[논문]RAW 264.7 대식세포 염증반응에 대한 털연리초 에탄올 추출물의 항염증 효과

남정환

doi:10.7732/kjpr.2020.33.4.287

RAW 264.7 대식세포 염증반응에 대한 털연리초 에탄올 추출물의 항염증 효과
Effects of Ethanol Extract from Lathyrus palustris on Anti-inflammation Response of RAW 264.7 Cell 원문보기

韓國資源植物學會誌 = Korean journal of plant resources, v.33 no.4, 2020년, pp.287 - 292

초록
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염증은 신체 특정 조직의 감염 및 손상에 관한 생체 반응이며, 매개하는 주요 대상은 면역세포이다. 염증은 급성과 만성 염증으로 나뉘며 신체 조직의 감염 및 손상부위의 규모에 따라 구분할 수 있다. 염증의 범위가 크게 발현되거나 급성염증 형태로 진행되지 않을 때 만성 염증으로 진행되며 대표적인 만성 염증 질환인 장 질환(Inflammatory bowel disease)의 일종인 크론병(Crohn's disease)이나 관절질환인 류머티스성 관절염(Rheumatoid arthritis)으로 나타난다. 낮은 수준이기는 하나 비만 역시 염증성 질환으로 분류할 수 있다. 연리초속 식물이 고래에 신장염을 치료하는 민간처방으로 주로 사용됐기에 이에 착안하여 털연리초(Lathyrus palustris)를 이용하여 세포독성과 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 염증 유발 인자인 lipopolysaccharide (LPS)로 자극 후 NO와 PGE₂ 같은 염증 매개 물질들의 억제 효과를 확인하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 처리한 후 염증 매개 물질의 저해율(%)을 측정했을 때 NO 및 PGE₂ 생성을 농도 의존적으로 현저하게 억제하는 농도는 40 ㎍/mL이었으며 특이적으로 PGE₂ 발현을74% 이상 강력히 억제함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 털연리초의 에탄올 추출물이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었고 이러한 생리활성 효과는 예방의학적 소재로서의 가능성을 충분히 제시할 수 있기에 염증 질환의 예방 및 비만 억제를 위한 기능성 건강식품의 개발로 이어질 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 물질인 IL-4, IL-13 및 염증 지표 단백질인 iNOS, COX-2의 억제 메커니즘과 항염증 활성을 나타내는 핵심 성분의 추가적인 연구가 차후 필요할 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Lathyrus palustris often used as a treatment for inflammation of the kidneys in Korean traditional medication. Generally, drugs for arthritis have anti-inflammatory and antinociceptive properties. However, the validity of the anti-inflammatory effect has not been scientifically investigated so far. Therefore, the purpose of the research was to investigate the latent anti-inflammatory ability of L. palustris using the ethanol extract. To evaluate the anti-inflammatory activities, we examined the inflammatory arbitrators such as a nitric oxide (NO) and prostaglandin E2 (PGE2) on RAW 264.7 cells. Our results indicated that ethanol extract significantly inhibited the lipopolysaccharide E (LPS) derived PGE2 production in RAW 264.7 cell. The inhibitory activity of ethanol extract for PGE2 tests with inhibition ratio showed in 40 ㎍/mL. Overall, PGE2 tests had a higher inhibitory effect on inflammation than NO tests. This result anticipated that the ethanol extract from L. palustris is a good candidate for developing the origin of anti-inflammatory agents.

주제어

표/그림 (4)

표 Table 1. The yield of Lathyrus palustris EtOH extract
표 Table 2. Effects of EtOH extract from Lathyrus palustris on the cell viability of RAW 264.7 cell
표 Table 3. Inhibitory effects of EtOH extract from Lathyrus palustris on NO production in LPS stimulated RAW 264.7 cell
표 Table 4. Inhibitory effects of EtOH extract from Lathyrus palustris on PGE2 productionin LPS stimulated RAW 234 cell

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구자들은 lipopolysaccharide (LPS)의 자극으로 염증성 반응이 유도된 RAW 264.7 대식세포에 털연리초 에탄올 추출물 처리하여, 항염증 활성(NO & PGE2 assay)을 평가한 후 기능성 식품소재의 가능성을 밝히고자 본 연구를 수행하였다.
본 연구는 털연리초의 에탄올 추출물을 이용하여 LPS 유도된 RAW 264.7 대식세포의 염증 매개 물질들의 저해 효과를 규명코자 하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 LDH assay를 실시하여 세포독성의 정도 즉 세포 생존율로 나타내고 독성을 나타내지 않는 유효농도 범위를 설정하였다.
7 대식세포에서 LPS 자극 때문에 유도된 염증성 매개 산물인 NO의 생성과 PGE₂ 생성의 억제 효과를 확인하였다. 이를 통해 앞으로 항염증 효과 확인 실험에서 최적의 처리 농도를 선택하고자 하였다. LDH assay에 의해 설정된 처리농도에 따라 screening을 진행한 결과 털연리초 에탄올 추출물이 NO와 PGE₂의 생성 억제실험 시 효과가 높게 나타내기에 털연리초 에탄올 추출물에서 유래된 극성 및 비극성 용매 분획물의 약리 성분에 관한 연구를 차후 진행하는 것이 필요하다고 사료 된다.

제안 방법

Ellman's reagent 용액을 200 μL 첨가하고 60~90분 동안 반응시킨 뒤 420 ㎚ 파장에서 ELISA microplate reader (BioTek Instruments Co., USA)기를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
털연리초 에탄올 추출물의 유효농도 범위는 10, 20 그리고 40 ㎍/mL 로 3가지 농도로 설정하였다. Endotoxin인 LPS를 처리하여 염증 지표인 NO의 생성을 유도하고 각 분획물을 처리하여 NO생성 억제 효과를 확인하였고 추가로 PGE₂생성 억제 효과를 확인하였다. 털연리초 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 PGE₂의 생성을 강력히 억제함으로써 유의성 있는 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다.
Griess reagent 용액을{1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid 와 0.1% (w/v) naphtyl ethylene diamine-HCl}을 이용하여 RAW 264.7 대식세포로부터 생성된 NO의 발현량을 세포 배양액 속에 존재하는 NO₂^-의 형태로 측정하였다. Griess reagent 용액을 100 μL씩 혼합하여 96 well plate에서 10분간 반응시킨 뒤 540 ㎚ 파장에서 ELISA microplate reader (BioTek Instruments Co.
NO screening 실험에서 미약하나마 억제 효과를 나타내는 털연리초 에탄올 추출물을 LPS에 의해 자극 유도되는 또 다른 염증성 대사산물인 PGE₂의 생성 억제 효과를 농도별로 측정하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 10, 20 그리고 40 ㎍/mL의 농도로 RAW 264.
PBS (Bioneer Co., Korea) 완충용액을 이용하여 씻은 뒤 각각의 well에 H2O2 (BBC Biochemical, USA) 100 μL 단일 시료와 다양한 농도의 시료 100 μL를 첨가하여 45분 동안 배양 후 상등액을 제거하고 PBS 완충용액으로 2회 씻은 후 배지 200 μL를 주입 후 24시간 배양하였다.
Sample을 처리한 세포 배양액을 취한 뒤 prostaglandin assay design kit (Amersham pharmacia Biotech Co., USA)를 이용하여 kit manual에 따라 PGE₂ 발현량을 측정하였다. RAW 264.
연리초속 식물이 고래에 신장염을 치료하는 민간처방으로 주로 사용됐기에 이에 착안하여 털연리초(Lathyrus palustris)를 이용하여 세포독성과 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 염증 유발 인자인 lipopolysaccharide (LPS)로 자극 후 NO와 PGE₂ 같은 염증 매개 물질들의 억제 효과를 확인하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 처리한 후 염증 매개 물질의 저해율(%)을 측정했을 때 NO 및 PGE₂ 생성을 농도 의존적으로 현저하게 억제하는 농도는 40 ㎍/mL이었으며 특이적으로 PGE₂ 발현을 74% 이상 강력히 억제함을 확인하였다.
배양액 속에 5 ㎎/mL LDH 시약 50 μL을 첨가하여 4시간 동안 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO (Sigma Chemical Co., USA) 100 μL를 첨가 후 540 ㎚ 파장에서 ELISA microplate reader (BioTek Instruments Co., USA)기를 이용하여 흡광도를 측정하고 생존율을 계산하였다.
낮은 수준이기는 하나 비만 역시 염증성 질환으로 분류할 수 있다. 연리초속 식물이 고래에 신장염을 치료하는 민간처방으로 주로 사용됐기에 이에 착안하여 털연리초(Lathyrus palustris)를 이용하여 세포독성과 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW 264.
7 대식세포에 처리하여 NO생성에 미치는 영향을 확인한 결과, Table 3에서 보듯이 미약하지만 농도 의존적으로 NO생성을 억제하였다. 이에 다른 염증성 대사산물 또는 매개물질의 저해에 유의성 있는 효과를 나타낼 것으로 판단되었기에 추가적인 생리활성실험을 진행하였다.
7 대식세포의 염증 매개 물질들의 저해 효과를 규명코자 하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 LDH assay를 실시하여 세포독성의 정도 즉 세포 생존율로 나타내고 독성을 나타내지 않는 유효농도 범위를 설정하였다. 털연리초 에탄올 추출물의 유효농도 범위는 10, 20 그리고 40 ㎍/mL 로 3가지 농도로 설정하였다.
털연리초 에탄올 추출물을 이용하여 NO 및 PGE₂ 생성 억제효과를 규명하기 전에 RAW 264.7 대식세포에 독성으로 인한 염증 매개물질의 저해 효과의 가능성을 배제하는, 즉 독성을 나타내지 않는 최적의 처리 용량을 설정하기 위하여 LDH assay를 실시하였다. 최소한의 cell viability가 90% 이상이 되는 농도가 최적 처리 용량이라 판단하였고 Table 2에서 확인 할 수 있듯이 털연리초 에탄올 추출물이 각 10, 20 및 40 ㎍/mL의 처리 농도에서 모두 세포독성을 나타내지 않는 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다.
앞선 NO assay에서도 털연리초 에탄올 추출물 40 ㎍/mL의 농도가 가장 높은 억제 효과를 나타내었고 PGE₂ assay 역시 털연리초 에탄올 추출물 40 ㎍/mL의 농도에서 PGE₂ 생성을 효과적으로 저해하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 이용하여 murine macrophage cell인 RAW 264.7 대식세포에서 LPS 자극 때문에 유도된 염증성 매개 산물인 NO의 생성과 PGE₂ 생성의 억제 효과를 확인하였다. 이를 통해 앞으로 항염증 효과 확인 실험에서 최적의 처리 농도를 선택하고자 하였다.
털연리초 에탄올 추출물을 LDH assay를 실시하여 세포독성의 정도 즉 세포 생존율로 나타내고 독성을 나타내지 않는 유효농도 범위를 설정하였다. 털연리초 에탄올 추출물의 유효농도 범위는 10, 20 그리고 40 ㎍/mL 로 3가지 농도로 설정하였다. Endotoxin인 LPS를 처리하여 염증 지표인 NO의 생성을 유도하고 각 분획물을 처리하여 NO생성 억제 효과를 확인하였고 추가로 PGE₂생성 억제 효과를 확인하였다.

대상 데이터

본 실험에서 사용한 털연리초(Lathyrus palustris)는 2018년 5월 경상북도 울릉군 울릉읍 저동리 내수전 일대에서 자생하는 전초를 채집하였다. 추출 시료는 음건 후 분쇄하여 사용하였다.

데이터처리

통계 분석의 유의성은 Student’s t-test로 나타냈다.

이론/모형

세포의 독성 정도 즉 세포 생존력을 확인하기 위하여 LDH (Sigma Chemical Co., USA) 시험법을 이용하여 측정하였다. 96 well plate (Falcon T.

성능/효과

5% 로 강력히 억제하였다. LPS 자극으로 증가한 PGE₂ 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(Table 4). 앞선 NO assay에서도 털연리초 에탄올 추출물 40 ㎍/mL의 농도가 가장 높은 억제 효과를 나타내었고 PGE₂ assay 역시 털연리초 에탄올 추출물 40 ㎍/mL의 농도에서 PGE₂ 생성을 효과적으로 저해하였다.
7% 억제하였다. 그리고 유의성 있는 결과로 40 ㎍/mL 농도의 시료에서는 PGE₂ 생성을 약 74.5% 로 강력히 억제하였다. LPS 자극으로 증가한 PGE₂ 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(Table 4).
7 대식세포에 독성으로 인한 염증 매개물질의 저해 효과의 가능성을 배제하는, 즉 독성을 나타내지 않는 최적의 처리 용량을 설정하기 위하여 LDH assay를 실시하였다. 최소한의 cell viability가 90% 이상이 되는 농도가 최적 처리 용량이라 판단하였고 Table 2에서 확인 할 수 있듯이 털연리초 에탄올 추출물이 각 10, 20 및 40 ㎍/mL의 처리 농도에서 모두 세포독성을 나타내지 않는 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다.
의 생성 억제 효과를 농도별로 측정하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 10, 20 그리고 40 ㎍/mL의 농도로 RAW 264.7 대식세포에 처리하여 PGE₂의 생성 억제 효과를 측정한 결과, 10 ㎍/mL 농도의 시료에서 PGE₂ 생성을 약 24.9% 억제하였으며 20 ㎍/mL 농도의 시료에서 PGE₂ 생성을 약 56.7% 억제하였다. 그리고 유의성 있는 결과로 40 ㎍/mL 농도의 시료에서는 PGE₂ 생성을 약 74.
6% 억제하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 농도별로 RAW 264.7 대식세포에 처리하여 NO생성에 미치는 영향을 확인한 결과, Table 3에서 보듯이 미약하지만 농도 의존적으로 NO생성을 억제하였다. 이에 다른 염증성 대사산물 또는 매개물질의 저해에 유의성 있는 효과를 나타낼 것으로 판단되었기에 추가적인 생리활성실험을 진행하였다.
7 세포에서 염증 유발 인자인 lipopolysaccharide (LPS)로 자극 후 NO와 PGE₂ 같은 염증 매개 물질들의 억제 효과를 확인하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 처리한 후 염증 매개 물질의 저해율(%)을 측정했을 때 NO 및 PGE₂ 생성을 농도 의존적으로 현저하게 억제하는 농도는 40 ㎍/mL이었으며 특이적으로 PGE₂ 발현을 74% 이상 강력히 억제함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 털연리초의 에탄올 추출물이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었고 이러한 생리활성 효과는 예방의학적 소재로서의 가능성을 충분히 제시할 수 있기에 염증 질환의 예방 및 비만 억제를 위한 기능성 건강식품의 개발로 이어질 것으로 기대된다.
털연리초 에탄올 추출물이 LPS로 자극시킨 RAW 264.7 대식세포의 NO생성을 유의성 있게 억제하는지를 측정하기 위해 털연리초 에탄올 추출물을 10, 20 그리고 40 ㎍/mL의 농도로 RAW 264.7 대식세포에 처리하여 NO를 측정한 결과, 10 ㎍/mL 농도의 시료에서 NO생성을 약 0.2%, 20 ㎍/mL 농도의 시료에서 NO생성을 약 2.8% 억제하였으며 40 ㎍/mL 농도의 시료에서 NO생성을 약 8.6% 억제하였다. 털연리초 에탄올 추출물을 농도별로 RAW 264.
Endotoxin인 LPS를 처리하여 염증 지표인 NO의 생성을 유도하고 각 분획물을 처리하여 NO생성 억제 효과를 확인하였고 추가로 PGE₂생성 억제 효과를 확인하였다. 털연리초 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 PGE₂의 생성을 강력히 억제함으로써 유의성 있는 항염증 활성을 나타내는 것으로 확인할 수 있었다. 그리고 털연리초는 콩과 식물이므로 생리활성을 보이는 핵심 성분이 triterpenoid saponin이라고 예상되며 추후 천연물 분석 화학 연구법을 활용하여 항염증 활성을 나타내는 기능성 화합물의 분리·동정 연구가 필요하리라 판단된다.

후속연구

이를 통해 앞으로 항염증 효과 확인 실험에서 최적의 처리 농도를 선택하고자 하였다. LDH assay에 의해 설정된 처리농도에 따라 screening을 진행한 결과 털연리초 에탄올 추출물이 NO와 PGE₂의 생성 억제실험 시 효과가 높게 나타내기에 털연리초 에탄올 추출물에서 유래된 극성 및 비극성 용매 분획물의 약리 성분에 관한 연구를 차후 진행하는 것이 필요하다고 사료 된다.
그리고 털연리초는 콩과 식물이므로 생리활성을 보이는 핵심 성분이 triterpenoid saponin이라고 예상되며 추후 천연물 분석 화학 연구법을 활용하여 항염증 활성을 나타내는 기능성 화합물의 분리·동정 연구가 필요하리라 판단된다.
털연리초 에탄올 추출물을 처리한 후 염증 매개 물질의 저해율(%)을 측정했을 때 NO 및 PGE₂ 생성을 농도 의존적으로 현저하게 억제하는 농도는 40 ㎍/mL이었으며 특이적으로 PGE₂ 발현을 74% 이상 강력히 억제함을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 털연리초의 에탄올 추출물이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었고 이러한 생리활성 효과는 예방의학적 소재로서의 가능성을 충분히 제시할 수 있기에 염증 질환의 예방 및 비만 억제를 위한 기능성 건강식품의 개발로 이어질 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 물질인 IL-4, IL-13 및 염증 지표 단백질인 iNOS, COX-2의 억제 메커니즘과 항염증 활성을 나타내는 핵심 성분의 추가적인 연구가 차후 필요할 것으로 판단된다.
따라서 본 연구결과는 털연리초의 에탄올 추출물이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었고 이러한 생리활성 효과는 예방의학적 소재로서의 가능성을 충분히 제시할 수 있기에 염증 질환의 예방 및 비만 억제를 위한 기능성 건강식품의 개발로 이어질 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 물질인 IL-4, IL-13 및 염증 지표 단백질인 iNOS, COX-2의 억제 메커니즘과 항염증 활성을 나타내는 핵심 성분의 추가적인 연구가 차후 필요할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	털연리초란?	본 연구에서 사용된 털연리초(Lathyrus palustris)는 쌍떡잎 식물강 장미목 콩과의 여러해살이풀로서. 어린줄기는 털이 있고 비스듬히 누우며 자란다.
	활성산소로 인하여 발현되는 염증반응이란?	활성산소로 인하여 발현되는 염증반응은 외부의 물리·화학적 자극, 바이러스, 박테리아 및 세균과 같은 유해물질이 체내로 침투하는 경우, 면역세포가 이를 감지하여 다양한 염증성 매개 물질을 분비함으로써 손상된 조직을 회복하려는 신체보호 작용 중 하나이다. 그러나 염증반응이 지속한다면 염증 매개 물질의 과도한 분비로 암을 유발하게 되고 인슐린의 저항성을 증가시켜 당뇨 등 다양한 질병들의 매개체 역할을 한다(Cheon et al.
	염증은 급성과 만성 염증으로 나뉘며 신체 조직의 감염 및 손상부위의 규모에 따라 구분할 수 있는데 대표적인 만성 염증 질환으로는 어떤 것이 있는가?	염증은 급성과 만성 염증으로 나뉘며 신체 조직의 감염 및 손상부위의 규모에 따라 구분할 수 있다. 염증의 범위가 크게 발현되거나 급성염증 형태로 진행되지 않을 때 만성 염증으로 진행되며 대표적인 만성 염증 질환인 장 질환(Inflammatory bowel disease)의 일종인 크론병(Crohn’s disease)이나 관절질환인 류머티스성 관절염(Rheumatoid arthritis)으로 나타난다. 낮은 수준이기는 하나 비만 역시 염증성 질환으로 분류할 수 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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