설사는 경제동물의 이유시기 폐사율을 일으키는 가장 높은 요인이다. 크레오소트는 전통 의약품으로 오랜 세월동안 지사제로 사용되어 왔다. 본 연구는 흰 쥐 모델에서 크레오소트 급여가 동물의 성장 효율 및 장내 미생물에 미치는 영향을 구명할 목적으로 수행되었다. 4주령의 수컷 흰쥐 24마리를 임의로 대조구, 항생제 그룹, 크레오소트 0.4% 그룹, 크레오소트 0.8% 그룹으로 배치하였다. 대조구는 기초사료, 항생제 그룹은 apramycin 0.5%, 크레오소트 그룹은 크레오소트 0.4%와 0.8% 수준으로 하여 예비시험 기간 1주일, 본시험 기간 4주일 동안 급여하였다. 일당증체량은 실험구간 차이가 없었으나, 사료 섭취량은 Creo 0.8 그룹에서 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 장내 미생물에 대한 문(phylum) 수준 분석 결과 Creo 0.8 그룹에서 Firmicutes가 감소하고 Bacteroidetes가 증가하여 F/B비율을 감소시키는 것으로 나타났다(p<0.05). 과(family) 수준에서는 Lachnospiraceae가 크레오소트 0.8% 수준에서 증가되었으며(p<0.01), 속(genus) 수준에서는 Turicibacter가 감소되었다(p<0.01). 종(species) 수준에서는 Clostridium disporicum이 감소되었다(p<0.01). 이상의 결과는 쥐에 크레오소트 급여는 사료 섭취량을 증가시키고 장내 미생물의 변화에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
설사는 경제동물의 이유시기 폐사율을 일으키는 가장 높은 요인이다. 크레오소트는 전통 의약품으로 오랜 세월동안 지사제로 사용되어 왔다. 본 연구는 흰 쥐 모델에서 크레오소트 급여가 동물의 성장 효율 및 장내 미생물에 미치는 영향을 구명할 목적으로 수행되었다. 4주령의 수컷 흰쥐 24마리를 임의로 대조구, 항생제 그룹, 크레오소트 0.4% 그룹, 크레오소트 0.8% 그룹으로 배치하였다. 대조구는 기초사료, 항생제 그룹은 apramycin 0.5%, 크레오소트 그룹은 크레오소트 0.4%와 0.8% 수준으로 하여 예비시험 기간 1주일, 본시험 기간 4주일 동안 급여하였다. 일당증체량은 실험구간 차이가 없었으나, 사료 섭취량은 Creo 0.8 그룹에서 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 장내 미생물에 대한 문(phylum) 수준 분석 결과 Creo 0.8 그룹에서 Firmicutes가 감소하고 Bacteroidetes가 증가하여 F/B비율을 감소시키는 것으로 나타났다(p<0.05). 과(family) 수준에서는 Lachnospiraceae가 크레오소트 0.8% 수준에서 증가되었으며(p<0.01), 속(genus) 수준에서는 Turicibacter가 감소되었다(p<0.01). 종(species) 수준에서는 Clostridium disporicum이 감소되었다(p<0.01). 이상의 결과는 쥐에 크레오소트 급여는 사료 섭취량을 증가시키고 장내 미생물의 변화에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
Diarrhea is one of the main disorders which cause the highest level mortality of the post-weaning economic animal. Beech-wood creosote has been used as a traditional anti-diarrheic medicament for a long time. The present study was conducted to investigate the effects of dietary supplementation of Be...
Diarrhea is one of the main disorders which cause the highest level mortality of the post-weaning economic animal. Beech-wood creosote has been used as a traditional anti-diarrheic medicament for a long time. The present study was conducted to investigate the effects of dietary supplementation of Beech-wood on growth performance and intestinal microbiota in rats. Twelve 4-week-old rats were randomly assigned to one of four dietary groups and fed a basal diet supplemented with none (CON), 0.5% apramycin (ANTI), 0.4% creosote (Creo 0.4), or 0.8% creosote (Creo 0.8) for 4 weeks following 1 week of adaptation period to the respective diet. Average daily gain was not influenced by the dietary treatment whereas average daily feed intake was greatest for the Creo 0.8 group. In the intestinal microbiota at the level of the phylum, the percentage of Firmicutes bacteria decreased but Bacteroidetes increased in the Creo 0.8 group vs. Control, which resulted in a decreased F/B ratio for the former (p<0.05). Moreover, the percentage of Lachnospiraceae was greater at the level of the family for the Creo 0.8 group than for Control, but the percentages of Turicibacter and Clostridium disporicum were less in the former (p<0.01) at the genus and species levels, respectively. Collectively, the present results indicate that dietary supplementation of creosote increases the feed intake and also influence the intestinal microbiota in rats.
Diarrhea is one of the main disorders which cause the highest level mortality of the post-weaning economic animal. Beech-wood creosote has been used as a traditional anti-diarrheic medicament for a long time. The present study was conducted to investigate the effects of dietary supplementation of Beech-wood on growth performance and intestinal microbiota in rats. Twelve 4-week-old rats were randomly assigned to one of four dietary groups and fed a basal diet supplemented with none (CON), 0.5% apramycin (ANTI), 0.4% creosote (Creo 0.4), or 0.8% creosote (Creo 0.8) for 4 weeks following 1 week of adaptation period to the respective diet. Average daily gain was not influenced by the dietary treatment whereas average daily feed intake was greatest for the Creo 0.8 group. In the intestinal microbiota at the level of the phylum, the percentage of Firmicutes bacteria decreased but Bacteroidetes increased in the Creo 0.8 group vs. Control, which resulted in a decreased F/B ratio for the former (p<0.05). Moreover, the percentage of Lachnospiraceae was greater at the level of the family for the Creo 0.8 group than for Control, but the percentages of Turicibacter and Clostridium disporicum were less in the former (p<0.01) at the genus and species levels, respectively. Collectively, the present results indicate that dietary supplementation of creosote increases the feed intake and also influence the intestinal microbiota in rats.
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문제 정의
이전의 연구에서 크레오소트가 장내 수분 분비 조절 및 장 운동성 억제를 통한 설사병 완화 효과에 대하여 보고가 되었지만, 장내 미생물 변화에 미치는 효과에 대해서는 연구가 보고 되어 있지 않았다. 따라서 본 연구에서는 크레오소트 첨가 급여가 장내 미생물 군집에 미치는 영향을 분석하였다(Fig. 3, Table 3). 장내 미생물을 문(phylum) 수준에서 분석한 결과 모든 그룹에서 Firmicutes와 Bacteroidetes가 전체 장내 미생물의 90% 이상을 차지하는 것으로 나타났으며(Fig.
따라서 본 연구에서는 흰 쥐를 실험동물로 사용하여 크레오소트가 항생제 대체 물질로서 장내 미생물 변화에 미치는 영향을 조사하고 이를 동물 산업에 적용할 수 있는지에 대해 규명하고자 하였다.
8 그룹은 그래프 좌측에 위치하여 별도의 그룹으로 나타났다. 이러한 결과는 크레오소트를 0.8% 이상 섭취하였을 때 미생물의 군집이 변화할 수 있다는 것을 의미하여 이를 뒷받침하기 위한 각 그룹간의 미생물 조성을 확인하였다.
제안 방법
장내 미생물은 pyrosequencing 방법을 이용하여 16s rDNA 유전자 서열을 분석하였다[23]. Pyrosequencing을 통해 얻어진 염기서열의 미생물 군집은 소프트웨어 CLcommunityTM (Chunlab Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였으며, CD-HIT 프로그램을 이용하여 97% sequence 유사성에 의해 정의된 종(species)은 Operational Taxonomic Unit (OTU) 값으로 나타내었다[29]. 종의 풍부도(richness)는 생물학적 종의 다양성 지표인 alpha diversity로 나타내었으며, Chao1 richness [7] 및 Shannon diversity index [16]를 분석하여 종의 풍부도를 나타내었다.
일주일의 예비 실험 기간 동안 기초사료(AIN-76A, Central lab, Seoul, Korea) (Table 1)와 물은 무제한으로 급여하였고, 일주일에 한 번 사료 잔량을 확인하였다. 본 실험은(1) 대조구(기초사료), (2) 항생제 그룹(기초사료 + 아프라마이신0.5%), (3) 크레오소트 0.4% 그룹(기초사료 + 크레오소트 0.4%), (4) 크레오소트 0.8% 그룹(기초사료 + 크레오소트 0.8%)으로 나누어 시험 기간 4주 동안 급여하였다. 체중은 실험 개시일과 종료일에 측정하였으며, 실험 종료일에 사료 잔량을 측정하여 사료 효율을 계산하였다.
실험기간 동안 실내온도 22±1℃, 12시간 주기의 명암주기로 유지되었다. 일주일의 예비 실험 기간 동안 기초사료(AIN-76A, Central lab, Seoul, Korea) (Table 1)와 물은 무제한으로 급여하였고, 일주일에 한 번 사료 잔량을 확인하였다. 본 실험은(1) 대조구(기초사료), (2) 항생제 그룹(기초사료 + 아프라마이신0.
장내 미생물 변화에 대한 크레오소트의 영향을 조사하기 위해 크레오소트를 4주간 급여 후 실험 종료일에 흰 쥐를 희생시키고 소장, 맹장, 대장 내용물을 채취하여 혼합한 후 장내 미생물의 genomic DNA (gDNA)를 분리하기 위하여 -80°C에 보관하였다.
8%)으로 나누어 시험 기간 4주 동안 급여하였다. 체중은 실험 개시일과 종료일에 측정하였으며, 실험 종료일에 사료 잔량을 측정하여 사료 효율을 계산하였다. 본 실험에 사용한 항생제는 apramycin (Sigma, St.
흰 쥐 장내 미생물의 16S rDNA sequence를 이용하여 다양성을 분석하였다(Table 2). Reads 간의 유사도를 근거로 각 그룹에 대한 OTUs 값을 분석한 결과 CON과 ANTI 그리고 Creo 0.
대상 데이터
4주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) 흰 쥐(SLC, Inc., Japan)는 1 cage 당 2마리씩 3반복하여 그룹 당 6마리를 사용하였다. 실험기간 동안 실내온도 22±1℃, 12시간 주기의 명암주기로 유지되었다.
체중은 실험 개시일과 종료일에 측정하였으며, 실험 종료일에 사료 잔량을 측정하여 사료 효율을 계산하였다. 본 실험에 사용한 항생제는 apramycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 크레오소트 환은 (주)창조바이오텍에서 제조하였으며, 크레오소트 16.
Louis, MO, USA)을 사용하였다. 크레오소트 환은 (주)창조바이오텍에서 제조하였으며, 크레오소트 16.67 g, 밀가루풀 50 g, 진피(Fraxini cortex) 50 g을 혼합하여 1 mm 크기로 매끄럽게 성형한 후, 60℃에서 건조하였다. 동물실험은 경남과학기술대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care Board of Gyeongnam National University of Science and Technology)의 승인을 획득하였다(2014-4).
데이터처리
종의 풍부도(richness)는 생물학적 종의 다양성 지표인 alpha diversity로 나타내었으며, Chao1 richness [7] 및 Shannon diversity index [16]를 분석하여 종의 풍부도를 나타내었다. 미생물 공동체 사이의 계통발생학적 거리는 Fast UniFrac을 사용하여 평가하고 주좌표분석(principal coordinate analysis; PCoA)을 사용하여 시각화 하였다.
반복실험을 통해 얻은 결과는 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 분산분석 하였으며, 분석결과에 대한 모든 그룹별 유의성 검정은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 사용하여 평균±표준편차로 나타내었다[8].
이론/모형
장내 미생물의 gDNA는 Fecal DNA MiniPrep kit (Zymo Research, CA, USA)를 사용하여 추출 하였으며, 분석에 사용될 때까지 -20℃에 보관하였다. 장내 미생물은 pyrosequencing 방법을 이용하여 16s rDNA 유전자 서열을 분석하였다[23]. Pyrosequencing을 통해 얻어진 염기서열의 미생물 군집은 소프트웨어 CLcommunityTM (Chunlab Inc.
, Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였으며, CD-HIT 프로그램을 이용하여 97% sequence 유사성에 의해 정의된 종(species)은 Operational Taxonomic Unit (OTU) 값으로 나타내었다[29]. 종의 풍부도(richness)는 생물학적 종의 다양성 지표인 alpha diversity로 나타내었으며, Chao1 richness [7] 및 Shannon diversity index [16]를 분석하여 종의 풍부도를 나타내었다. 미생물 공동체 사이의 계통발생학적 거리는 Fast UniFrac을 사용하여 평가하고 주좌표분석(principal coordinate analysis; PCoA)을 사용하여 시각화 하였다.
성능/효과
2). ANTI 그룹은 그래프 우측 CON 그룹 미생물 군집에 가까이 위치하는 것으로 나타난 반면, Creo 0.8 그룹은 그래프 좌측에 위치하여 별도의 그룹으로 나타났다. 이러한 결과는 크레오소트를 0.
ANTI 그룹은 문(phylum) 수준에서 대조구에 비해 Proteobacteria가 유의적으로 감소하였으며(p<0.01), Proteobacteria과(familly)에 속하는 미생물 중에서 Desulfovibrio가 유의적으로 감소하였다(p<0.01).
Firmicutes에 속하는 장내 미생물을 과(family) 수준에서 분석한 결과, butyrate를 생산하는 미생물 Lachnospiraceae가 Creo 0.8 그룹에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.01), Lachnospiraceae에 속하는 미생물의 하위그룹을 분석한 결과 Eubacterium 속(genus)이 높은 수준으로 나타났다.
Firmicutes에 속하는 장내 미생물을 속(genus) 수준에서 분석한 결과 Turicibacter가 Creo 0.8 그룹에서 1.31%로 대조구의 6.21%에 비해 유의적으로 감소하는 경향으로 나타났으며(p<0.01), 종(species) 수준에서는 Clostridium disporicum이 대조구의 24.87%에 비해 Creo 0.8 그룹에서 8.68%로 유의적으로 감소하였다(p<0.01).
흰 쥐 장내 미생물의 16S rDNA sequence를 이용하여 다양성을 분석하였다(Table 2). Reads 간의 유사도를 근거로 각 그룹에 대한 OTUs 값을 분석한 결과 CON과 ANTI 그리고 Creo 0.4 그룹 간에는 차이가 나타나지 않았지만 Creo 0.8 그룹에서 관찰된 OTUs의 수가 높게 나타났다. Shannon 다양성 지수를 이용하여 장내 미생물 종 다양성을 분석한 결과 Creo 0.
8 그룹에서 관찰된 OTUs의 수가 높게 나타났다. Shannon 다양성 지수를 이용하여 장내 미생물 종 다양성을 분석한 결과 Creo 0.8 그룹에서 높게 나타났으며, Chao1 분석을 이용하여 분석한 종 풍부도 역시 Creo 0.8 그룹에서 높게 나타났다. 일반적으로 장내 미생물 다양성 변화는 숙주의 건강과 연관되어 있으며, 서구화된 식습관으로 인해 비만 및 만성 질환을 가지고 있는 사람에 비해 수렵 생활을 하는 사람들의 장내 미생물 다양성이 증가된다[18].
Proteobacteria 문에는 많은 염증성 미생물이 포함되어 있으며, Desulfovibrio는 결장의 병원성 미생물로 알려져 있다[31, 39]. 또한 크레오소트는 주로 Firmicutes(phylum)에 속하는 gram positive 병원성 미생물을 감소시키고, apramycin 항생제는 Proteobacteria (phylum)에 속하는 gram negative 병원성 미생물을 감소시킨다는 것으로 나타났다. 항생제는 다양한 작용기전을 통하여 E.
일당사료섭취량은 Creo 0.8 그룹이 CON과 ANTI 그룹보다 유의적으로 높은 것으로 나타났으며(Fig. 1C) (p<0.05), 사료 효율은 그룹 간의 차이가 없는 것으로 나타났다(Fig. 1D).
장내 미생물을 문(phylum) 수준에서 분석한 결과 모든 그룹에서 Firmicutes와 Bacteroidetes가 전체 장내 미생물의 90% 이상을 차지하는 것으로 나타났으며(Fig. 3A), Creo 0.8 그룹에서 Firmicutes가 유의적으로 감소하고, Bacteroidetes는 유의적으로 증가하여 F/B 비율을 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 3B, Table 3) (p<0.05).
주좌표(PCoA: Principal Coordinates Analysis) 분석법으로 장내 미생물 군집 구조에 미치는 영향을 분석한 결과 미생물 군집이 3개 처리 그룹에 대해 각각 다르게 분포하는 것으로 나타났다(Fig. 2). ANTI 그룹은 그래프 우측 CON 그룹 미생물 군집에 가까이 위치하는 것으로 나타난 반면, Creo 0.
1에 나타내었다. 흰 쥐의 증체량을 분석한 결과 그룹 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으며(Fig. 1A), 일당 증체량 역시 그룹 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Fig. 1B). 일당사료섭취량은 Creo 0.
후속연구
크레오소트와 항생제는 모두 동물의 설사 증상을 완화 시킬 수 있지만 그 작용 기전은 다르게 나타났다. 결론적으로 너도밤나무 추출물인 크레오소트가 장내 병원성 미생물 감소를 통해 항생제 대체제로서 대안이 될 수 있다는 것을 나타내며, 설사 완화에 대한 작용기전은 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
장내 미생물은 체중과도 연관되어 있으며 고지방 식이를 섭취할 경우 Firmicutes가 증가하고 Bacteroidetes는 감소한다[42]. 크레오소트에 의해 우점하는 문(phylum) 미생물의 다양성과 풍부도가 증가하는 것으로 나타났지만[25], 이러한 변화에 대한 작용 기전은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으며 더 많은 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Apramycin을 주기적으로 많이 섭취할 경우 어떤 문제점이 발생할 수 있는가?
그러나 최근 항생제 내성 문제로 인해 사료 첨가 항생제가 전면 금지되면서, 항생제 대체 물질 개발에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다[21]. Apramycin은 aminoglycoside계 항생제로서 주기적으로 많이 섭취할 경우 Escherichia coli와 Salmonella 등 장내 미생물에서 apramycin 내성이 증가한다[30]. 항생제 대체제로는 미생물 제제, 유기산제, 면역증강제, 식물 추출물 등이 주로 이용되고 있다.
항생제 대체제로 무엇이 이용되고 있는가?
Apramycin은 aminoglycoside계 항생제로서 주기적으로 많이 섭취할 경우 Escherichia coli와 Salmonella 등 장내 미생물에서 apramycin 내성이 증가한다[30]. 항생제 대체제로는 미생물 제제, 유기산제, 면역증강제, 식물 추출물 등이 주로 이용되고 있다. 미생물 제제는 장내 미생물 균총을 안정화시켜 동물에 유익한 영향을 주는 사료첨가제로써 대표적으로 Lactobacillus, acillus, 효모 등이 있다[13].
항생제 대체제로는 미생물 제제, 유기산제, 면역증강제, 식물 추출물 등이 있는데, 이들은 무엇이며 어떤 종류가 있는가?
항생제 대체제로는 미생물 제제, 유기산제, 면역증강제, 식물 추출물 등이 주로 이용되고 있다. 미생물 제제는 장내 미생물 균총을 안정화시켜 동물에 유익한 영향을 주는 사료첨가제로써 대표적으로 Lactobacillus, acillus, 효모 등이 있다[13]. 유기산제는 위내 pH를 감소시켜 pH에 민감함 Salmonella와 E. coli의 증식을 억제 또는 사멸한다고 알려져 있으며, 대표적인 유기산제로 acetic acid, butyric acid, lactic acid 등이 있다[26]. 면역증강제(immunostimulating)는 동물에서 식균작용 및 사이토카인 분비 활성화와 같은 다양한 면역반응을 유도하며[10], 대표적으로 보리나 버섯 유래 β-glucan 등이 있다[19]. 이러한 항생제 대체제 중에서도 식물 추출물은 생리활성이 뛰어나기 때문에 이에 대한 연구가 활발하다[22].
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