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문제 정의
- 우리는 효과적인 비만 치료법을 제시하기 위하여 유체전단응력을 3T3-L1 지방전구세포에 직접가해주어 어떠한 변화가 일어나는지 측정하였다. 면역형광염색법(immunofluorescence)을 이용하여 stress fiber의 발달을 관찰하였으며 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용하여 지방생성과 apoptosis 관련 인자 의 변화를 살펴보았다.
- 지방세포의 mechanotransduction은 물리적 자극의 형태와 성질에 따라 경유하는 signaling pathway가 다르다[11]. 따라서 더 다양한 자극에 대한 지방세포의 mechanotransduction을 연구하기 위해 유체전단응력에 의해 활성화 되는 지방세포 의 signaling pathway를 다른 자극들과 비교해보았다. Western blot의 결과를 분석했을 때, 유체전단응력에 의한 물리적 자극은 ERK pathway를 통해 화학적 신호로 변환 되어 세포의 전사 활동에 영향을 준 것으로 보인다(그림 2a).
제안 방법
- 이후 세포의 핵을 DAPI(1:1000)로 3분 동안 염색하고 PBS로 3회 세척한 후 에 형광현미경으로 관찰하였다 (배율 ×200).
- 세포의 actin은 rhodamine-phalloidin으로 염색하였고, 세포의 핵은 4’-6-Diamidini-2-phenylindole (DAPI)로 염색하였다.
- Dish에서 배양한 3T3-L1 세포를 trypsin을 이용하여 떼어준 뒤 slide에 6 × 105 개씩 옮겨 배양하였으며, 세포들이 slide에 충분히 배양 되었을 때 유체전단응력을 부여하였다.
- 면역형광염색법(immunofluorescence)을 이용하여 stress fiber의 발달을 관찰하였으며 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용하여 지방생성과 apoptosis 관련 인자 의 변화를 살펴보았다. 또한 유체전단응력을 각각 1시간, 2시간 동안 가해주어 자극시간에 따른 차이가 있는지 실험하였다.
- Dish에서 배양한 3T3-L1 세포를 trypsin을 이용하여 떼어준 뒤 slide에 6 × 105 개씩 옮겨 배양하였으며, 세포들이 slide에 충분히 배양 되었을 때 유체전단응력을 부여하였다. 실험 조건은 유체전 단응력을 세포에 적용한 이전 연구들을 참고하여 진동수 1 Hz, 압력 1 Pa의 조건으로 각각 1시간, 2시간 동안 유체 전단응력을 부여하였다[21-23]. 전단응력에 사용된 배지는 세포배양에 쓰인 것과 동일한 배지를 사용하였다.
- 세포의 형태 분석을 위하여 immunofluorescence를 실시하였다. 세포의 actin은 rhodamine-phalloidin으로 염색하였고, 세포의 핵은 4’-6-Diamidini-2-phenylindole (DAPI)로 염색하였다.
- Harvest한 세포들을 RIPA buffer와 1:1의 부피로 섞은 뒤 1시간 동안 얼음 위에 두어 단백질을 추출하였다. 추출 한 단백질들은 BCA protein assay kit을 이용하여 농도를 측정하였다. SDS-PAGE 시 gel의 농도는 running gel 9%, stacking gel 5%로 설정하여, 80 V의 전압으로 2시간 동안 전기영동을 진행하였다.
- 추출 한 단백질들은 BCA protein assay kit을 이용하여 농도를 측정하였다. SDS-PAGE 시 gel의 농도는 running gel 9%, stacking gel 5%로 설정하여, 80 V의 전압으로 2시간 동안 전기영동을 진행하였다. Transfer는 100 V의 전압에 서 50분 동안 실시하였다.
- 대조군과 유체전단응력을 각각 1시간, 2시간 부여해 준 3T3-L1 세포에 bright field 사진을 촬영하여 비교하였다 (그림 1a). 그 결과 유체전단응력을 가해줄수록 세포들의 겉모습이 둥근 모양에서 넓적하게 퍼져있는 모습으로 변화한 것을 알 수 있었다.
- 또한 western blot analysis를 이용하여 유체전단응력에 의한 세포 활성의 변화를 분석하였다. 그 결과 세포 내 신호전달경로 중 하나인 ERK pathway가 시간에 따라 활성화되는 것을 알 수 있었다(그림 2a).
- 그림 2. 유체전단응력을 부여한 3T3-L1에 western blot을 실시하여 대조군 대비 세포의 ERK pathway 활성화 정도를 분석한 것. (a) Western blot 결과, (b) p-ERK (n=3, **P<0.
- 지방세포는 물리적 자극에 대한 수용체를 가진 세포로서 외부 자극에 반응하여 유연하게 그 특성을 변화시킨다[6, 11]. 본 실험은 이러한 지방세포의 특성에 집중하여, in vitro 환경에서 3T3-L1 지방전구세포에 일시적인 유체전단 응력을 부여하여 mechanotransduction을 유발, actin stress fiber의 발달을 비교하였고, 관련 signaling pathway 의 활성과 지방생성, 세포사와 관련된 전사 인자들을 분석하였다. 자극의 부여 시간은 fibroblast cell line을 대상으로 유체전단응력 실험을 실시하여 mechanotransduction을 유도한 이전 연구를 참고하여[21-23] 각각 1시간, 2시간으로 설정하였으며, 이 자극에 의한 세포의 변화를 토대로 물리적 자극을 통한 비만 치료의 가능성을 제시하였다.
- 본 실험은 이러한 지방세포의 특성에 집중하여, in vitro 환경에서 3T3-L1 지방전구세포에 일시적인 유체전단 응력을 부여하여 mechanotransduction을 유발, actin stress fiber의 발달을 비교하였고, 관련 signaling pathway 의 활성과 지방생성, 세포사와 관련된 전사 인자들을 분석하였다. 자극의 부여 시간은 fibroblast cell line을 대상으로 유체전단응력 실험을 실시하여 mechanotransduction을 유도한 이전 연구를 참고하여[21-23] 각각 1시간, 2시간으로 설정하였으며, 이 자극에 의한 세포의 변화를 토대로 물리적 자극을 통한 비만 치료의 가능성을 제시하였다.
- 그림 3. 유체전단응력을 부여한 3T3-L1에 western blot을 실시하여 대조군 대비 세포의 지방생성 관련 인자들의 활성화 정도를 분석한 것. (a) Western blot 결과, (b) C/EBPα, (c) C/EBPβ, (d) PPARγ, (e) OPN (n=3, *P<0.
- 그림 4. 유체전단응력을 부여한 3T3-L1에 western blot을 실시하여 대조군 대비 세포의 세포사 관련 인자들의 활성화 정도를 분석한 것. (a) Western blot 결과, (b) Bax와 Bcl-2의 비율, (c) Beclin (n=3).
대상 데이터
- 배양 배지는 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)에 calf serum(CS) 5%, penicillin/streptomycin 1%를 배합하여 사용하였다.
- 세포는 in vitro 환경에서 지방세포 실험을 수행하기 위해 한국세포주은행에서 배양받은 3T3-L1 preadipocyte를 사용하였고, confluence가 80% 이상 되었을 때 subculture를 수행하였다. 배양 배지는 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)에 calf serum(CS) 5%, penicillin/streptomycin 1%를 배합하여 사용하였다.
데이터처리
- 결과의 값은 평균 ± 표준편차(SD)로 표현하였고, 사후 검정은 Tukey’s test를 사용하였다.
- Western blot의 결과로서 검출된 band의 밝기 분석은, Image J 프로그램을 이용하여 측정하였다. 측정된 값은 loading control로 normalize한 뒤, Graphpad Prism 5 프로그램을 이용하여 그래프를 산출, one-way ANOVA를 수행하였다.
- Western blot의 결과로서 검출된 band의 밝기 분석은, Image J 프로그램을 이용하여 측정하였다. 측정된 값은 loading control로 normalize한 뒤, Graphpad Prism 5 프로그램을 이용하여 그래프를 산출, one-way ANOVA를 수행하였다. 결과의 값은 평균 ± 표준편차(SD)로 표현하였고, 사후 검정은 Tukey’s test를 사용하였다.
이론/모형
- 우리는 효과적인 비만 치료법을 제시하기 위하여 유체전단응력을 3T3-L1 지방전구세포에 직접가해주어 어떠한 변화가 일어나는지 측정하였다. 면역형광염색법(immunofluorescence)을 이용하여 stress fiber의 발달을 관찰하였으며 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용하여 지방생성과 apoptosis 관련 인자 의 변화를 살펴보았다. 또한 유체전단응력을 각각 1시간, 2시간 동안 가해주어 자극시간에 따른 차이가 있는지 실험하였다.
성능/효과
- 대조군과 유체전단응력을 각각 1시간, 2시간 부여해 준 3T3-L1 세포에 bright field 사진을 촬영하여 비교하였다 (그림 1a). 그 결과 유체전단응력을 가해줄수록 세포들의 겉모습이 둥근 모양에서 넓적하게 퍼져있는 모습으로 변화한 것을 알 수 있었다. Immunofluorescence 사진을 비교했을 때, DAPI로 염색된 핵의 개수는 유체전단응력을 가해줄수록 감소한 반면 붉은 색으로 염색된 actin의 수는 오히려 증가하였다(그림 1b).
- 지방생성의 주요 인자인 C/EBPα와 C/EBPβ 모두 유체전단응력에 의해 크게 감소하였으며(그림 3b, 3c), 특히 C/EBPβ는 1시간과 2시간 실험군 사이에서도 유의한 변화를 보였다(그림 3c).
- 대조군과 1시간, 2시간 실험군의 세포를 bright field 사진으로 비교해 보았을 때, 대조군에 비해 자극을 가해 준 세포들이 더 넓은 모양으로 퍼져 있는 것을 관찰할 수 있었다 (그림 1a). Immunofluorescence 촬영 사진 또한 자극의 시간 이 길어질수록 actin이 더 진하게 염색되었다(그림 1b).
- Actin 으로 이루어진 stress fiber는 세포가 mechanotransduction이 일어날 때 발달하는 것으로 알려져 있으며, 섬유아세포와 같은 부착세포에서 focal adhesion을 일으켜 세포가 다른 세포나 기질에 접착할 수 있도록 돕는다[12,13]. 이 사실을 종합해 볼 때, 3T3-L1이 유체전단응력을 받아 mechanotransduction 이 발생했고, 세포가 유체의 흐름에 적응할 수 있도록 stress fiber가 focal adhesion을 제공, 넓게 퍼진 형태로 slide glass에 접착된 것으로 보인다. 또한 이전 연구에서 섬유아 세포의 분화에 stress fiber의 활성화가 중요한 역할을 하 는 것으로 알려져 있는데[13,24,25], 이 세포가 지방세포로 분화하기 위해서 stress fiber의 생성이 억제되어야 하므로 반대로 물리적 자극에 의한 stress fiber의 생성은 지방생성을 억제하는 작용과 연관이 있는 것으로 보인다[26,27].
- 또한 유체전단응력에 의해 지방세포의 전사 인자인 C/EBPs가 시간에 따라 크게 감소하여 지방생성이 억제된 것을 알 수 있었는데(그림 3b, 3c), 이 또한 cyclic stretching 으로 인한 결과와 유사하다. 반면에 PPARγ는 대조군과 실험군이 유의한 차이를 보이지 않았지만 1시간 실험군과 2시간 실험군 사이에는 유의한 차이가 존재하였다(그림 3d).
- 반면에 미토콘드리아에 의한 apoptosis 관련 인자인 Bcl-2와 Bax, autophagy 전사 인자인 Beclin은 모두 유의한 변화를 보이지 않았다(그림 4). 생화학적 자극을 이용하여 지 방세포의 지방생성 억제와 apoptosis를 동시에 유발하려는 실험은 이전까지 연구된 바 있지만[4,5], 물리적 자극을 이용하여 apoptosis를 유도하였다는 보고는 미비하다.
- 결론적으로, 유체전단응력은 mechanotransduction을 통한 3T3-L1 지방전구세포의 지방생성 억제에 탁월한 효과를 보였으며 여기에 actin stress fiber의 생성, ERK pathway의 활성화가 관여한 것을 알 수 있었다. 또한 유체 전단응력에 의한 영향은 시간에 따라 변화하였다.
후속연구
- 따라서 지방세포에 부여되는 유체전단응력은 cyclic stretching 과 유사한 종류의 자극으로 생각된다. 추가적인 실험으로 smad2, COX-2 등 물리적 자극을 통해 지방생성을 억제하는 다른 signaling pathway를 분석하고 지방세포에 적용 가능한 다른 자극들과 비교하여 몸의 구조체로서 지방조직의 기능을 추후 보다 심도있게 규명하고자한다[28,29].
- 지방조직에서 OPN은 대식세포의 활성을 조절하여 염증을 일으키는 역할을 하며[30], 비만 환자의 지방조직에서 많이 분비되는 것으로 알려져 있다[31]. 따라서 지방조직 내 유체전단응력을 효과적으로 일으킬 수 있다면 지방조직의 비대화와 같은 염증으로 인한 비만 환자의 증상을 크게 완화 시킬 수 있을 것이다.
- 또한 유체 전단응력에 의한 영향은 시간에 따라 변화하였다. 앞으로 지방세포의 mechanotransduction에 대한 연구가 지속되어, 이에 대한 이해를 바탕으로 유체전단응력을 포함한 물리적 자극을 지방조직에 효율적으로 일으킬 수 있다면, 비만의 주요 증상인 지방조직의 과잉발달을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
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