[논문]참깨 추출물의 항산화 활성 및 melanoma cell (B16F10)에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 의 발현 저해

유단희; 주다혜; 이진영

doi:10.5352/jls.2017.27.3.318

참깨 추출물의 항산화 활성 및 melanoma cell (B16F10)에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 의 발현 저해
Anti-oxidant Function and Inhibitory Effects of the Expression of MITF, TRP-1, TRP-2 and Tyrosinase of Sesamum indicum L. in B16F10 Melanoma Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.27 no.3 = no.203, 2017년, pp.318 - 324

유단희 (호서대학교 한방화장품과학과) , 주다혜 (호서대학교 한방화장품과학과) , 이진영 (호서대학교 한방화장품과학과)

초록
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본 연구는 참깨 70% 에탄올 추출물의 항산화 효과와 미백효과를 검증하여 나타내었다. 참깨 추출물의 전자공여능 측정실험은 $1,000{\mu}g/ml$에서 71.7%의 효과를 나타냈으며, tyrosinase 저해활성 측정은 $1,000{\mu}g/ml$의 농도에서 42%의 효과를 보였다. 참깨 추출물의 세포 생존율을 melanoma cell (B16F10)에서 확인하기 위하여 MTT assay를 진행하였으며, 세포 생존율을 측정한 결과, $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서 84.3%의 독성을 보였다. 이하의 세포실험에서는 세포 생존율이 90% 이상되는 농도인 $500{\mu}g/ml$ 이하에서 실험을 진행하였다. 참깨 추출물의 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 단백질 발현 효과를 50, 250, $500{\mu}g/ml$ 농도에서 측정하였으며, 그 결과 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 각각 $500{\mu}g/ml$ 농도에서 68.3%, 39.2%, 89.7%, 22.3%의 단백질 발현 억제 효과를 보였다. 또한, MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA발현을 RT-PCR로 50, 250, $500{\mu}g/ml$ 농도에서 측정하였고, 양성 대조군으로 GAPDH를 사용하였다. 그 결과, 참깨 추출물의 $500{\mu}g/ml$ 농도에서 각각 81.8%, 66.5%, 84.2%, 68.1%의 mRNA 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 부터 참깨 추출물의 화장품 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was performed to improve the antioxidant and skin-whitening activities of 70% ethanol extract from Sesamum indicum L. (SIL). The electron-donating ability of the SIL extract was 71.7% at a concentration of $1,000{\mu}g/ml$. The whitening effects that was measured by tyrosinase inhibition assay. As a result, SIL extract was shown 42% at $1,000{\mu}g/ml$ concentration. The cell toxicity on B16F10 melanoma cells of SIL of 70% ethanol extract showed 84.3% at $1,000{\mu}g/ml$ concentration. The microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase relate protein-1 (TRP-1), tyrosinase relate protein-2 (TRP-2) and Tyrosinase protein and mRNA expression inhibitory effect of SIL extract were measured by western blot and reverse transcription- polymerase chain reaction (PCR) at 50, 250, $500{\mu}g/ml$ concentration. Consequently, the MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase protein expression inhibitory effect of SIL extract was decreased by 68.3%, 39.2%, 89.7%, 22.3%, respectively, at $500{\mu}g/ml$ concentration. Moreover, MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase mRNA expression inhibitory effect by reverse-transcription-PCR of SIL extract was decreased by 81.8%, 66.5%, 84.2%, 68.1%, respectively, at $500{\mu}g/ml$ concentration. Therefore, we excellently identified the antioxidant activities and whitening effect of SIL extract, and this finding suggested that SIL extract has great potential as a cosmetic ingredients.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 참깨 추출물을 이용하여 이 물질의 항산화 기능과 미백유전자인 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase 의 발현을 억제하는 효과를 관찰하여 새로운 기능성 미백화장품 소재로서의 개발 가능성을 제시하고자 한다.
본 논문에서는 참깨 추출물의 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 단백질 및 mRNA 발현을 측정하여 화장품 소재로의 활성을 검증하였고 유의한 결과를 얻을 수 있었다. 추후 Q-PCR을 실시하여 참깨 추출물의 활성을 좀 더 심도있게 검증한다면 우수한 화장품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 참깨 추출물이 melanin 합성에 관련 있는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 단백질과 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다. mouse melanoma cell (B16F10)에 참깨 추출물을 농도별로 50, 250, 500 μg/ml 처리하여 24시간 뒤에 western blotting으로 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현 측정 결과를 Fig.

제안 방법

DEPC를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 첨가하여 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다.
PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 섞어 준 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30 초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), Tyrosinase는 9 4℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초 (40 cycles)을 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.
Oligo (dT) 15 primer (500 μg/ ml) 1 μl, 추출한 RNA (2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를맞추고 75℃에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl 2 , PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 섞어 준 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30 초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), Tyrosinase는 9 4℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초 (40 cycles)을 하였다.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 94℃에서 30 초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초(35 cycles), Tyrosinase는 9 4℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃ 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94℃에서 30초, 58℃에서 45초, 72℃에서 45초 (40 cycles)을 하였다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 40분간 전기 영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
따라서 미백관련 신호전달인자의 측정은 90% 이상의 세포 생존율을 보이는 500 μg/ml 이하의 농도에서 실험을 실시하였다.
또한 본 연구에서는 참깨 추출물이 melanin 합성에 관여하는 효소인 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 melanoma cell (B16F10)에 50, 250, 500 μg/ml의 샘플을 농도별로 처리한 후 24시간 뒤에 PCR으로 mRNA 발현량을 측정하여 Fig. 5과 같이 나타내었다.
또한 비교 군으로서 기존에 미백 화장품에 첨가물로서 사용하는 kojic acid 500 μg/ml를 사용하여 나타내었다.
멜라닌 생성에 관여하는 미백인자 중 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), Tyrosinase의 활성을 확인하기 위해 melanoma cell (B16F10) 을 100 mm tissue culture dish에 1×10 6 cells/well을 seeding 한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다.
원심 분리하여 얻은 상층액을 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하였으며, 20 μl의 단백질을 10% SDSPAGE사에서 전기영동하여 분리하였다.
이 때, 세포의 종류나 환경에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로서 사용하였다.
5과 같이 나타내었다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 housekeeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. Fig.
전자공여능(EDA: electron donating abilities) 측정 실험은 Blois의 방법[2]을 변형하여 시행하였다. 에탄올에 용해한 0.
세포 독성을 확인하기 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 담황색의 기질로서 생 세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄 효소에 의해 환원되어 암적색의 formazan을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 formazan이 환원되는 정도를 측정 하여 세포 생존율을 측정하였다[21].

대상 데이터

Tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), Tyrosinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), β-actin, primary anti body와 mouse-anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz (CA, U.S.A)에서 구입하였으며, microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 는 Abcam (U.S.A)에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에 이용한 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/ streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였 으며, 37℃, 5% CO 2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
본 연구에서 사용한 참깨는 대전대학교 부속 한방병원에서 구입하여 사용하였다. 참깨를 파쇄 후 참깨 300 g의 10배의 70% ethanol 3,000 ml 가하여 3시간 진탕 혼합하여 이후 상등 액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
A)에서 구입하였다. 세포 독성 및 mRNA 발현억제 측정에 사용된 세포주는 melanoma cell인 B16F10을 ATCC (U.S.A)에서 구입하여 사용하였고, 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A) 에서 구입하여 사용하였다. Tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2), Tyrosinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), β-actin, primary anti body와 mouse-anti-goat, rabbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz (CA, U.
실험에 사용한 기기는 ELISA reader (Tecan, Austria), Image Quant LAS 4,000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden), CO 2 incubator (vision scientific, Korea), pH meter (Mettler-Toledo AG, Swltzerland), centrifuge (Hanil Science Industrial Co. Korea), autoclave (JS Research Inc, Korea), Davinch-Chemi™ imager CAS-400SM System (Davinch-K Co, Korea), PCR (C-100, Bio-Rad. U.S.A), imageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) 등을 사용하였다.
항산화 및 tyrosinase활성억제 측정에 사용된 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), tyrosinase mushroom, L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA), dimethyl sulfoxide (DMSO) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A)에서 구입하였다. 세포 독성 및 mRNA 발현억제 측정에 사용된 세포주는 melanoma cell인 B16F10을 ATCC (U.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (Evanston, IL, USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(analysis of variance ANOVA)을 한 후 α=0.05 수준에서 Turkey’s HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.

이론/모형

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[22]에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
미백인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다.
세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[3]에 따라 시행하였다. Melanoma cell (B16F10)을 96 well plate에 1×10⁵ cells/ well이 되게 0.

성능/효과

Fig. 4에서 보는 바와 같이 참깨 추출물을 50, 250, 500 μg/ml의 농도로 처리한 melanoma cell (B16F10)에서 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의단백질 발현이 농도가 높아짐에 따라서 억제됨을 확인하였으며, 500 μg/ml에서 각각 68.3%, 39.2%, 89.7%, 22.3%의 발현 억제를 보여주었다.
Fig. 5에서 보는 바와 같이 참깨 추출물을 50, 250, 500 μg/ ml의 농도로 처리한 melanoma cell (B16F10)에서 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 mRNA발현이 농도가 높아짐에 따라서 억제됨을 확인하였으며, 500 μg/ml에서 각각 81.8%, 66.5%, 84.2%, 68.1%의 발현 억제를 보여주었다.
또한 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 mRNA발현은 비교군인 kojic acid 500μg/ml에 비해 감소하거나, 유사한 결과를 나타내어 우수한 억제효과를 확인할 수 있었다.
또한 MITF, TRP-1의 단백질 발현은 비교 군인 kojic acid 500 μg/ml에 비해 감소한 것을 확인하였고, TRP-2, Tyrosinase은 kojic acid 500 μg/ml와 유사한 결과를 나타내어 우수한 억제 효과를 확인할 수 있었다.
참깨 추출물은 1,000 μg/ml 농도에서 84.3%의 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다.

후속연구

본 논문에서는 참깨 추출물의 MITF, TRP-1, TRP-2, Tyrosinase의 단백질 및 mRNA 발현을 측정하여 화장품 소재로의 활성을 검증하였고 유의한 결과를 얻을 수 있었다. 추후 Q-PCR을 실시하여 참깨 추출물의 활성을 좀 더 심도있게 검증한다면 우수한 화장품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	멜라닌이란 무엇인가?	피부 미백에 대한 연구는 tyrosinase의 활성 억제, 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 산화 억제, 자외선 차단 등에 대해서 연구가 진행되고 있으며, keratinocyte에 있는 멜라닌의 양과 분포에 따라 피부색과 색소침착이 결정되므로 미백 효과를 검증하기 위해서는 멜라닌의 형성을 억제하는지를 확인하는 것이 중요하다[4]. 멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀 류의 고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이며, 인체내에서 독성물질에 대한 제거 작용을 하여 세포를 보호하는 역할도 한다. 하지만 여러 외적인 요인으로 인한 멜라닌의 과잉 생산은 인체에 기미, 주근깨를 형성하고 피부노화를 촉진 하여 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다.
	멜라닌의 생성 기전은 무엇인가?	하지만 여러 외적인 요인으로 인한 멜라닌의 과잉 생산은 인체에 기미, 주근깨를 형성하고 피부노화를 촉진 하여 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 멜라닌의 생성 기전은 멜라닌세포 내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 tyrosine이 tyrosinase에 의해 DOPA로 전환되고, 다시 tyrosinase에 의해 DOPA quinone으로 전환되어 최종적으로 멜라닌을 생성하게 된다[6, 7]. 대표적인 미백제인 알부틴은 강력한 미백효과가 있는 것으로 알려져 왔으나, 일부 부작용으로 인하여 천연 물질로부터 미백활성을 가지는 물질에 대한 개발과 연구가 진행되고 있다[20].
	피부 미백제 효능에 있어 TRP-1, TRP-2 효소가 관여하는 바는?	멜라닌 합성은 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase, TRP-1, TRP-2에 의해 DOPA를 거쳐 DOPA quinone으로 전환되고 비효소적 반응과 자발적 산화 과정을 거쳐 아미노산 혹은 단백질과의 중합 반응에 의해 멜라닌이 합성된다[19]. TRP-1과 TRP-2는 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)를 흑갈색으로 나타내는 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid (IQCA)로 전환시켜 최종적으로 멜라닌을 합성하며, 이들은 피부 미백제의 효능에 있어서 멜라닌의 생성을 억제하는 경로와 생성된 멜라닌의 분해를 촉진하는 단계에 관여하는 효소의 활성이 중요시되고 있어 미백 효과 검증에 많이 연구되고 있다[12, 15]. 또한 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 뿐만 아니라 MITF 등과 같은 단백질을 이용하여 멜라닌 합성을 억제하는 연구가 이루어지고 있다.

참고문헌 (22)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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