[논문]엉겅퀴의 ITS 영역 염기서열 분석을 통한 특이적 SNP 분자마커의 개발

이신우; 이수진; 김윤희

doi:10.5010/jpb.2018.45.2.102

초록
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엉겅퀴는 일반적으로 이용되는 대표적인 다년생의 약용식물이다. 최근 국제적 추세에 따라 자국의 유전자원의 발굴, 보존 등이 강화됨에 따라 인접국가와 국내 자생 엉겅퀴 계통을 판별 할 수 있는 기준 설정에 관한 연구의 필요성이 대두되고 있지만, 분자생물학적 판별 기술의 개발은 아직 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 국내 토종과 해외 유래 엉겅퀴종의 기원을 판별하기 위해 핵의 리보솜에 존재하는 ITS 유전자단편에서 SNP를 이용한 판별 프라이머를 확보하였으며, 이를 보완하여 보다 신속하게 판별하기 위하여 ARMS-PCR 및 HRM 기술을 이용한 판별 마커와 그 조건을 확립하였다. 또한, 국내 종 특이적 프라이머들을 이용한 정량적 PCR 분석방법을 이용해 두 가지 종의 genomic DNA의 혼합 여부를 판별하였다. 그러므로, 본 연구에서 개발된 SNP 마커는 다양한 지역 또는 국가에서 서식하는 엉겅퀴 종들의 신속한 확인을 위해 매우 유용하게 이용될 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Thistle is a perennial plant that is widely used for medicinal purposes. Information on the genetic diversity of thistle populations are great important for their conservation and germ plasmic utilization. Although thistle is an important medicinal plant species registered in South Korea, no molecul...

Thistle is a perennial plant that is widely used for medicinal purposes. Information on the genetic diversity of thistle populations are great important for their conservation and germ plasmic utilization. Although thistle is an important medicinal plant species registered in South Korea, no molecular markers are currently available to distinguish them from other similar species from different countries. In this study, we developed single nucleotide polymorphism (SNP) markers derived from the nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) regions of genomic sequences to identify distinct Korean-specific thistle species via an amplification refractory mutation system (ARMS)-PCR and high resolution melting (HRM) curve analyses. We performed molecular authentication of four different kinds of thistle species from different regions using DNA sequences in the ITS intergenic region. We also developed a quantitative PCR assay using species-specific ITS primers, which allowed us to estimate the ratio of Korean-specific thistle species using varying ratios of mixed genomic DNA templates from the two species. The SNP markers developed in this study are useful for rapidly identifying specific thistle species from different countries.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러므로, 본 연구에서는 한국산 국내 토종 및 해외 계통의 엉겅퀴의 기원을 판별하기 위해 핵에 존재하는 ITS 유전자단편에서 SNP를 이용한 판별 프라이머를 확보하였으며 이를 보완하여 보다 신속하게 판별하기 위하여 ARMS-PCR 및 HRM 기술을 이용한 판별마커와 그 조건을 확립하였다.

제안 방법

일반적으로 SNP를 이용하여 제작한 mismatch primer를 사용하여 특정 계통을 판별하기 위해 많이 이용하기 때문에, 본 연구에서는 ITS 유전자의 SNP를 나타내는 염기를 3′-말단에 위치하게 하고, 5′-말단 쪽으로 첫 번째 또는 세 번째의 염기를 인위적으로 변형시킨 primer를 사용하여 특이성을 향상시킬 수 있는 ARMS-PCR기술을 도입 하였다(Table 2).

대상 데이터

실험에서 사용한 엉겅퀴 계통은 국내 자생하는 엉겅퀴(Cirsium japonicum), 국내 자생 물엉겅퀴(C. nipponicum), 유럽 엉겅퀴(Silybum marianum) 및 캐나다엉겅퀴(C. arvense)를 대상으로 조사하였다(Table 1).

이론/모형

0 프로그램을 이용해 진행하였다. 비교 군들간의 유전적 거리의 계산은 Tamura-Nei distance 방법을 이용하였으며, neighbor-joining 방법을 이용해 유연관계를 분석하였다(Tamura et al. 2013).

성능/효과

2B). 3′-말단에 각각 SNP를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 유럽엉겅퀴를 제외한 다른 3종의 엉겅퀴에서 모두 동일한 크기의 DNA 밴드를 생산한 것으로 조사되어 C. japonicum에 내재하는 SNP만으로 제작된 프라이머를 이용해 다른 엉겅퀴 종으로부터 구분할 수 있는 판별 마커로 사용하기에 부적합한 것으로 확인 되었기 때문에 ARMS-PCR을 수행하였다. SNP 프라이머의 3′-말단에서 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 각각 다른 3종류의 염기로 변경한 프라이머를 제작하여 정방향 및 역방향 프라이머 모두 동일한 염기로 치환된 프라이머 조합을 사용하여 PCR반응을 수행하여 본 결과 3′말단과 인접한 세 번째 염기를 각각 T로 변경시킨 프라이머 조합에서 가장 선명한 밴드를 생산하여 ARMS기술의 도입으로 판별 효과를 높일 수 있는 것으로 확인 되었다.
ITS 유전자를 이용한 HRM curve 분석의 결과, 실제로 두 종류의 엉겅퀴를 혼합하는 비율이 높아 질수록 차이 나는 곡선을 보임을 확인할 수 있다. 그러므로,본 연구의 결과로서 실제적으로 두 가지 시료가 혼재되어 있 을 경우, 정량적 PCR 증폭을 통해 시료의 순도 여부 및 혼합 비율을 확인 할 수 있음을 알 수 있다.

후속연구

본 연구의 결과들을 종합하여 보면, 국내 및 해외에서 그 기원을 달리하는 다양한 엉겅귀 및 엉겅퀴 유사 종들의 정확한 기원판별을 위하여서는 생육 조건이나, 형태적 변이 등에 따라 크게 영향을 받지 않는 DNA단편을 이용한 분자생물학적 판별마커의 개발이 매우 필요한 실정이다. 그러나 현재까지 국내를 중심으로 한 ITS 영역 등에 대한 특정 유전자 단편 내에 존재하는 SNP의 확인 등에 관한 연구에 한정되어 있어, 실제적인 실용화를 위해서는 많은 연구들이 추가로 필요한 것으로 생각된다. 특히 최근에 개발된 SNP를 이용한 특이적 프라이머의 제작 및 실용화를 위한 ARMS-PCR 및 HRM curve 분석을 적용한 연구가 매우 필요한 실정이었다.
DNA barcodes를 밝혀내는 가장 첫 단계는 각 종에 해당하는 특정 DNA단편의 염기서열을 비교하여 먼저 SNP부위를 찾는 것이라 할 수 있다. 본 연구의 결과를 통해 향후, 인접국가인 중국과 일본의 지역별로 수집된 엉겅퀴 및 엉겅퀴 유사 종들에 대한 엽록체 단편의 유전자 서열의 계통간 차이가 나는 SNP를 근거로 하여 염기서열분석을 통한 SNP의 확인으로 국가별 그 기원을 달리하는 엉겅퀴를 정확하게 판별할 수 있을 것으로 기대되는 바이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	엉겅퀴란?	약용식물인 엉겅퀴는 국화과(Asteraseae 또는 Compositae) 식물들 중 날카로운 가시를 가진 식물들을 일반적으로 지칭하며(Haffner et al. 1999; Yoo et al. 2012), 일반적으로 종(species)을 표기할 때에는 Cirsium japonicum 종에 속하는 식물을 엉겅퀴라고 정의한다 (Yoo et al. 2012).
	국내 자생 엉겅퀴의 종자껍질 추출물의 효능은?	최근 국내 자생 엉겅퀴(C. japonicum)의 종자껍질 추출물에서 관절염의 염증을 가라앉히고 통증 유발물질인 prostaglandin E2의 형성을 억제하여 통증을 덜어준다는 결과를 확인한 바 있으며, 이는 종자껍질에 가장 많이 함유되어 있는 항염증물질인 apigenin의 역할로 추정되고 있다. 유럽에서는 국내의 자생 엉겅퀴와는 속이 다른 Silybum marianum이 있으며 이 식물이 생산하는 sylimarin이라는 물질이 간질환 치료에 효과가 있음이 증명된 바 있다 (Thao et al.
	단일염기다형성의 차이에 근거한 특정 종을 판별하는 barcoding 기술의 한계는?	최근 NGS (Next generation sequencing) 기술 등의 발달로 특정 생물종이 갖는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 차이에 근거한 특정 종을 판별하는 barcoding 기술 등이 빠르게 발전 되고 있다. 그러나 아직까지도 비용과 노력 면에서 실용화하기가 어려운 실정이며, 현장에서 채취한 수많은 시료를 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 기술의 개발이 시급한 실정이다. SNP를 확인한 후 그 SNP에 이웃하고 있는 2번째 또는 3번째의 염기를 변경하여 mismatch primer를 제작하여 PCR 반응과정에서 특이성을 증대시킨 amplification refractory mutation system (ARMS)-PCR 기술은 정확한 판별 결과를 얻기 위한 매우 중요한 분석 기술이라 할 수 있다(Han et al.

참고문헌 (12)

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Bae YM (2015) Genetic relationship of some Cirsium plants of Korea. J Life Sci 25:243-248

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Haffner E, Hellwig FH (1999) Phylogeny of the tribe Cardueae (Compositae) with emphasis on the subtribe Carduinae : an analysis based on ITS sequence data. Willdenowia. 29:27-39

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Slotta TAB, Horvath DP, Foley ME (2012) Phylogeny of Cirsium spp. in North America: host specificity does not follow phylogeny. Plants 1:61-73

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Slotta TAB, Rothhouse JM, Horvath DP, Foley ME (2006) Genetic diversity of Canada thistle (Cirsium arvense) in North Dakota. Weed Sci 54:1080-1085

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Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013) MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol 30:2725-2729

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