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문제 정의
- 본 실험에서는 다양한 근원의 L. acidophilus 균주를 이용하여 장 상피세포의 부착능력을 평가하고 소화 기관에서 의장 내용물의 장 통과에 의한 미생물의 배출과 유사한 환경을 형성하기 위하여 높은 속도의 교반과정을 통한 세척을 실시하였다. 이러한 wash-out에 대한 저항성을 관찰하였고 세포 표면 소수성과 부착능력간의 관계를 검토하였다.
제안 방법
- 이러한 wash-out에 대한 저항성을 관찰하였고 세포 표면 소수성과 부착능력간의 관계를 검토하였다. 또한 병원성 미생물의 예방 측면에서 이러한 L. acidophilus 균주의 EHEC O157H7에 대한 부착 억제 능력을 평가하였다.
- Broth(Difco, USA) 배지에 37℃에서 18시간 진탕배양 후사용하였다. 모든 균주는 각각의 배지에서 배양 후 원심분리(2,000xg, 20 min)하여 균체만 회수한 후 탈지분유(10%), lactose(2%), yeast extract(0.3%)가 함유된 배지를 혼합한 후, 동결 건조시켜 -80℃ 에서 보관하면서 사용하였다. 부착능력실험과 부착억제 실험을 위해 각 균주들은 10 mM phosphate- buffered saline(PBS; Sigma, USA)를 이용하여 3회 세척을 실시하고 사용하였다.
- 0xl09cfu/ml 의 농도가 되도록 PBS에 현탁한 다음 각 well plate에 접종하고 5% CO2 존재 하에 37℃에서 2시간 배양을 실시하였다. 배양이 완료된 후 부착되지 않은 유산균을 제거하기 위해 PBS buffer로 3회, 3분씩 200rpm의 속도로 교반하면서 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 l.
- Ox109cfu/mL 의 농도가 되도록 RPMI에 현탁한 다음 well pla- te에 접종하고 5% CO2 존재 하에 37 ℃ 에서 2시간 배양을 실시하였다. 배양이 완료된 후 부착되지 않은 유산균의 제거와 세척에 따른 부착능력을 확인하기 위해 3분씩 200 rpm의 속도로 교반하면서 PBS buffer를 사용하여 3회 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 0.
- 미치는 중요한 요인으로 연관하여 고려되어야 할 사항이다(Sanford, 1992). 본 실험에서 200rpm으로 3분씩 1회에서 3회까지 세척단계를 실시하여 wash-out에 대한 부착능력을 확인하였다. 그 결과 LGG와 비교했을 때 5종의 L.
- 0xl07 cfu/mL의 농도로 PBS에 현탁된 EHEC ATCC 43889 균주를 접종하고 다시 5% CCh 존재 하에 37P에서 1시간 배양을 실시하였다. 부착되지 않은 EHEC ATCC 43889 균주를 제거하기 위해 PBS buffer로 3회, 3분씩 200rpm의 속도로 교반하면서 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 0.
- 일부 부착확인을 위하여 70% alcohol에 하루 정도 담구어 완전 살균된 cover glass를 petri-dish 바닥에 부착시킨 후 HT-29 세포를 배양하여 위와 동량의 유산균을 첨가하여 실험하였다. 세척에 의해 씻겨 내려가지 않고 HT-29에 부착된 유산균주는 건조한 뒤 Gram 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 배양이 완료된 후 부착되지 않은 유산균의 제거와 세척에 따른 부착능력을 확인하기 위해 3분씩 200 rpm의 속도로 교반하면서 PBS buffer를 사용하여 3회 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 0.2% Trypsin-EDTA를 분주하여 부착되어 있는 세포를 떼어내고 peptone 수를 이용하여 연속희석법으로 MRS-agar에 평판 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 균수를 측정하였다. 일부 부착확인을 위하여 70% alcohol에 하루 정도 담구어 완전 살균된 cover glass를 petri-dish 바닥에 부착시킨 후 HT-29 세포를 배양하여 위와 동량의 유산균을 첨가하여 실험하였다.
- 부착되지 않은 EHEC ATCC 43889 균주를 제거하기 위해 PBS buffer로 3회, 3분씩 200rpm의 속도로 교반하면서 세척을 실시하였다. 세척이 완료된 후 0.2% Trypsin-EDTA를 분주하여 부착되어 있는 세포를 떼어내고 peptone 수를 이용한 연속희석법으로 Mac-Conkey-agar(Difco, USA)에 평판 도말하고 37℃ 에서 24시간 배양하여 균수를 측정하였다.
- 본 실험에서도장 상피세포에 대한 부착능력과. 세포 표면 소수성 과의 상관관계를 알아보기 위해 xylene을 이용하여 세포 표면 소수성을 측정 하였다(Fig. 3). 기존보고에 따르면 Savage 등(1992)은 murine gastric mucosa를 이용하여 Lactobacillus의 부착능력과 세포표면 소수성의 관계를 측정한 결과 어떠한 상관관계도 관찰할 수 없었다고 보고하였으며 Ouwehand 등(1999)은 intestinal mucus를 이용하여 유산균의 부착능력과 세포 표면 소수성과의 관계를 관찰하였을 때 부착능력이 우수하게 나타난 4종의 균주는 세포표면 소수성이 18% 미만으로 나타났으며 이 중 가장 높은 부착능력을 나타낸 LGG의 경우 9% 정도를 나타내었다고 보고하였다.
- acidophilus 균주를 이용하여 장 상피세포의 부착능력을 평가하고 소화 기관에서 의장 내용물의 장 통과에 의한 미생물의 배출과 유사한 환경을 형성하기 위하여 높은 속도의 교반과정을 통한 세척을 실시하였다. 이러한 wash-out에 대한 저항성을 관찰하였고 세포 표면 소수성과 부착능력간의 관계를 검토하였다. 또한 병원성 미생물의 예방 측면에서 이러한 L.
- 4 mL의 xylene과 혼합한 후 2분간 vortexing하였다. 이후 상층의 수용액만 회수한 후 O.D600에서 홉광도를 측정한 후 다음 식에 의하여 산출하였다.
- 2% Trypsin-EDTA를 분주하여 부착되어 있는 세포를 떼어내고 peptone 수를 이용하여 연속희석법으로 MRS-agar에 평판 도말하고 37℃에서 24시간 배양하여 균수를 측정하였다. 일부 부착확인을 위하여 70% alcohol에 하루 정도 담구어 완전 살균된 cover glass를 petri-dish 바닥에 부착시킨 후 HT-29 세포를 배양하여 위와 동량의 유산균을 첨가하여 실험하였다. 세척에 의해 씻겨 내려가지 않고 HT-29에 부착된 유산균주는 건조한 뒤 Gram 염색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- (1998)의 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 배양된 유산균주를 원심분리하여 균체만 회수한 후 PBS를 이용하여 O.D600=l로 조정하였다. 유산균 현탁액은 0.
대상 데이터
- (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. HT-29 세포는 열 비활성화된 10% 우태아혈청(FBS), 1% L-glutamine, penicillin G(100 IU/mL), 그리고 streptomycin(100 mg/mL) 이 첨가된 RPMI I640(Gibco, USA) 배지를 이용하여 5% CO2 존재 하에 37℃에서 배양하였다. 부착능력 실험과 부착 억제 실험을 위해 HT-29 세포는 well당 1.
- 본 실험에서 사용된 균주는 Table 1과 같이 고려대학교 유가공학 실험실에 보관중인 균주들과 ATCC(American Type Culture Collections)에서 분양받은 균주를 사용하였다 유산 균주는 MRS broth(Difco, USA)를 이용하여 37℃에서 18시간 3회 계대배양하여 사용하였고 EHEC ATCC 43889는 Tryptic Soy Broth(Difco, USA) 배지에 37℃에서 18시간 진탕배양 후사용하였다. 모든 균주는 각각의 배지에서 배양 후 원심분리(2,000xg, 20 min)하여 균체만 회수한 후 탈지분유(10%), lactose(2%), yeast extract(0.
- 본 연구에 사용된 장 상피세포는 HT-29로써 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. HT-29 세포는 열 비활성화된 10% 우태아혈청(FBS), 1% L-glutamine, penicillin G(100 IU/mL), 그리고 streptomycin(100 mg/mL) 이 첨가된 RPMI I640(Gibco, USA) 배지를 이용하여 5% CO2 존재 하에 37℃에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3반복을 실시하였으며 실험결과는 SAS program을 이용하여 각 처리구간의 총균수의 차이를 p<0.05 수준에서 t-test를 실시하였다.
이론/모형
- 유산균주의 세포표면 소수성은 Perez et al.(1998)의 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 배양된 유산균주를 원심분리하여 균체만 회수한 후 PBS를 이용하여 O.
성능/효과
- 본 실험에서 200rpm으로 3분씩 1회에서 3회까지 세척단계를 실시하여 wash-out에 대한 부착능력을 확인하였다. 그 결과 LGG와 비교했을 때 5종의 L.acidophilus 모두 105 cfU/mL까지 부착능력이 유지되는 것으로 나타났다(Fig. 1). 따라서 본 실험에서 사용된 5종의 L.
- 1과 같이 나타났다. 기존 많은 연구에 의해 장 상피세포에 높은 부착능력을 가지는 것으로 보고되고 있는 L. rhamnosus GG(LGG)와 비교했을 때 본 실험에서 사용된 5종의 L. acidophi- lus는 HT-29 세포에 높은 수준(l06 ~ l07(cfu/mL)으로 부착하는 것으로 나타났으며 Gram 염색을 통해 현미경으로 부착된 형태를 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이는 5종의 L.
- 본 실험에서는 LGG를 포함한 5종의 L. acidophilus 세포 표면 소수성은 60% 이하로 측정되었으며 특히 부착능력이 우수하다고 보고된 LGG의 경우 9% 정도로 낮은 소수성을 나타내는 것으로 측정된 바 Savage 등(1992)과 Ouwehand 등(1999)의 보고와 유사한 결과를 관찰할 수 있었으며 부착능력과 세포표면 소수성은 높은 상관관계를 나타나지 않는 것으로 나타났다. 따라서 세포표면 소수성은 유산균의 부착능력을 검증하는 1차 선별방법으로 적합하지 않는 것으로 생각된다.
- 본 실험에서는 LGG를 포함한 5종의 L. acidophilus가 모두 2 log 수준의 부착 억제 능력을 나타냈다(Fig. 4). 이는 명확하지는 않지만 본 실험에 사용된 L.
후속연구
- 1). 따라서 본 실험에서 사용된 5종의 L. acidophilus는 wash-out에 대한 저항성이 비교적 높은 것으로 확인되었으며 이후 장 내용물의 통과속도와 더 유사한 환경을 설정함으로써 보다 명확한 결과를 확인할 예정이며 이러한 높은 저항성과 연관하여 유산균의 군락형성과 장 상피세포의 면역 증강작용에 대한 실험이 추가적으로 실시되어야 할 것으로 생각된다.
- , 1993). 따라서 유산균주의 장 상피세포 부착능력을 평가하기 위해서는 세포 표면 소수성 이외에 다양한 유산균주의 표면 단백질의 특성과 수용체에 관한 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 4). 이는 명확하지는 않지만 본 실험에 사용된 L. acidophilus이 생성하는 박테리오신의 생성, 장 상피세포가 분비하는 mucin과 유사한 당단백질 물질 또는 mucin의 분비 촉진 물질의 생성, 젖산의 생성에 의한 pH 저하 등 다양한 요인에 의한 것으로 추정되며 이에 대한 추가 실험이 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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