수박 엘리트 계통의 GBS를 통한 마커이용 육종용 SNP 마커 개발 Development of an SNP set for marker-assisted breeding based on the genotyping-by-sequencing of elite inbred lines in watermelon원문보기
본 연구는 국내 육종 회사에서 개발된 수박(Citrullus lanatus L.) 우량 육성계통 20종을 대상으로 Genotyping-by-sequencing(GBS) 분석을 통해 품종식별, 순도검정, 그리고 마커이용여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)용 SNP 세트를 개발하고자 수행되었다. GBS 분석 결과 총 1,100,000천개 raw read 중 77%가 수박 유전체에 mapping되었으며 평균 mapping region은 약 4,000 Kb로 2.3%의 genome coverage를 보였다. Filtering을 통해 평균 depth 31.57의 SNP 총 2,670개를 얻었으며, 20개 계통에 대한 이들의 Polymorphic information content(PIC) 값의 범위는 0.1 ~ 0.38 였다. 이 중 PIC 값이0.3이상이며 각 염색체 별로 5개씩 균등히 분포된 SNP 총 55개를 최종 선발하였다. 사용된 20개 계통의 유연관계분석을 위해 선발된 55개 SNP를 기반으로 한 주성분 분석(Principle component analysis, PCA) 결과 주성분 1 (52%)과 주성분 2 (11%)를 기준으로 4개의 그룹으로 분류 되었으며 각 계통 간 유전자형에 따른 뚜렷한 식별이 가능하였다. 계층적 군집화(Hierarchical clustering) 분석에서도PCA에서와 유사한 분류양상을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 SNP 세트는 적용 가능성이 검증된 20개 계통뿐 만 아니라 향후 다양한 수박 육종소재 및 품종에 대한 품종식별, F1 순도검정 및 MABC에 활용될 수 있으리라 기대된다.
본 연구는 국내 육종 회사에서 개발된 수박(Citrullus lanatus L.) 우량 육성계통 20종을 대상으로 Genotyping-by-sequencing(GBS) 분석을 통해 품종식별, 순도검정, 그리고 마커이용여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)용 SNP 세트를 개발하고자 수행되었다. GBS 분석 결과 총 1,100,000천개 raw read 중 77%가 수박 유전체에 mapping되었으며 평균 mapping region은 약 4,000 Kb로 2.3%의 genome coverage를 보였다. Filtering을 통해 평균 depth 31.57의 SNP 총 2,670개를 얻었으며, 20개 계통에 대한 이들의 Polymorphic information content(PIC) 값의 범위는 0.1 ~ 0.38 였다. 이 중 PIC 값이0.3이상이며 각 염색체 별로 5개씩 균등히 분포된 SNP 총 55개를 최종 선발하였다. 사용된 20개 계통의 유연관계분석을 위해 선발된 55개 SNP를 기반으로 한 주성분 분석(Principle component analysis, PCA) 결과 주성분 1 (52%)과 주성분 2 (11%)를 기준으로 4개의 그룹으로 분류 되었으며 각 계통 간 유전자형에 따른 뚜렷한 식별이 가능하였다. 계층적 군집화(Hierarchical clustering) 분석에서도PCA에서와 유사한 분류양상을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 SNP 세트는 적용 가능성이 검증된 20개 계통뿐 만 아니라 향후 다양한 수박 육종소재 및 품종에 대한 품종식별, F1 순도검정 및 MABC에 활용될 수 있으리라 기대된다.
This study was conducted to develop an SNP set that can be useful for marker-assisted breeding (MAB) in watermelon (Citrullus. lanatus L) using Genotyping-by-sequencing (GBS) analysis of 20 commercial elite watermelon inbreds. The result of GBS showed that 77% of approximately 1.1 billion raw reads ...
This study was conducted to develop an SNP set that can be useful for marker-assisted breeding (MAB) in watermelon (Citrullus. lanatus L) using Genotyping-by-sequencing (GBS) analysis of 20 commercial elite watermelon inbreds. The result of GBS showed that 77% of approximately 1.1 billion raw reads were mapped on the watermelon genome with an average mapping region of about 4,000 Kb, which indicated genome coverage of 2.3%. After the filtering process, a total of 2,670 SNPs with an average depth of 31.57 and the PIC (Polymorphic Information Content) value of 0.1~0.38 for 20 elite inbreds were obtained. Among those SNPs, 55 SNPs (5 SNPs per chromosome that are equally distributed on each chromosome) were selected. For the understanding genetic relationship of 20 elite inbreds, PCA (Principal Component Analysis) was carried out with 55 SNPs, which resulted in the classification of inbreds into 4 groups based on PC1 (52%) and PC2 (11%), thus causing differentiation between the inbreds. A similar classification pattern for PCA was observed from hierarchical clustering analysis. The SNP set developed in this study has the potential for application to cultivar identification, F1 seed purity test, and marker-assisted backcross (MABC) not only for 20 elite inbreds but also for diverse resources for watermelon breeding.
This study was conducted to develop an SNP set that can be useful for marker-assisted breeding (MAB) in watermelon (Citrullus. lanatus L) using Genotyping-by-sequencing (GBS) analysis of 20 commercial elite watermelon inbreds. The result of GBS showed that 77% of approximately 1.1 billion raw reads were mapped on the watermelon genome with an average mapping region of about 4,000 Kb, which indicated genome coverage of 2.3%. After the filtering process, a total of 2,670 SNPs with an average depth of 31.57 and the PIC (Polymorphic Information Content) value of 0.1~0.38 for 20 elite inbreds were obtained. Among those SNPs, 55 SNPs (5 SNPs per chromosome that are equally distributed on each chromosome) were selected. For the understanding genetic relationship of 20 elite inbreds, PCA (Principal Component Analysis) was carried out with 55 SNPs, which resulted in the classification of inbreds into 4 groups based on PC1 (52%) and PC2 (11%), thus causing differentiation between the inbreds. A similar classification pattern for PCA was observed from hierarchical clustering analysis. The SNP set developed in this study has the potential for application to cultivar identification, F1 seed purity test, and marker-assisted backcross (MABC) not only for 20 elite inbreds but also for diverse resources for watermelon breeding.
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문제 정의
본 연구는 국내 육종 회사에서 개발된 수박 우량 육성계통(Elite line) 20종을 대상으로 GBS 기반 SNP를 대량 탐색하고, 이를 이용한 MABC, 품종식별, 그리고 F1 순도검정용 SNP 마커세트를 개발하고자 수행되었다.
본 연구는 국내 육종 회사에서 개발된 수박(Citrullus lanatus L.) 우량 육성계통 20종을 대상으로 Genotyping-by-sequencing (GBS) 분석을 통해 품종식별, 순도검정, 그리고 마커이용여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)용 SNP 세트를 개발하고자 수행되었다. GBS 분석 결과 총 1,100,000천개 raw read 중77%가 수박 유전체에 mapping되었으며 평균 mapping region은 약 4,000 Kb로 2.
제안 방법
Barcode sequence 정보를 이용하여 demultiplexing 후, adapter sequence 제거 및 sequence quality trimming을 하였다. Cutadapt (v.
Barcode sequence 정보를 이용하여 demultiplexing 후, adapter sequence 제거 및 sequence quality trimming을 하였다. Cutadapt (v.1.8.3) 프로그램을 이용하여 adapter trimming을 수행하였고, SolexaQA (v.1.13) package의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 이용하여 trimming 및 quality control을 다음의 조건에 따라 수행하였다; 1) Probability value ≧ 0.05, 2) Phred score ≧ 20, 3) minimum length of reads ≧ 25bp.
66x ligase buffer, ATP와 T4 ligase가 포함된 solution을 처리하여 adapter ligation을 수행하였고, DNA sample들을 pooling한 후 QIAquick PCR Purification kit로 clean up 하고, PCR 을 95°C에서 2 min; 98°C에서 30 s, 65°C에서 30 s, 72°C에서 30 s (18 cycles); 72°C에서 5 min의 조건으로 수행하였다. GBS library의 염기서열분석은 Hiseq2000 (Illumina Inc, San Diego, CA, USA)을 이용하여 수행되었다.
MABC용 마커 개발을 위해, GBS 분석결과로 얻은 SNP genotype data 내에서 다형성 정도를 나타내는 척도인 PIC (Polymorphic information content) value가 0.3 이상인 SNP들을 염색체 별로 5개씩 선발하였다. PIC value는 아래의 공식을 이용하여 산출되었다(Nagy et al.
SEEDERS in-house script을 이용하여 SNP validation을 수행한후, SAMtools(v.0.1.16)을 이용하여 SNP filtering (min.depth≧3, MAF>5%, missing data<30%)을 한 후 SNP matrix를 작성하였다.
각 계통의 유묘로부터 얻어진 본엽 3~ 4매를 액체질소 처리 후 막자사발로 마쇄한 뒤, GeneAll®GeneExTMPlant kit (GeneAllBiotechnology Co., LTD, Seoul, Korea) 를 이용하여, 농도 100㎍/㎕, 순도 260/280=1.8~2.0, 260/230=1.6 이상인 genomic DNA를 추출하여, 정량화 하였다.
선발한 55개의 SNP에 대한 MABC, 품종식별 및 순도검정에 활용 가능성을 검토하기 위해 이들 SNP 를 이용하여 20개 계통의 유연관계를 PCA 및 Hierarchical clustering 분석을 수행하였다. PCA 결과, 계통간 유전적 변이의 약 52%를 설명하는 주성분 1과 11%를 설명하는 주성분 2를 통해(PC1, PC2) 20개 계통을 총 네 개의 그룹(major group A, B, C, D)으로 분류할 수 있었다(Fig.
수박 20개 우량 육성 계통의 SNP 정보를 바탕으로 GAPIT (Genome Association and Integrated Tool) 패키지 (R program v.3.4.2, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) 를 이용하여 수박의 유전형 데이터를 표준화 하고 주성분 분석(PCA)을 실시하였다.
이후 SEEDERS in-house script를 활용하여, reference gene position (ICuGi)을 기반으로 SNP annotation을 수행하고, SNP filtering과 genotyping 조건(reference sequence와 동일한homozygous – ‘AA’, 다른 homozygous-‘BB’, heterozygous – ‘AB’, missing – ‘--’) 에 부합하는 genotype 데이터를 완성하였다.
05, 2) Phred score ≧ 20, 3) minimum length of reads ≧ 25bp. 전처리 과정을 거친 read들의 mapping은 BWA (0.6.1-r104) 프로그램을 이용하여 ICuGI에서 얻은 표준유전체 정보 (Cirullus lanatus cv. 97103)를 바탕으로 수행한 후 SNP 탐색을 위한 SAM format file을 제작하였다. SEEDERS in-house script을 이용하여 SNP validation을 수행한후, SAMtools(v.
추출된 DNA sample의 adapter ligation을 위해, 제한효소 ApeKI을 이용해 75°C에서 2시간 동안 digestion 하였다.
대상 데이터
Filtering 된 2670개의 SNP 중에서 MABC용 분자 마커 개발을 위해 PIC value 가 0.3이상인 1445개의 SNP를 이용하여 분석에 사용하였다. 이들 SNP중에서 각 염색체 별로 물리적으로 비교적 균등한 거리로 분포된 5개 SNP 선발하였다(Fig.
국내 민간육종회사(SN)의 수박 육종프로그램으로 개발된 F1 품종의 부모계인 20개 계통의 잎 샘플을 분양 받아 실험에 사용하였다.
38 였다. 이 중 PIC 값이0.3이상이며 각 염색체 별로 5개씩 균등히 분포된 SNP 총 55개를 최종 선발하였다. 사용된 20개 계통의 유연관계분석을 위해 선발된 55개 SNP를 기반으로 한 주성분 분석(Principle component analysis, PCA) 결과 주성분 1 (52%)과 주성분 2 (11%)를 기준으로4개의 그룹으로 분류 되었으며 각 계통 간 유전자형에 따른 뚜렷한 식별이 가능하였다.
3이상인 1445개의 SNP를 이용하여 분석에 사용하였다. 이들 SNP중에서 각 염색체 별로 물리적으로 비교적 균등한 거리로 분포된 5개 SNP 선발하였다(Fig. 2, Table 2). 총 2670개 SNP의 전체 PIC value의 범위는 0.
이론/모형
2, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) 를 이용하여 수박의 유전형 데이터를 표준화 하고 주성분 분석(PCA)을 실시하였다. 각 계통간 유적적 관계(genetic relationship)을 나타내는 Hierarchical clustering은 VanRaden Kinship matrix (VanRaden 2008)를 통해 분석 및 작성되었다.
성능/효과
20개 수박 계통에 대한 GBS 결과, 약 1,100,000천개의 raw read를 얻었다(Fig. 1). 이 중 수박 유전체에 mapping 된 read는 77%로, 각 계통의 평균 mapping region은 약 4,000 Kb로reference genome coverage의 비율은 2.
) 우량 육성계통 20종을 대상으로 Genotyping-by-sequencing (GBS) 분석을 통해 품종식별, 순도검정, 그리고 마커이용여교잡(Marker-assisted backcross, MABC)용 SNP 세트를 개발하고자 수행되었다. GBS 분석 결과 총 1,100,000천개 raw read 중77%가 수박 유전체에 mapping되었으며 평균 mapping region은 약 4,000 Kb로 2.3%의 genome coverage를 보였다. Filtering을 통해 평균 depth 31.
4)와 매우 유사하여 염색체 영역별로 선발된 55개의 SNP만으로도 20개 계통의 유전적 다양성을 대표할 수 있으리라 판단되었다. Hierarchical clustering 분석 결과에서는 20개 계통을 두 개의 major group (A, B)으로 분류할 수 있었으며, 각 major group은 다시 두 개의 subgroup (A-1, A-2, B-1, B-2)으로 분류되어 PCA 분석과 유사한 경향을 나타내었다(Fig. 5). 유연관계 분석결과, 사용된 55개 SNP 조합으로 모든 20개 계통을 분류할 수 있어 품종식별 및 F1 품종의 순도검정용 마커로서 활용 가능성을 확인하였다.
선발한 55개의 SNP에 대한 MABC, 품종식별 및 순도검정에 활용 가능성을 검토하기 위해 이들 SNP 를 이용하여 20개 계통의 유연관계를 PCA 및 Hierarchical clustering 분석을 수행하였다. PCA 결과, 계통간 유전적 변이의 약 52%를 설명하는 주성분 1과 11%를 설명하는 주성분 2를 통해(PC1, PC2) 20개 계통을 총 네 개의 그룹(major group A, B, C, D)으로 분류할 수 있었다(Fig. 3). 특히 주성분 1에 의한 분류결과는 2670개의 SNP를 이용한 PCA 수행 결과(Fig.
SNP 들은 전반적으로 염색체 모든 영역에서 탐색되었다. SNP의 빈도는 각 염색체마다 차이가 있었지만 교차가 빈번히 일어나는 경향이 있는 염색체 말단 영역에서 대체적으로 높았다. 이는 centromere영역보다 paracentromeric 영역에 높은 빈도로 SNP가 존재하는 결과와 유사하였다(Park et al.
2018). 각 SNP들은 intron 21%, CDS 26%, intergenic 영역에 53% 비율로 분포되어 있는 것을 확인하였다. 같은 박과인 멜론의 경우 50%의 SNP들이 intergenic 영역에 분포하고, 24%가 intron, 26%가 CDS에 분포한 사례와 비교했을 시에 비슷한 경향을 나타내는 것을 알 수 있었다(Pavan et al.
2016). 더욱이 본 연구에서 사용된 계통들이 상용 F1품종의 부모계라는 점에서 원예적 특성이 유사하고, 유전적 다양성이 협소하다는 점은 PIC value의 범위가 낮게 관찰된 원인이라고 판단된다. 소비 시장에 적합한 품종을 얻기 위해, 유전적 거리가 매우 가까운 양친을 사용하여 F1품종을 개발하는 경우가 다수이기에 표현형 기반의 전통적 방법이나 특정 분자마커만을 이용한 품종 지문화에는 어려움이 있었다(Kwon et al.
3이상이며 각 염색체 별로 5개씩 균등히 분포된 SNP 총 55개를 최종 선발하였다. 사용된 20개 계통의 유연관계분석을 위해 선발된 55개 SNP를 기반으로 한 주성분 분석(Principle component analysis, PCA) 결과 주성분 1 (52%)과 주성분 2 (11%)를 기준으로4개의 그룹으로 분류 되었으며 각 계통 간 유전자형에 따른 뚜렷한 식별이 가능하였다. 계층적 군집화(Hierarchical clustering) 분석에서도PCA에서와 유사한 분류양상을 관찰할 수 있었다.
SNP filtering을 통해 총 2670개의 SNP를 얻었다. 순화된 수박 180여개의 수박에서 filtering 후 약 5300개의 SNP를 얻은 경우(Nimmakayala et al. 2014)와 86개 품종에서 약 1만 4천개의 SNP를 얻은 것(Reddy et al. 2014)과 비교 했을 때, 상대적으로 적은 양인 것을 알 수 있었다. 이는 우리가 20개의 품종만으로 분석을 하였고, 사용된 수박들의 유전적 다양성이 매우 낮은 우량 육종계통(advanced breeding line)이었기 때문인 것으로 보인다.
5). 유연관계 분석결과, 사용된 55개 SNP 조합으로 모든 20개 계통을 분류할 수 있어 품종식별 및 F1 품종의 순도검정용 마커로서 활용 가능성을 확인하였다. 유연관계 및 분류 패턴으로 미루어 보아 20개 계통이 market segment에 따른 품종군(Jubilee type, Crimpson type, 대과종, 소과종 등)에 따라 4개의 그룹으로 분류된 것으로 추정된다.
1). 이 중 수박 유전체에 mapping 된 read는 77%로, 각 계통의 평균 mapping region은 약 4,000 Kb로reference genome coverage의 비율은 2.3%, 각 SNP의 평균 depth는 31.57이었다. Trimming 된 데이터 read의 평균은 517만개였고, 이들의 평균 길이는 81.
본 연구에서 개발된 55개 SNP set은 20개 계통 간 품종식별 및 순도검정용 마커로서 활용 가치가 매우 높으며 이들 우량 계통들을 소재로 한MABC에도 직접 이용이 가능하리라 본다. 특히 이들 20개 계통이 유전적 다양성이 매우 협소한 F1 품종의 부모계임에도 불구하고, 55개 SNP로 모든 계통을 식별할 수 있다는 점은 타회사의 육종소재나 품종에도 충분히 확대 적용이 가능할 수 있음을 시사한다. 단 fluidic chip 이나 array와 같은 SNP 자동화 분석 플랫폼(Thomson 2014;Wang et al.
3). 특히 주성분 1에 의한 분류결과는 2670개의 SNP를 이용한 PCA 수행 결과(Fig. 4)와 매우 유사하여 염색체 영역별로 선발된 55개의 SNP만으로도 20개 계통의 유전적 다양성을 대표할 수 있으리라 판단되었다. Hierarchical clustering 분석 결과에서는 20개 계통을 두 개의 major group (A, B)으로 분류할 수 있었으며, 각 major group은 다시 두 개의 subgroup (A-1, A-2, B-1, B-2)으로 분류되어 PCA 분석과 유사한 경향을 나타내었다(Fig.
후속연구
특히 이들 20개 계통이 유전적 다양성이 매우 협소한 F1 품종의 부모계임에도 불구하고, 55개 SNP로 모든 계통을 식별할 수 있다는 점은 타회사의 육종소재나 품종에도 충분히 확대 적용이 가능할 수 있음을 시사한다. 단 fluidic chip 이나 array와 같은 SNP 자동화 분석 플랫폼(Thomson 2014;Wang et al. 2009)에 적합한 형태로의 마커전환과 이를 이용하여 보다 폭 넓은 수박육성소재에 검증하는 과정이 향후 필요하리라 본다.
따라서 본 연구에서 개발된 SNP 세트는 적용 가능성이 검증된20개 계통뿐 만 아니라 향후 다양한 수박 육종소재 및 품종에 대한 품종식별, F1 순도검정 및 MABC에 활용될 수 있으리라 기대된다.
유연관계 및 분류 패턴으로 미루어 보아 20개 계통이 market segment에 따른 품종군(Jubilee type, Crimpson type, 대과종, 소과종 등)에 따라 4개의 그룹으로 분류된 것으로 추정된다. 본 연구에서 개발된 55개 SNP set은 20개 계통 간 품종식별 및 순도검정용 마커로서 활용 가치가 매우 높으며 이들 우량 계통들을 소재로 한MABC에도 직접 이용이 가능하리라 본다. 특히 이들 20개 계통이 유전적 다양성이 매우 협소한 F1 품종의 부모계임에도 불구하고, 55개 SNP로 모든 계통을 식별할 수 있다는 점은 타회사의 육종소재나 품종에도 충분히 확대 적용이 가능할 수 있음을 시사한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
수박의 기존 품종식별 및 순도검정용 마커는 무엇이 있는가?
수박의 기존 품종식별 및 순도검정용 마커로 RAPD, SSR, AFLP 등이 활용되었다(Choi et al. 2012; Levi and Thomas 2007).
Genotyping-by-sequencing(GBS)기술의 특징은 무엇인가?
하지만 이러한 문제점은 최근 Genotyping-by-sequencing (GBS) 기술을 통해 SNP 수를 적당히 줄이고 더 많은 수의 샘플을 분석할 수 있게 됨으로써 극복 되고 있다. GBS 기술은 NGS 기반 방식 중 하나로, 유전체를 제한 효소로 절단하여 얻은 서열을 부분적으로 해독하는 특징을 지니고 있다. GBS는 유전자연관지도 작성, 유전체연관분석(Genome-wide association study, GWAS)을 통한 형질연관 유전자 탐색 및 MAS 및 MABC용 분자마커 선발, 그리고 유전적 다양성 분석을 통한 유전집단 구조 분석 및 품종식별용 마커 개발 등 다양한 분야에서 활발히 사용되고 있다(Elshire et al.
수박이란 무엇인가?
수박(Citrullus lanatus L., 2n=2x=22)은 남아프리카 원산의 박과 작물 중 하나로 건생식물 속 Citrullus Schard에 속한다. 수박은 오이(Cucumis sativus L.
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