. 새로운 기능성화장품의 개발에는 원하는 활성을 보유한 다양한 식물들의 개발이 우선되어야 하며, 관심의 대상이 되는 친피부적인 효과로 미백, 항염증, 항산화 효과 등이 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자화지정의 사용 목적은?
자화지정는『본초강목』에 처음 기록된 이래 淸熱解 毒, 涼血消腫의 효능이 있어, 疔瘡腫毒, 癰疽發背, 丹毒, 毒蛇咬傷 등을 치료하는 약물로 사용되어 왔다[1]. 자화지정의 기원은 대한민국약전외한약(생약)규격집[2]에 “제비꽃 Viola mandshurica Baker 또는 호제비꽃 Viola yedoensis Makino (제비꽃과 Violaceae)의 전초”라고 수재되어 있다.
자화지정의 효과에는 무엇이 있는가?
9%, 탄화수소 약 47%가 포함되어 있다[1]. 약리작용으로는 항산화 효능[3], 뇌세포 보호 효과[4], 항천식 효과[5], 아토피성 피부염에 대 한 항염증 효과[6], 항비만 효과[7], 류마티스 관절염 치료효과[8] 등이 보고되어 있다.
자화지정의 전초에는 어떤 성분이 함유되어 있는가?
자화지정의 성분으로 전초에는 배당체(glycoside), 플 라보노이드(flavonoid) 등이 함유되어 있다. 꽃에는 랍 (wax)이 함유되어 있고, 그 속에는 불포화 지방산 5.
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