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문제 정의
- C, 그리고 무기질 등이 풍부하게 함유된 사과는 효능이 높은 화장품 및 미용소재로서의 활용을 기대할 수 있다. 이에 본 연구는 미성숙사과 과피 열수추출물을 활용하여 tyrosinase, TRP- 1, TRP-2, MITF 단백질 발현 억제효과를 통한 미백활성을 평가함으로써 피부 미백활성을 가진 기능성 화장품소재로의 활용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
- 1×TBST로 3회 washing 후 1차 항체 mouse anti-MITF, TRP-1, TRP-2 및 goat-tyrosinase는 1:1,000 비율로 희석하여 4℃에서 16 hr 반응시킨 다음 10 min 간격으로 1×TBST로 5회 washing 후 mouse anti-goat IgG-HRP와 rabbit anti-mouse IgG-HRP 두 가지 2차 항체는 1:1,000 비율로 희석하여 실온에서 2 hr 반응한 후 ECL kit (Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 film에 옮겨 측정하였다.
- B16F10 세포를 6 well plate에 5×104 cells/well이 되도록 접종하고 각 well에 미성숙 사과 과피 열수추출물(10, 25, 50)μg/ml을 48 hr 동안 처리하였다.
- B16F10 세포를 6 well에 5×104 cells/well이 되도록 분주하여 24 hr 뒤, 각각의 well에 미성숙 사과 과피 열수추출물을 농도별(10, 25, 50) μg/ml로 48 hr 동안 처리하였다.
- L-DOPA를 2 mg/ml 농도로 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹여 기질을 준비하고 기질 160 μl에 효소용액 40 μl를 가하고 37°C에서 1 hr 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정한 후 억제율을 계산하였다.
- Real-time PCR (FastStart Essential DNA Green Master Kit; Roche Diagnostics)을 이용해서 희석한 cDNA 2 μl와 SYBR green 10 μl, primer 1 μl를 각각 넣어 PCR (LightCyber® Nano Real-Time PCR System; Roche Diagnostics) 기기를 이용하여 실시간 정량분석을 한 뒤 결과를 분석하였다.
- 멜라닌색소는 멜라노사이트의 손상과 단백질, DNA 및 지질의 산화와 관련 있는 활성산소 종에 의해 생성된다는 연구에[22] 따라 미성숙 사과 과피 열수추출물의 활성산소 발생에 의한 멜라닌 생성 억제에 효능을 나타내는지 확인하기 위해 항산화 활성평가인 DPPH radical 소거능을 수행하였다. 활성산소는 인체의 단백질, 지질 등과 반응하여 인체노화 및 염증의 원인물질로 알려져 있으며, DPPH 방법에 의한 활성산소 소거능 실험은 안정한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 항산화 물질의 항산화력을 검증하는데 널리 사용되고 있다[8].
- 미성숙 사과 과피 열수추출물의 미백효능을 알아보기 위해 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. B16F10 세포를 6 well plate에 1×105 cells/ml 에 되도록 분주하고 24 hr 동안 안정화 하였다.
- 미성숙 사과 과피 열수추출물이 α-MSH 자극에 의해 유도된 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인하기 위하여 Western blot으로 미백 관련 전사인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 발현을 조사하였다.
- 미성숙 사과 과피 열수추출물이 B16F10 세포에 독성을 나타내는지의 여부를 조사하기 위하여 세포의 대사 과정에서 미토콘드리아의 탈 수소 효소와 MTT tetrazolium이 반응하면 MTT formazan 이 형성되고 이를 DMSO로 재수화시키면 보라색으로 변하는 값을 흡광도로 나타내는 MTT assay를 시행하였다[24]. 시료농도를 10, 25, 50, 75, 100 μg/ml로 처리한 결과 B16F10 cell 에서 50 μg/ml 이하 농도의 세포생존율이 90% 이상으로 나타났으며 75 μg/ml 농도에서 세포독성을 나타낸 결과를 토대로 미성숙 사과 과피 열수추출물의 미백 실험의 시료농도를 생존율 및 증식에 큰 영향을 미치지 않는 50 μg/ml 이내로 실험조건으로 설정하여 다음실험을 진행하였다(Fig.
- 배양 후 미성숙사과 과피 열수추출물의 최종농도가 10, 25, 50, 75, 100 μg/ml이 되도록 각각 20 μl 씩 첨가한 후 48 hr 배양하였다.
- 배지를 제거한 후 미성숙 사과 과피 열수추출물을 농도별(10, 25, 50) μg/ml 처리하고 1 hr 후 멜라닌 자극제인 α-Melanocyte-stimulating hormone(α-MSH) 200 nM으로 Normal군을 제외하고 처리하였다.
- 배지를 제거한 후 미성숙 사과 과피 열수추출물을 농도별(10, 25, 50) μg/ml로 처치하고 1 hr 후 멜라닌 자극제인 α-Melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) 200 nM으로 Normal군을 제외하고 세포를 자극한 후 48 hr 후 PBS로 세척하여 세포를 수확하였다.
- 시료농도를 10, 25, 50, 75, 100 μg/ml로 처리한 결과 B16F10 cell 에서 50 μg/ml 이하 농도의 세포생존율이 90% 이상으로 나타났으며 75 μg/ml 농도에서 세포독성을 나타낸 결과를 토대로 미성숙 사과 과피 열수추출물의 미백 실험의 시료농도를 생존율 및 증식에 큰 영향을 미치지 않는 50 μg/ml 이내로 실험조건으로 설정하여 다음실험을 진행하였다(Fig. 3).
- 시료와 양성대조군 BHT 각 50 μl에 ABTS와 potassium sulfate 혼합액 950 μl를 첨가하여 최종농도를 10, 100, 1,000 μg/ml로 만든 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 미성숙 사과는 2018년 경북 문경시 점촌동에 위치한 애플그린(applegreen)에서 2017년 6월에 제공받았으며 시료를 세척하여 과도를 이용하여 과육부분을 제외하였고 회수된 과피 300 g에 10배 양의 증류수를 첨가하여 85°C에서 3시간 환류냉각 추출하였으며 시료를 원심 분리 및 여과한 다음, rotary vacuum evaporator (HS-10SP; Hahnshin S&T, Korea)를 사용하여 농축한 후 동결기(FD5525; Ilshin BioBase, Korea)로 건조하였다.
- 본 연구에서 사용된 B16F10 세포(mouse melanoma cell line)는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea) 에서 분양받아 사용하였다. B16F10세포의 배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Introgen Therapeutics, USA)과 1%penicillin/streptomycin (Hyclone™, GE Healthcare Life Sciences, USA) 100 U/ml을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Gibco™, Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator (Forma ™, Thermo Fisher Scientific)에 적응시켜 계대 배양하였다.
데이터처리
- The superscripts (a–e) within the same column indicate that they are significantly different at p<0.05, as assessed using Duncan’s multiple range test.
- 실험결과에 대한 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software package (Version 22.0; IBM, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)를 이용하여 유의성을 확인한 후, p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- B16F10 cells were treated with various concentrations (10-100 μg/ml) of UAW. Cell viability was measured using the MTT assay. The results are presented as mean ± standard deviation of triplicate data.
성능/효과
- B16F10 cell 내 미성숙 사과 과피 열수추출물의 미백활성을 분석한 결과, 세포 내 tyrosinase 저해활성 측정 결과는 α-MSH 자극군대비 복합물을 농도별(10, 25, 50) μg/ml로 처리하였을 때 각 1.2, 7.5, 19.8%의 tyrosinase 활성이 저해 되는것을 확인하였다 (Fig. 4A).
- Melanoma 세포에 α-MSH를 처리하여 melanin의 형성을 촉진시켜 멜라닌합성을 유도한 후 미성숙 사과 과피 열수추출물을 농도에 따라 처리한 후 melanin 생합성에 미치는 영향을 측정한 결과 50 μg/ml 농도에서 멜라닌의 합성을 17.3% 저해하였으며 현재 tyrosinase 저해제로서 사용되는 arbutin의 15.2% 대비하여 효능이 우수함을 나타내었다 (Fig. 4B).
- 미성숙 사과 과피 열수추출물의tyrosinase 및 MITF 유전자 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 real time-PCR을 통한 mRNA 발현량을 알아본 결과 α-MSH 자극군에 대비해서 시료의 농도가 높아질수록 저해율이 높아짐을 보였으며 25 μg/ ml 농도에서는 관련유전자 발현량이 유의성 있게 저해율을 보여 미성숙 사과 과피 열수추출물은 유전자발현 단계에서부터 MITF의 전사를 억제하여 tyrosinase 생성을 감소시켜 멜라닌생성을 저해하는 것을 확인하였다(Fig. 6).
- 세포에α-MSH를 단독 처리한 경우에 tyrosinase 및 MITF 발현은 현저히 증가 되었고 미성숙 사과 과피 열수추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25) μg/ml로 처리하였을 때 관련 단백질이 저해되는 것을 확인하였으며 TRP-2의 발현저해가 가장 높게 나타났다.
- 4B). 이러한 결과로 보아 미성숙 사과 과피 열수추출물을 B16F10 세포 내 tyrosinase 활성을 저해시킴으로써 멜라닌 생합성 저해에 영향을 주는 것으로 확인되었으며 천연물에서의 미백제로서 좋은 결과를 나타내었다.
- 5, 25) μg/ml로 처리하였을 때 관련 단백질이 저해되는 것을 확인하였으며 TRP-2의 발현저해가 가장 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 멜라닌 생합성에 있어서 상위신호단계에 있는 전사인자 MITF의 활성을 억제함으로써 Tyrosinase, TRP-1과 TRP-2를 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 5).
- 2 mM의 DPPH (Sigma-Aldrich, USA) 50 μl를 넣어 최종농도를 10, 100, 1,000 μg/ml로 만들어 교반한 후 30 min 방치한 다음 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) reader (PowerWave™ XS Microplate Spectrophotometer; BioTek Instruments, USA)를 이용해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능 효과는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
후속연구
- 6). 천연물을 기반으로 하는 미백화장품에 대한 관심이 급증하면서 오랜기간 안전성을 검증 받아온 식품소재에 대한 연구가 증가하고 있으며 미성숙 사과 과피 열수추출물은 천연 미백소재 개발과 관련하여 tyrosinase, TRP-1과 TRP-2에 의한 멜라닌 생성을 시키는 단백질 및 유전자의 발현을 억제하여 멜라닌 합성을 저해하는 것을 규명하여 그 효능이 우수함을 입증하였으며 향후 기능성 미백 소재로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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