본 연구에서는 낙과 배 물 추출물에 존재하는 미백기능 유효성분으로써 arbutin을 선정하여 HPLC를 통해 가장 높은 함량을 보인 낙과 배 물 추출물로 미백 효과를 알아보았다. 낙과 배 물 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 내 tyrosinase 저해 효과, melanin 생성 저해 효과, tyrosinase와 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과 낙과 배 물 추출물은 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 melanin 생성 저해 효과를 나타내었다. 또한, MiTF와 tyrosinase의 발현의 억제를 통해 미백 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, mushroom tyrosinase 결과를 통해 melanin 생성 과정에 있어 tyrosinase를 직접 저해하는 것이 아닌 세포 내에서 tyrosinase의 발현 조절을 통해 저해하는 것으로 확인하였다. 따라서 낙과 배 물 추출물은 천연 arbutin 미백 기능성 화장품 소재 개발로 이용 가능성이 높은 것으로 판단된다. 낙과 배를 이용한 새로운 뷰티케어 소재를 개발하고 이들의 피부 기능성을 밝혀냄으로써 낙과 배의 다양한 활용성이 증대될 것으로 기대되며, 이를 통하여 국내 과실 농가 및 관련 사업에 기여할 것으로 생각된다.
본 연구에서는 낙과 배 물 추출물에 존재하는 미백기능 유효성분으로써 arbutin을 선정하여 HPLC를 통해 가장 높은 함량을 보인 낙과 배 물 추출물로 미백 효과를 알아보았다. 낙과 배 물 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 내 tyrosinase 저해 효과, melanin 생성 저해 효과, tyrosinase와 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과 낙과 배 물 추출물은 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 melanin 생성 저해 효과를 나타내었다. 또한, MiTF와 tyrosinase의 발현의 억제를 통해 미백 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, mushroom tyrosinase 결과를 통해 melanin 생성 과정에 있어 tyrosinase를 직접 저해하는 것이 아닌 세포 내에서 tyrosinase의 발현 조절을 통해 저해하는 것으로 확인하였다. 따라서 낙과 배 물 추출물은 천연 arbutin 미백 기능성 화장품 소재 개발로 이용 가능성이 높은 것으로 판단된다. 낙과 배를 이용한 새로운 뷰티케어 소재를 개발하고 이들의 피부 기능성을 밝혀냄으로써 낙과 배의 다양한 활용성이 증대될 것으로 기대되며, 이를 통하여 국내 과실 농가 및 관련 사업에 기여할 것으로 생각된다.
This study investigated the water extracts of fallen pear (FPWE) on tyrosinase activity and melanogenesis. In the present study, we examined the effects of FPWE on mushroom tyrosinase activity in vitro, B16F10 melanoma cell tyrosinase activity, melanin contents, and expression of melanogenic enzyme ...
This study investigated the water extracts of fallen pear (FPWE) on tyrosinase activity and melanogenesis. In the present study, we examined the effects of FPWE on mushroom tyrosinase activity in vitro, B16F10 melanoma cell tyrosinase activity, melanin contents, and expression of melanogenic enzyme proteins such as tyrosinase. An apparent down-regulatory effect on tyrosinase activity was observed when B16F10 cells were incubated with FPWE. Results of melanin assay using B16F10 cells treated with different concentrations (50, 125, and $250{\mu}g/mL$) of FPWE showed a dose-dependent decrease in melanin content. To determine whether or not FPWE indirectly affects tyrosinase activity, we assessed mushroom tyrosinase activity upon treatment with various concentrations (125, 250, 500, and $1,000{\mu}g/mL$) of FPWE. In addition, we investigated changes in the protein level of tyrosinase by using Western blotting. Tyrosinase and microphthalmia-associated transcription factor expression levels in B16F10 melanoma cells were reduced in a dose-dependent manner by FPWE. These results suggest that FPWE reduced melanin formation by inhibition of tyrosinase activity. Therefore, we suggest that FPWE could be used an effective whitening agent for skin.
This study investigated the water extracts of fallen pear (FPWE) on tyrosinase activity and melanogenesis. In the present study, we examined the effects of FPWE on mushroom tyrosinase activity in vitro, B16F10 melanoma cell tyrosinase activity, melanin contents, and expression of melanogenic enzyme proteins such as tyrosinase. An apparent down-regulatory effect on tyrosinase activity was observed when B16F10 cells were incubated with FPWE. Results of melanin assay using B16F10 cells treated with different concentrations (50, 125, and $250{\mu}g/mL$) of FPWE showed a dose-dependent decrease in melanin content. To determine whether or not FPWE indirectly affects tyrosinase activity, we assessed mushroom tyrosinase activity upon treatment with various concentrations (125, 250, 500, and $1,000{\mu}g/mL$) of FPWE. In addition, we investigated changes in the protein level of tyrosinase by using Western blotting. Tyrosinase and microphthalmia-associated transcription factor expression levels in B16F10 melanoma cells were reduced in a dose-dependent manner by FPWE. These results suggest that FPWE reduced melanin formation by inhibition of tyrosinase activity. Therefore, we suggest that FPWE could be used an effective whitening agent for skin.
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문제 정의
낙과 배 물 추출물을 α-MSH로 자극한 B16F10 melanoma 세포에서 melanin 생성 억제 및 tyrosinase 효소 활성 저해 효과를 통해 미백 활성을 규명하고자 하였다.
낙과 배 물 추출물의 melanin 생합성에 있어서 tyrosinase의 직접적인 작용을 미치는지 알아보기 위하여 mushroom tyrosinase의 활성을 측정하였다. Tyrosinase의 기질은 L-DOPA와 L-tyrosine을 이용하였으며 양성대조군은 1 mM arbutin을 사용하였다.
본 연구에서는 낙과 배 물 추출물에 존재하는 미백기능 유효 성분으로써 arbutin을 선정하여 HPLC를 통해 가장 높은 함량을 보인 낙과 배 물 추출물로 미백 효과를 알아보았다. 낙과 배 물 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 내 tyrosinase 저해 효과, melanin 생성 저해 효과, tyrosinase와 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과 낙과 배 물 추출물은 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 melanin 생성 저해 효과를 나타내었다.
하지만 대부분의 낙과는 비상품성 미과수로 분류되어 사료, 쨈, 주스 등으로 제한적 식품가공원료로 이용되고 있어 낙과의 부가가치를 높일 수 있는 기능성 연구가 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 낙과 배를 이용하여 피부 기능성 소재로써 이용 가능성이 있는지를 확인하였다. 낙과 배 물 추출물을 α-MSH로 자극한 B16F10 melanoma 세포에서 melanin 생성 억제 및 tyrosinase 효소 활성 저해 효과를 통해 미백 활성을 규명하고자 하였다.
본 연구에서는 낙과 배 물 추출물에 존재하는 미백기능 유효 성분으로써 arbutin을 선정하여 HPLC를 통해 가장 높은 함량을 보인 낙과 배 물 추출물로 미백 효과를 알아보았다. 낙과 배 물 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 내 tyrosinase 저해 효과, melanin 생성 저해 효과, tyrosinase와 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 연구하였다.
제안 방법
3회 TBST로 washing 후 1차 antibody를 상온 에서 2시간 붙인 다음 3회 washing 하여 2차 antibody를 붙였다. 1시간 washing 후 ECL kit(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 이용하여 band를 확인하였다.
B16F10 세포를 이용한 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등(15)의 연구 방법을 변형하여 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포를 6-well plate에 적정세포수(2×10 4 cells/well)로 분주하였으며, 37°C, 5% CO 2 incubator에서 24시간 배양한 후 시료를 처치하였다.
Tyrosinase는 최종 농도가 각각 25 units/ mL, 125 units/mL가 되도록 계산하여 50 μL를 처치하였으며 37°C에서 30분 반응시킨 다음 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
cDNA 합성은 2 μg의 total RNA를 Reverse transcription kit(Qiagen)을 이용하여 역전사시켜 합성하였다.
낙과 배 물 추출물을 세포에 장시간 노출하는 실험으로 세포 독성이 있는지를 확인하기 위해 MTT를 이용하여 낙과배 에탄올 추출물을 농도별 처리하여 세포 독성을 측정하였다. 낙과 배 0, 50, 100% 에탄올 추출물을 농도별 세포독성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 에탄올 추출물에서는 세포 독성을 나타내었다(data not shown).
낙과 배 물 추출물의 melanin 생합 성과 관련한 tyrosinase의 저해 활성을 α-MSH로 자극한 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 측정하였다(Fig. 4).
낙과 배 물 추출물이 melanin 합성 관련 tyrosinase mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해서 α-MSH 처리한 B16 세포로 real time PCR을 수행하였다.
낙과 배 물 추출물이 melanin 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 α-MSH로 자극한 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 melanin 생성 저해 효과를 측정하였다.
마우스 흑색종(mouse melanoma, B16F10) 세포를 96-well plate에 5×10 4 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후 시료를 농도별로 조제하여 처리하고 37°C, 5% CO 2 incubator에서 4~5일 동안 배양하였다.
본 실험에서 사용한 낙과 배는 좋은영농조합법인에서 제공받아 동결건조 하여 분쇄한 후 사용하였다. 시료 20 g에 20배수의 증류수, 25, 50, 75, 100% 에탄올 5가지 용매로 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 상온에서 24시간 추출하여 여과지(Whatman No.
낙과 배 물 추출물이 α-MSH 자극에 의해 유도된 melanin 생성과 tyrosinase 활성을 억제시키는 것을 위 실험을 통해 확인하였다. 이러한 결과가 melanin 생성에 관련된 단백질 발현과도 연관이 있는지를 확인하기 위해 낙과 배 물 추출물의 미백 효과를 melanin 생합성 과정에서 중요한 전사인자인 MiTF와 tyrosinase 단백질 발현 정도를 통해 측정하였다(Fig. 7). 그 결과 α-MSH를 단독 처리한 경우 MiTF와 tyrosinase 각 단백질의 발현이 현저히 증가하였으며, 낙과 배 물 추출물을 50, 125, 250 μg/mL 농도로 처리한 결과 낙과 배 물 추출물 처리에 의해 MiTF 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다.
대상 데이터
, Milford, MA, USA) 장비를 사용하였다. A 용매는 methanol, B 용매는 0.2% acetic acid를 사용하였으며 모든 용매는 사용 전 탈기 및 필터로 여과 후 사용하였다. 칼럼의 유속은 1.
에서 구입하여 사용하였다. Tyrosinase 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Texas, CA, USA)에서 구입하 였으며, MiTF 및 2차 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
Tyrosinase 활성 측정 시 기질은 L-DOPA와 L-tyrosine을 사용하였다. L-DOPA와 L-tyrosine은 100 mM potassium phosphate buffer(pH 6.
낙과 배 물 추출물의 melanin 생합성에 있어서 tyrosinase의 직접적인 작용을 미치는지 알아보기 위하여 mushroom tyrosinase의 활성을 측정하였다. Tyrosinase의 기질은 L-DOPA와 L-tyrosine을 이용하였으며 양성대조군은 1 mM arbutin을 사용하였다. 그 결과 L-tyrosine을 기질로 사용했을 때 1 mM arbutin은 65%의 저해 활성을 나타내었고, L-DOPA를 기질로 사용했을 때는 저해 활성을 나타내지 않았다(18).
구입한 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillin/streptomycin을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Gibco BRL Co.) 배지에 100 nM α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 37°C, 5% CO 2 배양기에서 배양하였다.
낙과 배 추출물에 존재하는 유효성분으로써 arbutin을 선정하였다. Table 1의 분석법을 바탕으로 하여 낙과 배 에탄올 비율별 추출물 내의 arbutin 함량을 측정하였다.
1). 따라서 미백기능 성분인 arbutin의 함량을 바탕으로 낙과 배 물 추출물을 실험에 사용하였다.
따라서 장시간 노출에도 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 낙과 배 물 추출물을 실험에 사용하였으며 250 μg/mL 농도까지를 실험 조건으로 설정하였다.
미백 효과 측정에 사용된 세포 B16F10은 Korean Cell Line Bank(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 구입한 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL Co.
본 실험에서 사용한 낙과 배는 좋은영농조합법인에서 제공받아 동결건조 하여 분쇄한 후 사용하였다. 시료 20 g에 20배수의 증류수, 25, 50, 75, 100% 에탄올 5가지 용매로 상온에서 24시간 동안 추출하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 Statistical Package for the Social Sciences 17(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 일원분산분석법을 사용하였다. 통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test로 P 값이 0.
통계적 유의성은 Duncan’s multiple range test로 P 값이 0.05 미만일때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
cDNA는 고성능 cDNA 합성 kit을 사용하여 증폭시켰다. Real time PCR은 SYBR green premix(Qiagen) 를 이용하여 제조사의 지시된 방법에 따라 수행하였다. 프라머는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 합성 제작하였으며 염기서열은 Table 2와 같다.
성능/효과
α-MSH를 단독 처리한 경우 tyrosinase mRNA의 발현이 증가하였으며, 양성대조군인 arbutin 150 ppm에서 발현이 억제하는 것을 확인하였다.
그 결과 α-MSH를 단독 처리한 경우 MiTF와 tyrosinase 각 단백질의 발현이 현저히 증가하였으며, 낙과 배 물 추출물을 50, 125, 250 μg/mL 농도로 처리한 결과 낙과 배 물 추출물 처리에 의해 MiTF 단백질 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다.
Table 1의 분석법을 바탕으로 하여 낙과 배 에탄올 비율별 추출물 내의 arbutin 함량을 측정하였다. 그 결과 arbutin은 물 추출 시 0.690 mg/g으로 제일 높은 함량을 보였으며(Table 3), 에탄올 함량이 증가할수록 점차 감소하였다 (Fig. 1). 따라서 미백기능 성분인 arbutin의 함량을 바탕으로 낙과 배 물 추출물을 실험에 사용하였다.
그 결과 melanin 생성은 α-MSH의 처리로 증가하였으며, 낙과 배 물 추출물은 50, 125, 250 μg/mL 처리했을 때 농도 의존적으로 저해 효과를 나타내었다.
낙과 배 물 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 내 tyrosinase 저해 효과, melanin 생성 저해 효과, tyrosinase와 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과 낙과 배 물 추출물은 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 melanin 생성 저해 효과를 나타내었다. 또한, MiTF와 tyrosinase의 발현의 억제를 통해 미백 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, mushroom tyrosinase 결과를 통해 melanin 생성과정에 있어 tyrosinase를 직접 저해하는 것이 아닌 세포 내에서 tyrosinase의 발현 조절을 통해 저해하는 것으로 확인하였다.
낙과 배 물 추출물을 세포에 장시간 노출하는 실험으로 세포 독성이 있는지를 확인하기 위해 MTT를 이용하여 낙과배 에탄올 추출물을 농도별 처리하여 세포 독성을 측정하였다. 낙과 배 0, 50, 100% 에탄올 추출물을 농도별 세포독성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 에탄올 추출물에서는 세포 독성을 나타내었다(data not shown). 낙과 배 물 추출물은 50~1,000 μg/mL의 농도로 72시간 측정한 결과 50~ 250 μg/mL의 농도에서는 90% 이상의 생존율을 보였으며, 500 μg/mL 농도 이상에서는 생존율이 75% 이하로 감소하였다(Fig.
낙과 배 물 추출물은 50~1,000 μg/mL의 농도로 72시간 측정한 결과 50~ 250 μg/mL의 농도에서는 90% 이상의 생존율을 보였으며, 500 μg/mL 농도 이상에서는 생존율이 75% 이하로 감소하였다(Fig. 2).
낙과 배 물 추출물의 효과는 50, 125, 250 μg/mL 농도에서 측정하였으며, 그 결과 α-MSH 자극에 의해 유도된 tyrosinase mRNA 발현이 낙과 배 물 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 6).
3). 따라서 낙과 배 물 추출물의 melanin 저해 활성이 우수함을 확인하였다.
그 결과 낙과 배 물 추출물은 tyrosinase 활성과 B16F10 melanoma 세포의 melanin 생성 저해 효과를 나타내었다. 또한, MiTF와 tyrosinase의 발현의 억제를 통해 미백 효과를 나타내는 것으로 확인되었으며, mushroom tyrosinase 결과를 통해 melanin 생성과정에 있어 tyrosinase를 직접 저해하는 것이 아닌 세포 내에서 tyrosinase의 발현 조절을 통해 저해하는 것으로 확인하였다. 따라서 낙과 배 물 추출물은 천연 arbutin 미백 기능성 화장품 소재 개발로 이용 가능성이 높은 것으로 판단된다.
또한, 낙과 배 물 추출물 250 μg/mL 농도로 처리했을 때 미백제로 알려진 양성대조군 arbutin과 각각 72%와 74%로 melanin 저해 활성이 유의한 수준을 보였다(Fig. 3).
4). 위 결과(Fig. 3)와 마찬가지로 낙과 배 물 추출물 처리 시농도 의존적으로 tyrosinase 활성을 저해시켰으며 arbutin 의 저해 활성보다는 미약했지만 유사한 정도로 높은 저해 활성을 나타내었다.
후속연구
따라서 낙과 배 물 추출물은 천연 arbutin 미백 기능성 화장품 소재 개발로 이용 가능성이 높은 것으로 판단된다. 낙과 배를 이용한 새로운 뷰티케어 소재를 개발하고 이들의 피부 기능성을 밝혀냄으로써 낙과 배의 다양한 활용성이 증대될 것으로 기대되며, 이를 통하여 국내 과실 농가 및 관련 사업에 기여할 것으로 생각된다.
Tyrosinase 발현 역시 농도 의존적으로 감소하여 앞선 실험들과 동일한 결과를 확인할 수 있었다. 따라서 낙과 배 물 추출물은 melanin 합성에 관여하는 유전자 발현을 통하여 melanin 생성을 저해하는 것으로 보이며, melanin 생합성의 신호전달 기전은 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
배란?
배는 배나무과(Pomoideae), 배나무속(Pyrus)에 속하는 식물로 세계에서 가장 많이 소비되는 과일 중 하나이며, 원산지에 따라 동양배(Pyrus pyrifolia), 서양배(Pyrus communis) 및 중국배(Pyrus ussuriensis)로 분류된다(7,8). 예로부터 배는 잎과 껍질, 과실을 민간요법으로 사용되어 왔으 며, 잎은 토사광난의 약을, 껍질은 부스럼이나 피부질환에 사용하였으며, 과일은 가래 기침, 숙취, 해열, 배변, 연육 등에 쓰여 왔다(9).
민간요법에 사용된 배 껍질의 용도는?
배는 배나무과(Pomoideae), 배나무속(Pyrus)에 속하는 식물로 세계에서 가장 많이 소비되는 과일 중 하나이며, 원산지에 따라 동양배(Pyrus pyrifolia), 서양배(Pyrus communis) 및 중국배(Pyrus ussuriensis)로 분류된다(7,8). 예로부터 배는 잎과 껍질, 과실을 민간요법으로 사용되어 왔으 며, 잎은 토사광난의 약을, 껍질은 부스럼이나 피부질환에 사용하였으며, 과일은 가래 기침, 숙취, 해열, 배변, 연육 등에 쓰여 왔다(9). 과일에는 많은 폴리페놀과 플라보노이드 성분등 다양한 기능성 성분이 함유되어 있어 항산화, 항노화, 항암, 항염 작용 등 효과가 있는 것으로 알려지고 있으며, 배에 관한 연구로는 품종별 가공적성, 항산화 생리활성(10), 배폴리페놀 분획물의 지질대사(11) 및 배의 저장 중의 포장재에 따른 품질 변화(12) 등의 연구가 있다.
arbutin이 피부 미백작용을 하는 기작은?
특히 arbutin은 피부미백 작용이 있는 물질로 배에 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. Arbutin은 melanin 색소가 피부에 침착되어 발생하는 기미, 주근깨의 원인이 되는 물질인 tyrosinase의 활성을 저해함으로써 미백작용을 한다고 보고되었다(13,14).
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