인체 혀의 편평세포암 세포에서 ω3-fatty acid desaturase 유전자 발현이 침윤 및 종양형성에 미치는 영향 Effect of ω3-Fatty Acid Desaturase Gene Expression on Invasion and Tumorigenicity in Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Cells원문보기
오메가-3 지방산(오메가-3)은 수종의 암에 대해 종양형성 억제 및 침윤이 억제됨이 알려져 있다. 그러나 혀의 편평세포암 세포에서 내인성 오메가-3에 의한 침윤 및 종양형성 억제 대한 연구가 명확하게 보고된 바 없다. 이에 본 연구는 혀의 편평세포암 세포에서 ${\omega}3$-fatty acid desaturase의 유전자 발현이 침윤 및 종양형성에 미치는 영향을 규명하였다. 먼저 SCC-4 및 SCC-9세포의 침윤능은 오메가-3인 DHA 처리에 의해 억제 됨을 확인 하였다. DHA 처리 후 MMP-9 및 MMP-2 활성이 감소 되었을 뿐만 아니라 그 promoter의 reporter 활성도 억제하였다. 또한 COX-2 및 VEGF promoter 활성 뿐만 아니라 NF-kB 활성도 DHA에 의해 억제 되었다. SCC-9의 ${\omega}3$-desaturase 유전자 stable 세포(fSCC-9sc)의 세포증식 및 colony formation이 억제 되었으며, in vivo 동물실험에서 fSCC-9sc 세포의 종양형성능은 현저히 억제 되었고, 면역형광염색법을 이용한 fSCC-9sc 세포의 종양 조직에서의 TUNEL 양성세포는 대조군인 fSCC-9cc 세포에 비해 현저히 증가하였다. 이상의 결과로 오메가-3는 인체 혀의 편평세포암 세포의 침윤 뿐만 아니라 종양형성을 억제하여 항암작용을 나타낼 수 있으며 따라서 오메가-3는 인체 혀의 편평암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으리라 생각된다.
오메가-3 지방산(오메가-3)은 수종의 암에 대해 종양형성 억제 및 침윤이 억제됨이 알려져 있다. 그러나 혀의 편평세포암 세포에서 내인성 오메가-3에 의한 침윤 및 종양형성 억제 대한 연구가 명확하게 보고된 바 없다. 이에 본 연구는 혀의 편평세포암 세포에서 ${\omega}3$-fatty acid desaturase의 유전자 발현이 침윤 및 종양형성에 미치는 영향을 규명하였다. 먼저 SCC-4 및 SCC-9세포의 침윤능은 오메가-3인 DHA 처리에 의해 억제 됨을 확인 하였다. DHA 처리 후 MMP-9 및 MMP-2 활성이 감소 되었을 뿐만 아니라 그 promoter의 reporter 활성도 억제하였다. 또한 COX-2 및 VEGF promoter 활성 뿐만 아니라 NF-kB 활성도 DHA에 의해 억제 되었다. SCC-9의 ${\omega}3$-desaturase 유전자 stable 세포(fSCC-9sc)의 세포증식 및 colony formation이 억제 되었으며, in vivo 동물실험에서 fSCC-9sc 세포의 종양형성능은 현저히 억제 되었고, 면역형광염색법을 이용한 fSCC-9sc 세포의 종양 조직에서의 TUNEL 양성세포는 대조군인 fSCC-9cc 세포에 비해 현저히 증가하였다. 이상의 결과로 오메가-3는 인체 혀의 편평세포암 세포의 침윤 뿐만 아니라 종양형성을 억제하여 항암작용을 나타낼 수 있으며 따라서 오메가-3는 인체 혀의 편평암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으리라 생각된다.
Omega-3 polyunsaturated fatty acids (${\omega}3$-fatty acid) have been found to possess anticancer properties in a variety of cancer cell lines and animal models, but their effects in human tongue squamous cell carcinomas (SCCs) remain unclear. This study was designed to examine the effec...
Omega-3 polyunsaturated fatty acids (${\omega}3$-fatty acid) have been found to possess anticancer properties in a variety of cancer cell lines and animal models, but their effects in human tongue squamous cell carcinomas (SCCs) remain unclear. This study was designed to examine the effect of ${\omega}3$-fatty acid desaturase (fat-1) gene expression on invasion and tumorigenicity in human tongue SCC cells and the molecular mechanism of its action. Docosahexaenoic acid (DHA) treatment inhibited in vitro invasion in a dose-dependent manner. In zymography, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and Matrix metallopeptidase-2 (MMP-2) activities were reduced, and MMP-9 and MMP-2 promoter activities were inhibited by the DHA treatment. In addition, cyclooxygenase-2 (COX-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) promoter reporter activities were inhibited in SCC-4 and SCC-9 cells after the DHA treatment. To investigate the effect of a high level of endogenous ${\omega}3$ fatty acids, a stable SCC-9 cell line expressing the ${\omega}3$-desaturase gene (fSCC-9sc) was generated. The growth rate and colony-forming capacity of fSCC-9sc were remarkably decreased as compared with those of fSCC-9cc. Likewise, the tumor size and volume of fSCC-9sc implanted into nude mice were significantly inhibited, with increases in the cell death index. Furthermore, a transwell chamber invasion assay showed a reduction in cell invasion of the fSCC-9sc lines when compared with that of the fSCC-9cc line. These findings suggested that fat-1 gene expression inhibited tumorigenicity, as well as invasion in human tongue SCC cells. Thus, utilization of ${\omega}3$ fatty acids may represent a promising therapeutic approach for chemoprevention and the treatment of human tongue SCCs.
Omega-3 polyunsaturated fatty acids (${\omega}3$-fatty acid) have been found to possess anticancer properties in a variety of cancer cell lines and animal models, but their effects in human tongue squamous cell carcinomas (SCCs) remain unclear. This study was designed to examine the effect of ${\omega}3$-fatty acid desaturase (fat-1) gene expression on invasion and tumorigenicity in human tongue SCC cells and the molecular mechanism of its action. Docosahexaenoic acid (DHA) treatment inhibited in vitro invasion in a dose-dependent manner. In zymography, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and Matrix metallopeptidase-2 (MMP-2) activities were reduced, and MMP-9 and MMP-2 promoter activities were inhibited by the DHA treatment. In addition, cyclooxygenase-2 (COX-2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) promoter reporter activities were inhibited in SCC-4 and SCC-9 cells after the DHA treatment. To investigate the effect of a high level of endogenous ${\omega}3$ fatty acids, a stable SCC-9 cell line expressing the ${\omega}3$-desaturase gene (fSCC-9sc) was generated. The growth rate and colony-forming capacity of fSCC-9sc were remarkably decreased as compared with those of fSCC-9cc. Likewise, the tumor size and volume of fSCC-9sc implanted into nude mice were significantly inhibited, with increases in the cell death index. Furthermore, a transwell chamber invasion assay showed a reduction in cell invasion of the fSCC-9sc lines when compared with that of the fSCC-9cc line. These findings suggested that fat-1 gene expression inhibited tumorigenicity, as well as invasion in human tongue SCC cells. Thus, utilization of ${\omega}3$ fatty acids may represent a promising therapeutic approach for chemoprevention and the treatment of human tongue SCCs.
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문제 정의
Yeh 등[39]은 간암세포의 전이에 NF-kB에 의한 MMP-9의 증가가 중요하다고 하였으며, Yun 등[41]은 MDA-MB-231 유방암 세포에서 오메가-3인 DHA가 NF-kB 활성을 억제한다고 하였다. 이에 DHA에 의한 NF-kB 활성 변동을 검색하기 위해 혀의 편평세포암 세포에서 NF-kB 활성에 대한 DHA의 영향을 검색하였다. SCC-4 및 SCC-9 세포에 NF-kB binding element를 가진 re-porter plasmid를 transient transfection 한 다음 오메가-3인 DHA를 처리하고 NF-kB reporter 활성을 측정하였는데 NF- kB report 활성은 DHA 처리 후 현저히 감소하였으며, 농도의존적으로 나타났다(Fig.
암세포의 침윤에는 matrix metal-loproteinase-9 (MMP-9)등 MMP들의 활성이 중요하며[27, 29, 34], 최근 오메가-3가 침윤을 억제한다고 보고된바, 즉 Yun [41] 등은 유방암 세포에서 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9활성이 억제된다고 하였다. 이에 본 연구에서 인체 혀의 편평세포암 세포에서 MMP-2 및 MMP-9 활성에 대한 오메가-3인DHA의 영향을 검색하였다. 먼저 SCC-4 세포에서 오메가-3인 DHA 처리 후 condition medium을 조제하여 gelatin zymog-rahpy를 시행한바 DHA의 농도 의존적으로 MMP-2 및 MMP- 9의 활성은 억제 되었으나, 오메가-6인 AA에 의해서는 거의 영향이 없었다(Fig.
이에 본 연구에서는 먼저 인체 혀의 편평세포암 세포주에서 먼저 오메가-3인 docosahexaenoic acid (DHA)에 의해 침윤능이 억제됨을 확인하고, 이들 중 SCC-9 세포에서 fat-1 유전자의 stable cell을 확립하였을 뿐만 아니라 fat-1 stable cell의 침윤능 및 nude mice에서 종양형성능 억제를 확인하여 약간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
Day of the implantation of the tumor cells was designated day 0. A: Cultured fSCC-9sc cells were washed with DMEM/F12 and 3x106 cells were injected s.c. into the right flank in each mouse. The tumor size was measured at indicated time with a caliper.
제안 방법
Fat-1 (ω3-desaturase) 유전자가 포함된 plasmid (pST180, 중국 Nanjing University의 Dr. Yifan Dai로부터 기증 받음)를 SCC-9에 lipofectamin을 이용하여 transfection 하여 150 mm dish에 plating 한 후 G418을 농도별로 처리하여 transfection 된 세포를 확인하고, 이들 세포를 colony별로 분리 한 후 G418 (600 μg/ml)이 포함된 배지로 지속적으로 계대 배양하였으며, 이들 세포를 RT-PCR로 fat-1 유전자의 발현여부를 확인하여 fat-1 stable SCC cell (fSCC-9sc)을 확립하였다.
Transfection된 세포에 DHA 등의 약물을 처리하여 일정시간 배양한 후 세포를 1X reporter lysis buffer로 lysis 시키고 luci-ferase assay system (Promega사)을 이용하여 반응시킨 후 Luminometer (Thermo사)로 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase 활성의 측정은 효소액의 단백질 양을 측정한 후 동일한 단백질 양으로 조절한 다음 시행하였다.
Nude mice에서 fat-1 유전자의 SCC-9 stable cell (fSCC-9sc)과 SCC-9 control cell (fSCC-9cc)의 종양 형성능의 차이를 검색하기 위하여 이들 세포를 배양하여 3×106 cells/100 μl로 조절한 후 6주령된 nude mice의 오른쪽 옆구리의 피하에 각각 주입하고 종양의 발생 및 성장에 미치는 영향을 검색하였다.
SCC-4 및 SCC-9 세포를 6-well culture plate에 80% con-fluent하게 plating한 후 0.5 μg/well로 MMP-9-Luc reporter plasmid 등을 lipofectamine을 이용하여 transfection 하였다.
SCC-4 및 SCC-9 세포를 transwell chamber에 5×105 cells/well로 조절하고, 10 μM의 DHA로 처리한 다음 48시간 후에 filter를 통해 이동한 세포를 관찰하여 침윤능을 검색하였다.
A: SCC-9 cells were treated with increased dose of DHA (0-40 μM) in serum-free media for 24 hr. Then, the condition media were prepared and the activity of MMP-2 and MMP-9 were analyzed using gelatin zymography. B and C: SCC-4 (B) and SCC-9 (C) cells were plated and MMP-2 or MMP-9 luciferase reporter gene was transfected by using lipofectamin reagent as described in Materials and Methods.
5 μg/well로 MMP-9-Luc reporter plasmid 등을 lipofectamine을 이용하여 transfection 하였다. Transfection된 세포에 DHA 등의 약물을 처리하여 일정시간 배양한 후 세포를 1X reporter lysis buffer로 lysis 시키고 luci-ferase assay system (Promega사)을 이용하여 반응시킨 후 Luminometer (Thermo사)로 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase 활성의 측정은 효소액의 단백질 양을 측정한 후 동일한 단백질 양으로 조절한 다음 시행하였다.
fSCC-9sc 세포등으로 부터 각각 조제한 total RNA 1 μg, 8 μl의 5x RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 50 mM MgCl2, 2.5 mM spermidine, 50 mM DTT), 2.5 mM dNTP 4μl, oligo-dT (100 pmol/μl) 1 μl, RNase inhibitor (4 unit/μl) 2 μl, AMV reverse transcriptase (5 unit/μl) 2 μl를 42℃에서 1시간 동안 반응하여 single-strand cDNA를 합성하였다.
또한 fat-1 유전자 발현에 의해 fSCC-9sc세포의 세포증식억제를 확인하기 위해 fSCC-9sc세포의 colony formation as-say를 시행하였다. fSCC-9sc 세포의 colony formation은 대조군인 fSCC-9cc에 비해 현저히 감소되었는데 이는 fSCC-9sc 세포의 증식 억제가 fat-1 유전자의 발현에 따른 내인성 오메가-3 증가에 의해 억제됨을 강력히 시사한다(Fig.
침윤능 검색을 위하여 filter 위에 Matrigel (1:10)을 도포시킨 후 37℃에서 2시간 배양하여 젤화되도록 한 다음 세포현탁액 200 μl (2×105 cells)를 upper chamber에 넣고 lower chamber에는 DHA가 포함된 배양액을 넣은 후 일정시간 배양시켰다. 배양이 끝나면 filter 윗면의 세포들을 면봉을 이용해 제거한 후 filter를 분리해 hematoxylin-eosin으로 염색한 후 현미경을 이용해 fil-ter 아랫면의 세포수를 검경 계수하여 판독하였다.
홍 등[13]은 SCC-4 및 SCC-9 세포에서 오메가-3인 DHA가 세포사멸을 유도한다고 하였다. 상기 실험에서 fSCC-9sc 세포의 종양 형성능이 감소되었는바 이의 자가사멸 가능성을 확인하기 위해, 형성된 종양조직에서 TUNEL assay를 시행하여 apoptotic cells를 검색하였다. fSCC-9sc 세포 형성된 종양조직에서는 fSCC-9cc 세포에 의해 형성된 종양조직에 비해 apoptotic index가 현저히 증가 하였으며(p<0.
상기 침윤 실험 결과에서 오메가-3인 DHA가 SCC-9 세포의 침윤능을 억제하였는데, fat-1 유전자의 발현에 따른 내인성 오메가-3에 의해서도 침윤을 억제하는지 밝히기 위해, fat-1 유전자의 stable cell인 fSCC-9sc의 침윤능을 fSCC-9cc를 대조군으로 하여 비교 검색하였다. fSCC-9sc 및 fSCC-9cc 세포를 transwell chamber에 5×105 cells/well로 조절하고 24~48시간 후에 filter를 통해 이동한 세포를 측정하여 침윤능을 검색하였을 때 fSCC-9sc의 침윤능은 fSCC-9cc 세포에 비해 현저히 억제되었다(Fig.
오메가-6인 AA와는 달리 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9 활성이 각각 억제되었는데 이들의 억제가 전사 단계에서 조절되는지 확인하기 위해, DHA 처리 후 MMP-2 및 MMP-9의 promoter 활성을 측정하였다. SCC-4 및 SCC-9 세포를 6-well plate에 배양하여 MMP-2 및 MMP-9 promoter 유전자가 포함된 reporter plasmid를 각각 transient transfection 후 그 활성에 대한 DHA의 영향을 luciferase 활성을 측정함으로 검색하였는데, 먼저 MMP-2 promoter의 luciferase 활성은 SCC-4 및 SCC-9세포에서 DHA 처리 후 억제되었고 이는 농도 의존적으로 나타났으며(Fig.
이를 PBS로 3회 세척한 후 4’,6-diamid-ino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)로 핵을 염색한 것을 mounting medium을 넣고 coverslip으로 밀봉시켜 con-focal microscopy (Olympus TM)로 검경, 촬영하였다.
이를 fat-1 유전자의 primer (Forward: 5’- GGA CCT TGG TGA AGA GCA TCC G-3’, Reverse: 5’- GCG TCG CAG AAG CCA AAC -3’) 와 dNTP, Taq polymerase, Taq buffer등과 섞어 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분씩 30 cycle을 반응시킨 후 1.5% agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.
이에 내인성 오메가-3의 영향을 규명하기 위해, 오메가-6를 오메가-3로 전환하는 효소인 ω3-desaturase (Fat-1) 단백을 발현하는 fat-1유전자 stable SCC-9 세포인 fSCC-9sc을 확립하고, 먼저 이 세포의 세포증식능을 검색하였다.
한편 Lim 등은 오메가-3가 간세포암[22] 및 간담도암[22] 세포에서 COX-2 promoter 활성을 억제한다고 하였다. 이에 혀 편평세포암 세포에서도 오메가-3인 DHA가 COX-2 promoter활성의 억제를 통해 침윤이 억제 되었는지 검색하기 위해, SCC-4 및 SCC-9 세포에 COX-2 promoter re-porter plasmid를 transfection한 후 DHA를 처리했을 때COX-2 promoter 활성은 DHA 처리 후 억제 되었다(Fig. 3).
Yun [41] 등은 오메가-3 지방산을 합성할 수 있는 fat-1 transgenic mice에서 유방암 세포의 종양형성 억제에 VEGF에 감소에 따른 혈관신생이 억제가 관련되어 있다고 하였다. 이에 혀의 편평세포암 세포에서 VEGF 발현에 대한 오메가-3의 영향을 검색하기 위해, SCC-4 및 SCC-9 세포에서 VEGF pro-moter reporter plasmid를 transient transfection 하여 오메가 -3인 DHA의 영향을 luciferase 활성을 측정함으로 검색하였다. SCC-4 및 SCC-9를 6-well plate에 배양한 후 VEGF pro-moter report plasmid를 transient transfection하고 DHA를 처리하였을 때 SCC-4 및 SCC-9 세포 모두에서 VEGF promoter 활성은 농도 의존적으로 억제 되었다(Fig.
Song 등[33]은 췌장암세포에서, Yun [41] 등은 유방암세포에서 오메가-3가 각각 침윤능을 억제한다고 보고하였다. 이에 혀의 편평세포암 세포에서 fat-1 유전자 발현에 따른 침윤능의 영향을 검색하기에 앞서, 먼저 in vitro 실험으로 오메가-3인 DHA가 혀의 편평세포암 세포인 SCC 세포의 침윤능을 억제할 수 있는가를 확인하였다. SCC-4 및 SCC-9 세포를 transwell chamber에 5×105 cells/well로 조절하고, 10 μM의 DHA로 처리한 다음 48시간 후에 filter를 통해 이동한 세포를 관찰하여 침윤능을 검색하였다.
이에 혀의 편평세포암 세포에서 fat-1 유전자 발현에 의해 증가된 내인성 오메가-3의 영향을 검색하기 위해, 96 well tissue plate에 fSCC-9sc 세포를 0.5~1×104 cells/well 로 배양한 다음 24시간 후 MTT로 세포 증식능을 측정하였다.
Nude mice에서 fat-1 유전자의 SCC-9 stable cell (fSCC-9sc)과 SCC-9 control cell (fSCC-9cc)의 종양 형성능의 차이를 검색하기 위하여 이들 세포를 배양하여 3×106 cells/100 μl로 조절한 후 6주령된 nude mice의 오른쪽 옆구리의 피하에 각각 주입하고 종양의 발생 및 성장에 미치는 영향을 검색하였다. 종양형성이 육안으로 확인된 날부터 2주 동안 종양의 크기 및 용적계측을 시행하였다. 종양의 용적은 다음의 공식으로 계산하였다.
즉 fSCC-9sc 등 세포(1×103)를 6 well plate에 배양하고 2주 후 0.5%의 crystal violet로 염색한 다음 형성된 colony를 관찰하였다.
혀의 squamous cell carcinoma (SCC) 세포주인 SCC-4 및 SCC-9의 배양은 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 μg/ml)을 첨가한 DMEM을 배양액으로 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하고, 세포의 밀도가 높아지면 수분간의 trypsin-EDTA (0.05% trypsin, 0.02% EDTA in Hank’s balanced salt solution with-out calcium and magnesium)로 처리한 후 실험할 때 지수기에 있도록 계대 배양하였고, 모든 실험은 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환한 다음 24시간 후 시행하였다.
대상 데이터
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Nutrient Mixture F-12 (Ham's) (1:1) (DMEM/F12), fetal bovine serum등 세포배양에 필요한 시약들은 GIBCO-BRL사(Gaithersburg, MD)에서, DHA 및 arachidonic acid [30] 는 Cayman Chemical 사(Ann Arbor, MI)에서, sodium dodecyl sulfate (SDS) 등은 시약은 Sigma사(St. Louis, MO)에서 구입하였으며 그 외 다른 시약은 특급의 것을 사용하였다.
실험에 사용한 생쥐는 특정 미생물 미감염(SPF) 하에서 유지하였으며, 충남대학교병원 실험동물위원회의 가이드라인에 따라 시행 하였다(동물승인번호: CNUH-017-A0002). Nude mice에서 fat-1 유전자의 SCC-9 stable cell (fSCC-9sc)과 SCC-9 control cell (fSCC-9cc)의 종양 형성능의 차이를 검색하기 위하여 이들 세포를 배양하여 3×106 cells/100 μl로 조절한 후 6주령된 nude mice의 오른쪽 옆구리의 피하에 각각 주입하고 종양의 발생 및 성장에 미치는 영향을 검색하였다.
Yifan Dai로부터 기증 받음)를 SCC-9에 lipofectamin을 이용하여 transfection 하여 150 mm dish에 plating 한 후 G418을 농도별로 처리하여 transfection 된 세포를 확인하고, 이들 세포를 colony별로 분리 한 후 G418 (600 μg/ml)이 포함된 배지로 지속적으로 계대 배양하였으며, 이들 세포를 RT-PCR로 fat-1 유전자의 발현여부를 확인하여 fat-1 stable SCC cell (fSCC-9sc)을 확립하였다. 이 때 control cell로는 pST128 (SV40-neo expression vector, 중국 Nanjing University의 Dr. Yifan Dai로부터 기증 받음)의 stable cell (fSCC-9cc)을 확립하여 사용 하였다(제LMO08-1031호).
즉, 6.5 mm 직경의 8 μm pores를 가진 polycarbonate filter를 내장한 transwell culture cham-ber (Costa, Cambridge, MA)를 이용하였다.
데이터처리
3번 이상의 독립적인 실험을 수행하였으며, 그 실험 결과의 통계 처리는 student's t-test에 준하여 처리하였고, P-value가 최대치 0.05 (p＜0.05) 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
Colony formation assay는 Franken [10] 등의 방법에 준하여 시행하였다. 즉 fSCC-9sc 등 세포(1×103)를 6 well plate에 배양하고 2주 후 0.
Transwell chamber를 통한 침윤능의 측정은 Yoon 등[40] 의 방법에 따라 시행하였다. 즉, 6.
fSCC-9sc 세포등의 증식능은 colorimetric MTT assay를 이용해 측정하였다. 즉 96 well microtiter tissue culture plate에 이들 세포를 5-10x103 cells/well로 plating하고 일정시간 배양한 다음 세포의 배양액을 제거하고 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (0.
성능/효과
오메가-6인 AA와는 달리 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9 활성이 각각 억제되었는데 이들의 억제가 전사 단계에서 조절되는지 확인하기 위해, DHA 처리 후 MMP-2 및 MMP-9의 promoter 활성을 측정하였다. SCC-4 및 SCC-9 세포를 6-well plate에 배양하여 MMP-2 및 MMP-9 promoter 유전자가 포함된 reporter plasmid를 각각 transient transfection 후 그 활성에 대한 DHA의 영향을 luciferase 활성을 측정함으로 검색하였는데, 먼저 MMP-2 promoter의 luciferase 활성은 SCC-4 및 SCC-9세포에서 DHA 처리 후 억제되었고 이는 농도 의존적으로 나타났으며(Fig. 2B), 또한 MMP-9 promoter 활성도 DHA 처리 후 억제되었다(Fig. 2C). 이는 오메가-3인 DHA가 인체 혀의 편평암 세포에서 MMP-2 및 MMP-9의 활성뿐만 아니라 전사도 억제할 수 있음을 시사한다.
이에 DHA에 의한 NF-kB 활성 변동을 검색하기 위해 혀의 편평세포암 세포에서 NF-kB 활성에 대한 DHA의 영향을 검색하였다. SCC-4 및 SCC-9 세포에 NF-kB binding element를 가진 re-porter plasmid를 transient transfection 한 다음 오메가-3인 DHA를 처리하고 NF-kB reporter 활성을 측정하였는데 NF- kB report 활성은 DHA 처리 후 현저히 감소하였으며, 농도의존적으로 나타났다(Fig. 3). 이는 오메가-3인 DHA가 NF-kB 작용을 억제함으로 COX-2, VEGF 및 MMP-9 발현을 조절할 가능성을 시사한다.
이에 혀의 편평세포암 세포에서 VEGF 발현에 대한 오메가-3의 영향을 검색하기 위해, SCC-4 및 SCC-9 세포에서 VEGF pro-moter reporter plasmid를 transient transfection 하여 오메가 -3인 DHA의 영향을 luciferase 활성을 측정함으로 검색하였다. SCC-4 및 SCC-9를 6-well plate에 배양한 후 VEGF pro-moter report plasmid를 transient transfection하고 DHA를 처리하였을 때 SCC-4 및 SCC-9 세포 모두에서 VEGF promoter 활성은 농도 의존적으로 억제 되었다(Fig. 3). 이는 오메가-3 지방산인 DHA가 VEGF 발현을 억제함으로 혀의 편평세포암세포의 혈관신생도 억제할 수 있음을 시사한다.
이때 대조군으로는 SCC-9 세포 및 con-trol vector의 stable cell 인 fSCC-9cc로 하였다. fSCC- 9cc에 비해 fSCC-9sc의 세포 증식은 시간 경과에 따라 현저히 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 4B). 이는 혀의 편평세포암 세포에서 fat-1 유전자의 발현에 따른 내인성 오메가-3에 의해서도 세포증식이 억제 될 수 있음을 시사하는 것이다.
fSCC-9sc 및 fSCC-9cc 세포를 transwell chamber에 5×105 cells/well로 조절하고 24~48시간 후에 filter를 통해 이동한 세포를 측정하여 침윤능을 검색하였을 때 fSCC-9sc의 침윤능은 fSCC-9cc 세포에 비해 현저히 억제되었다(Fig. 6).
elegans의 fat-1 유전자를 주입한 transgenic mice인 Fat-1 mice에서 melano-ma 세포의 종양 형성능이, Lim 등[21]은 간암세포의 종양형성능이 억제된다고 하였고, Lu 등은 nude mice에서 전립선암세포의 fat-1 유전자 stable cell의 종양형성이 억제된다고 하였다[24] 이에 본 실험에서 fSCC-9sc 세포의 종양형성능을 검색하기 위해 nude mice (n=5)에 fSCC-9sc 세포를 3×106 cells/100 μl를 오른편 옆구리에 피하 주사하여 4일 후부터 2일마다 종양의 크기를 측정하였다. fSCC-9sc 세포에서의 종양의 형성능은control 세포인 fSCC-9cc에 비해 크기 및 용적이 현저히 작았다(Fig. 5A). 이는 오메가-3가 혀의 편평암세포의 종양형성능을 억제할 수 있음을 시사한다.
이에 본 연구에서 인체 혀의 편평세포암 세포에서 MMP-2 및 MMP-9 활성에 대한 오메가-3인DHA의 영향을 검색하였다. 먼저 SCC-4 세포에서 오메가-3인 DHA 처리 후 condition medium을 조제하여 gelatin zymog-rahpy를 시행한바 DHA의 농도 의존적으로 MMP-2 및 MMP- 9의 활성은 억제 되었으나, 오메가-6인 AA에 의해서는 거의 영향이 없었다(Fig. 2A). 이상의 결과는 인체 편평세포암세포인 SCC-4 세포에서 오메가-3인 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9의 활성이 억제될 수 있으며, 이는 오메가-3 지방산의 특이 작용임을 시사하는 것이다.
실험방법에 따라 fat-1 유전자를 SSC-9 세포에 삽입하여 fat-1 유전자 stable SCC-9 세포인 fSCC-9sc를 얻었으며 이를 대조군인 fSCC-9cc와 함께 RT- PCR로 fat-1 유전자의 발현을 확인함으로 fSCC-9sc가 잘 확립되었음을 알 수 있다(Fig. 4A).
SCC-4 및 SCC-9 세포를 transwell chamber에 5×105 cells/well로 조절하고, 10 μM의 DHA로 처리한 다음 48시간 후에 filter를 통해 이동한 세포를 관찰하여 침윤능을 검색하였다. 오메가-3인 DHA에 의해 SCC-4 (Fig. 1A) 및 SCC-9 세포(Fig. 1B)의 침윤능은 현저히 억제되었으나 오메가-6인 AA에 의해서는 거의 영향이 없었다. 이는 오메가-3인 DHA가 혀의 편평암세포의 침윤을 억제할 수 있으나, 오메가-6인 AA는 전혀 영향이 없음을 감안 할 때, DHA에 의한 침윤능 억제는 오메가-3의 특이 작용임을 시사한다.
2A). 이상의 결과는 인체 편평세포암세포인 SCC-4 세포에서 오메가-3인 DHA에 의해 MMP-2 및 MMP-9의 활성이 억제될 수 있으며, 이는 오메가-3 지방산의 특이 작용임을 시사하는 것이다.
이상의 결과로 오메가-3는 인체 혀의 편평세포암 세포의 침윤뿐만 아니라 종양 형성능을 억제하여 항암작용을 나타낼 수 있음을 시사하며, 따라서 오메가-3가 혀의 편평세포암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으리라 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
혀의 편평세포암(squamous cell carcinoma, SCC)의 5년 생존률에 영향을 주는 요인은 무엇인가?
혀의 편평세포암(squamous cell carcinoma, SCC)은 구강의 일반적인 악성종양[6]으로 미국에서는2018년에 혀의 암이 17,110명의 새로운 환자가 발생하고 2,510명이 사망할 것이라 추정되었으며[32], 국내에서는 구강 및 인두암이 2015년에 3309명이 발생하고, 1170명이 사망하였다고 보고 되었다[17]. 또한 이들 암은 임파선 전이에 따라 5년 생존율이 25-50%로, 전이가 환자의 생존율에 매우 중요하다고 알려져 있다[42].
오메가-3 지방산(오메가-3)의 특징은 무엇인가?
오메가-3 지방산(오메가-3)은 수종의 암에 대해 종양형성 억제 및 침윤이 억제됨이 알려져 있다. 그러나 혀의 편평세포암 세포에서 내인성 오메가-3에 의한 침윤 및 종양형성 억제 대한 연구가 명확하게 보고된 바 없다.
오메가-6/오메가-3 비율을 감소시켜 얻는 유용성은 무엇이라고 생각되는가?
특히 ω6-polyunsaturated fatty acids (ω6-fatty acid, 오메가-6)/ω3-polyunsaturated fat-ty acids (ω3-fatty acid, 오메가-3)의 비율이 중요한데 이 비율이 높으면 암의 발생, 침윤 및 전이와 밀접히 관련되어 있음으로, 오메가-6은 종양성장 및 전이를 증가하는 반면에 오메가-3는 이를 억제하는 작용이 있다고 한다[8, 12, 37]. 따라서 오메가-6/오메가-3 비율의 감소가 암의 예방 뿐만 아니라 치료에유용하다고[8, 11, 25, 37] 생각 되고 있다. 오메가-3의 항암 작용에 대해서는 Liu 등은 NF-kB등 전사인자의 조절[23, 28], Lim 등은 Cox-2 억제 및 Wnt/β-catenin 신호전달 차단[21, 22, 33], Yao 등은 mirRNA26a/b에 의한 15-PGDH의 증가[38], Yun등은 혈관 신생 억제[5, 26, 41] 및 전이억제[41], Jing 등은자가포식 유도[16] 및 ubiquitin/proteosomal 활성 유도등 다양한 작용으로 암세포를 사멸 시킨다고 알려져 있다[15].
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