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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 解肝煎의 간 보호 효능을 HepG2 세포에서 arachidonic acid (AA)와 ferric nitrilotriacetic acid (iron)의 병용처치로 유발된 산화적 스트레스 모델을 활용하여 검증하고자 하였으며, 또한 CCl4를 통하여 유도된 간손상 마우스 모델을 활용하여 in vivo 효능을 검증하였다.
- 따라서 AA+iron의 병용처치는 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 효능을 가지는 약물의 발굴과 항산화 효능과 관련된 약리기전의 연구에 활용되는 대표적인 세포모델이다14-19). 본 연구에서는 AA+iron 병용처치를 이용하여 산화적 스트레스를 매개로 하는 간세포 독성에 대한 解肝煎의 세포 보호효과와 그 약리기전을 우선 연구하였다. 본 연구를 통하여 HE의 전처치가 AA+iron로 유발된 미토콘드리아 막의 기능장애와 그로 인해 활성화된 세포자멸사로부터 간세포 보호효과를 나타낼수 있음을 규명하였으며, HE는 AA+iron에 의한 세포내의 H2O2 생성과 GSH의 고갈을 억제할 수 있음을 확인하였다.
- 또한 반복적 CCl4의 투여는 만성적 염증과 수복과정을 반복하여 간성상세포의 활성화를 통한 간섬유화를 유도한다22). 본 연구에서는 HE 및 op-HE가 CCl4에 의해 증가된 간 실질 내 콜라겐 축적을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 이상의 결과는 HE 및 op-HE가 콜라젠 축적에 관여하는 간성상세포의 활성화를 억제할 수 있는 가능성을 시사하며 이에 대한 후속연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 解肝煎 열수 추출물 (HE) 및 解肝煎 최적방제 (op-HE)의 산화적 스트레스로 유발된 급만성 간질환에 대한 in vitro 및 in vivo 효능 연구를 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 解肝煎을 구성하는 약재 중 Nrf2-ARE활성화를 통해 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 나타내는 핵심적인 약재를 규명하기 위하여 개별 본초 추출물에 대한 ARE-luciferase와 AA+iron에 대한 세포보호효과를 연구하였다. ARE-luciferase 활성증가와 세포 보호효과를 동시에 나타내는 厚朴, 砂仁, 蘇葉가 Nrf2-ARE를 통한 세포 보호효과를 유도하는 HE의 핵심 구성 약재임을 확인하였다.
가설 설정
- Relative cell viability was obtained by adding MTT. B) Effect of HE on expression of apoptosis-related proteins. Cells were treated with HE and AA+iron, as described in panel A.
제안 방법
- 이상의 解肝煎 구성 본초에 대한 ARE-luciferase를 통한 Nrf2 활성화 효과 및 MTT assay를 통한 세포보호효과 연구에서 공통적으로 통계적 유의성을 나타내는 5종의 구성 본초 중 문헌 연구를 통하여 Nrf2 이외의 세포신호전달 경로에 의존적인 간세포 보호효능이 규명된 본초와 解肝煎과 유사한 세포 보호효능을 나타내지 못하는 본초를 제외한 상위 3종인 厚朴, 砂仁, 蘇葉을 이용하여 解肝煎에 포함된 동량의 厚朴, 砂仁, 蘇葉로 解肝煎 최적방제 (op-HE)를 구성하였다 (Table 1).
- 12시간 동안의 100 또는 300 μg/mL HE 처치는 무처치 대조세포와 비교하여 각각 2.62±0.04배, 6.47±0.32배로 luciferase 활성을 증가시켰다.
- AA+iron 병용처치 모델을 활용하여 본 연구실에서는 산화적 스트레스에 대한 간 보호효과를 나타내는 한약소재 및 이들로부터 유래한 천연물로서 密蒙花, eupatilin, tryptanthrin 등을 발굴하였으며, 이들 소재가 AMP-activated protein kinase (AMPK)의 활성화를 통하여 세포 보호효능을 나타냄을 제시하였다14,15,19). AMPK는 세포 내의 에너지 상태를 포함하여 열충격, 저산소 등의 자극으로부터 세포 내 보상 작용을 수행하며 산화적 스트레스에 대한 방어작용을 나타내는 신호분자로 알려져 있다23,24).
- . AA+iron 처치에 의한 활성산소종 증가에 HE의 보호효과를 확인하기 위하여 H2DCF-DA를 활용하여 세포 내에 생성된 H2O2를 측정하였다 (Fig. 3A). AA+iron 처치는 세포 내의 H2O2의 생성을 무처치 대조군 (1.
- 미토콘드리아는 세포 내 에너지 생성을 당담하는 소기관임과 동시에 내인성 경로를 통한 세포자멸사를 유도한다. AA+iron으로 유도된 미토콘드리아 막전위 손상에 대한 HE의 보호효과를 관찰하기 위하여 미토콘드리아 막에 특이적으로 결합하는 형광염료인 rho123을 이용하여 유세포 분석을 실시하였다(Fig. 2). AA+iron 처치는 rho123 negative fraction (RN)을 무처치 대조군 (3.
- AA+iron으로 유도된 세포독성에 대한 HE의 보호효과를 관찰하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다 (Fig. 1A). AA+iron 처치는 무처치군 (100.
- AA+iron의 처치는 무처치 대조군 (3.61±0.18 μM)에 비교하여 GSH 함량을 2.21±0.09 μM로 감소시켰으며, HE (100 μg/mL) 전처치는 GSH 함량을 무처치 대조세포 수준으로 회복시켰다.
- H2DCF-DA를 이용하여 세포내 발생하는 H2O2의 양을 측정하였다. 세포를 96 well plate에 well 당 1×104개의 밀도로 분주하였다.
- HE의 Nrf2-ARE 경로를 통한 전사활성화를 확인하기 위하여 ARE 리포터 유전자 (ARE-luciferase)를 안정적으로 발현하는 재조합 세포주를 활용하여 리포터 유전자 분석을 실시하였다 (Fig. 4A, right).
- . HE의 산화적 스트레스 억제 효능에 Nrf2의 활성화가 관여하는지 확인하기 위하여 HE 처치시간에 따른 Nrf2의 인산화를 측정하였다 (Fig. 4A, left). HepG2 세포에서 6시간 동안의 100 μg/mL HE 처치는 무처치 대조세포와 비교하여 Nrf2의 인산화를 3.
- 10배로 통계적으로 유의하게 억제하였다. HE의 항산화 작용을 확인하기 위하여 세포 내 환원형 GSH의 함량을 측정하였다 (Fig. 3B). AA+iron의 처치는 무처치 대조군 (3.
- 37[luc2P/ARE/Hygro] (Promega)를 FuGENE® HD Transfection Reagent (Promega)를 이용하여 형질주입하였다. Hyglomycin을 활용하여 pGL4.37을 안정적으로 발현하는 세포를 선별하여 stable cell line을 구축하였다. 처치된 세포를 passive lysis buffer (Promega)를 이용하여 용해한 뒤, luciferase assay system (Promega)을 이용하여 발현된 luciferase 활성을 측정하였다.
- . Nrf2-ARE 활성화를 통한 세포 보호효과에 기여하는 解肝煎 구성 본초를 선별하기 위하여 단일 본초 추출물에 대한 ARE-luciferase 및 MTT assay를 활용하여 검색하였다(Fig. 5A). ARE-luciferase를 활용한 리포터 유전자분석 결과 厚朴, 砂仁, 蘇葉, 芍藥, 茯苓에서 무처치 대조세포와 비교하여 통계적으로 유의한 Nrf2 전사 활성화의 증가를 확인하였다 (Fig.
- 전세포 추출액 (whole cell lysates)를 얻기 위하여 수거한 세포를 protease inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 포함한 radioimmunoprecipitation buffer를 이용하여 4℃에서 40분간 용해한 뒤 15,000×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 전세포 추출액을 제조하였다. Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL, USA)를 활용하여 전세포 추출액의 단백질 함량을 측정하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel상에서 전기영동을 통해 분리하고, nitrocellulose membrane에 전사한 후 4℃에서 각각의 1차 항체와 12시간 이상 반응시켰다.
- 세포 내의 RNA를 Tri-solution (Bioscience Technology, Daegu, Korea)를 이용하여 분리한 후, Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)와 oligo dT를 활용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 SYBR green premix (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)와 CFX-96 (Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 각 유전자 mRNA의 발현량은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA의 양으로 보정하여 상대 정량하였다. 본 연구에 사용된 primer의 염기서열은 다음과 같다: human HO-1, 5’-CAGGAGCTGCTGACCCATGA-3’ (forward), 5’-AGCAACTGTCGCCACCAGAA-3’ (backward); human GCLC, 5’-GAAGTGGATGTGGACACCAG-3’ (forward), 5’-TTGTAGTCAGGATGGTTTGC-3’ (backward), human GAPDH 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (forward), 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (backward).
- 解肝煎 최적방제, op-HE의 Nrf2-ARE 활성화능을 HE와 비교하기 위하여 ARE-luciferase를 안정적으로 발현하는 재조합 HepG2 세포에 동일 농도인 100 μg/mL의 op-HE와 HE를 12시간 동안 처치한 후 리포터 유전자 활성을 관찰하였다 (Fig. 5B, left).
- 5 mL/kg/day)를 corn oil에 혼합하여 3일 간격으로 4회 복강 투여하였다. 解肝煎 추출물 (HE, 100 mg/kg/day) 및 解肝煎 최적방제 추출물 (op-HE, 100 mg/kg/day)은 첫번째 CCl4 투여 5일전부터 총 14일간 경구 투여하였다. 마우스는 마지막 CCl4 투여 24시간 후에 희생시켜 혈액과 간조직을 획득하였다.
- 解肝煎 추출물 (HE, Haegan-jeon extract), 최적방제 해간전 추출물 (op-HE, Optimized Haegan-jeon extract) 및 본초 추출물은 각각 증류수에 100 mg/mL의 농도로 용해하여 0.2 μm syringe filter (Nalgene)로 여과한 뒤 실험에 사용하였다.
- 각 단백질의 상대정량은 ImageJ software (NIH; http://imagej.nih.gov/ij)를 이용하여 β-actin에 대한 발현량의 비로서 계산하였다.
- 실험동물은 온도 20-25℃, 습도 40-60%와 12시간 간격의 밤낮주기를 일정하게 유지시킨 환경에서 사육되었다. 간손상을 유발하기 위하여 CCl4 (0.5 mL/kg/day)를 corn oil에 혼합하여 3일 간격으로 4회 복강 투여하였다. 解肝煎 추출물 (HE, 100 mg/kg/day) 및 解肝煎 최적방제 추출물 (op-HE, 100 mg/kg/day)은 첫번째 CCl4 투여 5일전부터 총 14일간 경구 투여하였다.
- 이후 paraffin에 포매하여 3-4 μm의 두께로 절편하여 hematoxylin-eosin 혹은 Sirius red로 염색하였다. 간실질 내의 변성부위 면적, 변성 간세포수, 침윤된 염증세포 및 콜라겐 침착 면적 등은 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan) 하에서 이미지 분석 소프트웨어 (iSolution FL ver 9.1, IMT iSolution Inc., Vancouver, Quebec, Canada)를 이용하여 측정하였다.
- 解肝煎 구성 본초들은 증류수에 세척한 후 음건하였다. 건조중량 100 g을 증류수 1.5 L에 넣어 3시간 전탕하여 추출액을 얻은 후, No.2 filter paper (Nalgene, New York, NY, USA)로 여과하고 진공회전농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)을 이용하여 농축하였다. 이후 동결건조 (Labconco, Kansas, MO, USA)를 진행하여 수분을 제거하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 解肝煎의 간 보호 효능을 HepG2 세포에서 arachidonic acid (AA)와 ferric nitrilotriacetic acid (iron)의 병용처치로 유발된 산화적 스트레스 모델을 활용하여 검증하고자 하였으며, 또한 CCl4를 통하여 유도된 간손상 마우스 모델을 활용하여 in vivo 효능을 검증하였다. 더 나아가 Nrf2 활성화 특이적인 解肝煎 구성 본초를 활용한 최적방제를 도입하여 항산화 작용과 간 보호 효능을 원방인 解肝煎과 비교하였다.
- . 따라서 HE의 간세포 보호효과에 AA+iron으로 유도된 세포자멸사의 억제가 관여하는지 확인하기 위하여 세포자멸사 관련 단백질인 PARP, caspase-3, 및 bcl-2의 세포 내 단백질 발현량의 변화를 측정하였다 (Fig. 1B). 예상하였던바와 같이, AA+iron의 처치는 PARP, caspase-3, bcl-2의 세포 내 발현을 감소시켜 세포자멸사를 유도하였음을 확인하였다.
- 이로 인해 생성된 과도한 산화적 스트레스는 미토콘드리아의 기능장애와 세포자멸사로 이어진다. 또한 AA와 iron의 병용처치는 세포 내의 활성산소종의 생성을 증폭시켜 산화적 스트레스가 매개된 간세포의 세포자멸사를 가속화한다. 따라서 AA+iron의 병용처치는 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 효능을 가지는 약물의 발굴과 항산화 효능과 관련된 약리기전의 연구에 활용되는 대표적인 세포모델이다14-19).
- 미토콘드리아의 막 전위 (mitochondrial membrane potential)의 변화를 측정하기 위하여 처치된 세포를 미토콘드리아 막 표면에 특이적으로 결합하는 rho123 (0.05 μg/mL)에 30분간 염색하였다.
- 분리된 혈청 내에 존재하는 alanine aminotransferase (ALT)와 aspartate aminotransferase (AST) 효소 활성은 automated blood analyzer (Photometer 5010, Robert Riele GmbH & Co KG, Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다.
- 세포 내의 RNA를 Tri-solution (Bioscience Technology, Daegu, Korea)를 이용하여 분리한 후, Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)와 oligo dT를 활용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 SYBR green premix (TaKaRa Bio, Shiga, Japan)와 CFX-96 (Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 각 유전자 mRNA의 발현량은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA의 양으로 보정하여 상대 정량하였다.
- 생성된 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide로 용해시킨 후 microplate reader (Infinite M200 Pro, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 무처치군 대비 처치군의 흡광도의 백분율로 계산하였다. [Cell viability (%)=(처치군의 흡광도)/(무처치군의 흡광도)×100]
- 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel상에서 전기영동을 통해 분리하고, nitrocellulose membrane에 전사한 후 4℃에서 각각의 1차 항체와 12시간 이상 반응시켰다. 이후 membrane을 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체 (Cell Signaling Technology)와 상온에서 반응시킨 뒤, ECLTM western blotting detection system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)과 반응하여 발생하는 빛을 x-ray film (Agfa, Mortsel, Belgium)에 감광하였다. 각 단백질의 상대정량은 ImageJ software (NIH; http://imagej.
- 이후 paraffin에 포매하여 3-4 μm의 두께로 절편하여 hematoxylin-eosin 혹은 Sirius red로 염색하였다.
- 이후 세포를 다시 1% FBS를 포함하는 phosphate buffered saline에 현탁하여 flow cytometry (Partec, Münster, Germany)를 이용하여 분석하였으며, 각 sample 당 20,000개의 event를 기록하였다.
- 전세포 추출액 (whole cell lysates)를 얻기 위하여 수거한 세포를 protease inhibitor cocktail (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 포함한 radioimmunoprecipitation buffer를 이용하여 4℃에서 40분간 용해한 뒤 15,000×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 전세포 추출액을 제조하였다.
- 조직학적인 관찰을 위하여 마우스로부터 적출한 간의 외좌엽을 10% neutral buffered formalin에 고정하였다. 이후 paraffin에 포매하여 3-4 μm의 두께로 절편하여 hematoxylin-eosin 혹은 Sirius red로 염색하였다.
- 처치 후 세포를 20 μM의 H2DCF-DA에 30분간 염색한 뒤, 세포 내의 H2O2와의 반응을 통해 생성된 dichloroflourescein의 형광을 microplate reader (Tecan)을 이용하여 측정하였다.
- 37을 안정적으로 발현하는 세포를 선별하여 stable cell line을 구축하였다. 처치된 세포를 passive lysis buffer (Promega)를 이용하여 용해한 뒤, luciferase assay system (Promega)을 이용하여 발현된 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase활성은 세포 용해액의 단백질 농도로 보정하였다.
대상 데이터
- 6주령의 male ICR 마우스를 Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea)로부터 공급받아 실험 전 1주일간 사육환경에 적응시켰다. 실험동물은 온도 20-25℃, 습도 40-60%와 12시간 간격의 밤낮주기를 일정하게 유지시킨 환경에서 사육되었다.
- Anti-phosphorylated Nrf2 는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. AA, rhodamine123 (rho123)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 dimethyl sulfoxide는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. Anti-β-actin 항체와 2’,7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), iron 및 기타 분석용 시약들은 Sigma Aldrich (St.
- Anti-β-actin 항체와 2’,7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate (H2DCF-DA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), iron 및 기타 분석용 시약들은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- Anti-poly(ADP ribose) polymerase (PARP), anti-bcl-2, anti-caspase-3 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-phosphorylated Nrf2 는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다. AA, rhodamine123 (rho123)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 dimethyl sulfoxide는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
- Anti-poly(ADP ribose) polymerase (PARP), anti-bcl-2, anti-caspase-3 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-phosphorylated Nrf2 는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다.
- HepG2 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분양받았으며 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포는 penicillin-streptomycin (Gibco, Rockville, MD, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)을 이용하여 배양하였으며 40~80%의 confluency를 유지하며 계대되었다.
- HepG2 세포에 리포터 유전자인 pGL4.37[luc2P/ARE/Hygro] (Promega)를 FuGENE® HD Transfection Reagent (Promega)를 이용하여 형질주입하였다.
- 半夏, 陳皮, 茯苓, 厚朴, 蘇葉, 芍藥, 砂仁, 生薑는 대원약업사 (Daegu, Korea)에서 구입하였으며 解肝煎 및 解肝煎의 최적방제는 Table 1에 기재한 본초의 중량비로 구성하였다. 解肝煎 구성 본초들은 증류수에 세척한 후 음건하였다.
- 解肝煎 추출물 (HE, 100 mg/kg/day) 및 解肝煎 최적방제 추출물 (op-HE, 100 mg/kg/day)은 첫번째 CCl4 투여 5일전부터 총 14일간 경구 투여하였다. 마우스는 마지막 CCl4 투여 24시간 후에 희생시켜 혈액과 간조직을 획득하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교의 동물실험윤리위원회의 허가를 받아 동물실험윤리규정을 준수하여 실행되었다(연구윤리 승인번호, DHU2015-018).
- 세포는 penicillin-streptomycin (Gibco, Rockville, MD, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)을 이용하여 배양하였으며 40~80%의 confluency를 유지하며 계대되었다.
데이터처리
- Student t-test를 이용하여 두 군간의 평균을 비교하였다.
- 일원분산분석을 이용하여 세 개 이상의 군간 평균을 비교하였으며 이후 사후 분석을 진행하였다. Student t-test를 이용하여 두 군간의 평균을 비교하였다.
이론/모형
- op-HE의 간 보호 in vivo 효능을 HE와 비교하여 확인하기 위하여 CCl4로 유도된 마우스 간손상 모델을 이용하였다 (Fig. 6A). 3일 간격으로 CCl4 4회 투여는 대조군과 비교하여 혈중의 ALT와 AST 활성을 통계적으로 유의하게 증가시켰으며, 14일 간의 HE 또는 op-HE (100 mg/kg/day, p.
- 세포 내의 glutathione의 양을 GSH-Glo™ Glutathione Assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 활용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였다.
- 세포생존율은 MTT assay를 통하여 측정하였다. 세포를 24 well plate에 각 well 당 2×105개의 밀도로 분주하였으며 약물 처치 후 0.
성능/효과
- 1. HE는 농도 의존적으로 HepG2 세포에서 AA+iron 처치에 의한 세포자멸사를 억제하였다.
- 2. HE는 HepG2 세포에서 AA+iron 처치에 의한 세포내의 H2O2 생성과 GSH의 고갈을 억제하였으며 미토콘드리아의 막 전위 저하를 억제하였다.
- 3. HE는 Nrf2의 인산화와 Nrf2-의존적 전사 활성화 및 Nrf2-의존적 표적유전자들의 발현을 증가시켰다.
- 30 또는 100 μg/mL의 HE 전처치는 AA+iron에 의하여 증가한 RN fraction을 각각 14.67±3.97%, 6.82±2.49%로 감소시켰으며, 100 μg/mL에서의 감소만이 통계적으로 유의하였다.
- 30-300 μg/mL의 HE 전처치는 AA+iron에 의하여 감소된 세포생존율을 농도의존적으로 회복시키는 경향을 나타내었으며, 100과 300 μg/mL의 농도에서의 세포생존율은 각각 대조세포 대비 71.06±8.60%, 94.18±6.44%로 AA+iron 처치그룹과 비교하여 통계적으로 유의하였다.
- 3일 간격으로 CCl4 4회 투여는 대조군과 비교하여 혈중의 ALT와 AST 활성을 통계적으로 유의하게 증가시켰으며, 14일 간의 HE 또는 op-HE (100 mg/kg/day, p.o.) 투여는 CCl4에 의하여 증가한 ALT와 AST 활성을 통계적으로 유의하게 감소시켰다.
- 4. Nrf2-의존적 세포 보호에 관여하는 HE 구성 약재는 厚朴, 砂仁, 蘇葉이었으며, 이들로 구성된 解肝煎 최적방제 (op-HE)의 Nrf2-의존적 세포 보호 효능은 HE와 통계적 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 5. HE와 op-HE는 모두 CCl4에 의한 혈중 ALT, AST활성의 증가 및 간조직 내의 변성부위, 변성 간세포의 수, 침윤된 염증세포의 수, 콜라겐 축적 면적 증가를 억제하였으며, 두 약물 투여에 의한 통계적 차이는 나타나지 않았다.
- AA+iron 처치는 무처치군 (100.00±5.00%) 대비 27.28±6.73%로 HepG2 세포의 세포생존율을 통계적으로 유의하게 감소시켰다.
- AA+iron 처치는 세포 내의 H2O2의 생성을 무처치 대조군 (1.00±0.05) 대비 2.55±0.14배로 통계적으로 유의하게 증가시켰으며, 30, 100 μg/mL의 HE 전처치는 H2O2 생성을 무처치 대조세포와 비교하여 각각 2.09±0.12배, 1.53±0.10배로 통계적으로 유의하게 억제하였다.
- 본 연구에서는 解肝煎을 구성하는 약재 중 Nrf2-ARE활성화를 통해 산화적 스트레스에 대한 보호효과를 나타내는 핵심적인 약재를 규명하기 위하여 개별 본초 추출물에 대한 ARE-luciferase와 AA+iron에 대한 세포보호효과를 연구하였다. ARE-luciferase 활성증가와 세포 보호효과를 동시에 나타내는 厚朴, 砂仁, 蘇葉가 Nrf2-ARE를 통한 세포 보호효과를 유도하는 HE의 핵심 구성 약재임을 확인하였다. 다른 연구그룹의 선행연구에서도 砂仁은 dimethylnitrosamine으로 유발된 아만성 간손상에서 고갈된 GSH, catalase, superoxide dismutase 등의 활성을 증가시켜 간 보호 효능을 나타냄을 보고하였으며28), 厚朴의 주요성분인 honokiol 및 magnolol은 Nrf2 활성화를 통한 항산화 효능이 보고된바 있다29).
- 5A). ARE-luciferase를 활용한 리포터 유전자분석 결과 厚朴, 砂仁, 蘇葉, 芍藥, 茯苓에서 무처치 대조세포와 비교하여 통계적으로 유의한 Nrf2 전사 활성화의 증가를 확인하였다 (Fig. 5A, left). 또한 단일 본초 추출물의 AA+iron으로 유발된 세포독성에 대한 보호효과를 확인하기 위하여 MTT assay를 수행한 결과砂仁, 生薑, 厚朴, 蘇葉, 白芍藥, 茯苓에서 통계적으로 유의한 세포 보호효과를 확인하였다 (Fig.
- 5B, left). HE와 op-HE 처치는 모두 무처치 대조세포와 비교하여 통계적으로 유의한 luciferase 활성의 증가를 나타내었으며, 두 군간의 통계적 차이는 확인되지 않았다. 또한 op-HE와 HE (30, 100 μg/mL)의 전처치는 모두 AA+iron으로부터 유발된 세포 독성에 대하여 세포 보호효과를 나타내었으며, 30 μg/mL에서는 op-HE가 HE에 비하여 우수한 효능을 나타내었으나 100 μg/mL에서는 op-HE와 HE간의 통계적 차이는 확인되지 않았다 (Fig.
- 6B). Hematoxylin-eosin 염색을 통한 간의 조직 형태학적 관찰 결과 (Fig. 6C), CCl4의 투여에 의하여 간실질의 변성 면적, 변성된 간세포의 수,침윤된 염증세포의 수가 통계적으로 유의하게 증가함을 확인하였다. op-HE에 의한 변성된 간세포의 수를 제외하고 HE 또는 op-HE의 투여는 CCl4에 의한 조직형태학적 변화들을 통계적으로 유의하게 억제하였다.
- HepG2 세포에서 6시간 동안의 100 μg/mL HE 처치는 무처치 대조세포와 비교하여 Nrf2의 인산화를 3.84±0.65배 통계적으로 유의하게 증가시켰다.
- 또한 厚朴의 유효성분인 honokiol은 간세포 내에서 liver kinase B1-AMPK 경로를 활성화 시키는 것이 보고된 바 있다25). 解肝煎의 세포 보호효능에 AMPK의 관련성을 규명하기 위하여 AMPK 화학적억제제인 compound C를 전처치한 후 HE, AA, iron을 처치하여 세포생존율을 관찰한 결과, HE의 AA+iron처치에 대한 세포 보호효능이 compound C 전처치에 의하여 변화되지 않았다 (data not shown). 따라서, HE의 세포 보호 과정에 AMPK의 활성화의 관련성은 적을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 도출된 厚朴, 砂仁, 蘇葉으로 구성된 解肝煎 최적방제 (op-HE)는 in vitro Nrf2 활성화 및 세포 보호 효능에 있어 解肝煎과 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 더불어 CCl4로 유도된 마우스 간손상 모델에서도 HE와 op-HE는 혈중 ALT, AST 활성도, 간조직 내 변성부위 및 변 간세포수, 침윤된 염증세포수, 콜라겐 침착 면적의 지표에서 모두 유의한 차이를 나타내지 않았다. 비록 본 연구에서 아쉽게도 解肝煎 최적방제에 포함되지 않은 본초들로 구성된 처방과의 효능 비교연구와 解肝煎 최적방제의 약물구성의 한의학적 원리를 검증하지 못하였으나, 방제의 약리작용점을 처방을 구성하는 약재에 적용하여 최적화하는 시도는 새로운 처방을 발굴할 수 있는 학문적접근법의 확대에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
- 더불어 HE (100 μg/mL) 처치에 의하여 Nrf2의 표적 유전자인 HO-1과 GCLC mRNA가 통계적으로 유의하게 증가됨을 확인하였다 (Fig. 4B).
- 조직형태학적 평가 지표에서의 HE와 op-HE 투여군간의 차이는 통계적으로 인정되지 않았다. 따라서 이상의 결과는 CCl4로 유발된 간 손상에 대하여 解肝煎 최적방제 op-HE가 解肝煎과 동등한 억제 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다.
- 4B). 따라서 이상의 결과는 HE가 Nrf2 활성화를 통하여 항산화효능을 가질 수 있음을 시사한다.
- 09 μM로 감소시켰으며, HE (100 μg/mL) 전처치는 GSH 함량을 무처치 대조세포 수준으로 회복시켰다. 따라서 이상의 결과는 HE가 세포 내 H2O2의 생성과 환원형 GSH의 고갈을 억제하여 항산화 효과를 나타냄을 시사한다.
- 본 연구실에서는 Nrf2 활성화를 통해 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호효능을 나타내는 淫羊藿, 皂角刺 등의 약재를 보고한 바 있으며17,18), 본 연구에서도 HE의 처치가 Nrf2의 인산화를 통하며, 리포터 유전자의 활성 증가 및 Nrf2 의존적 표적유전자들의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서, 이상의 결과는 HE가 Nrf2 활성화를 통하여 증가한 항산화 유전자가 산화적 스트레스에 대한 보호효능을 가질 수 있음을 나타낸다.
- op-HE에 의한 변성된 간세포의 수를 제외하고 HE 또는 op-HE의 투여는 CCl4에 의한 조직형태학적 변화들을 통계적으로 유의하게 억제하였다. 또한 Sirius red 염색을 통하여 간조직 내에 축적된 콜라겐의 양을 측정한 결과, CCl4에 의하여 축적된 콜라겐을 HE 또는 op-HE 투여군에서는 통계적으로 유의하게 감소됨을 확인하였다. 조직형태학적 평가 지표에서의 HE와 op-HE 투여군간의 차이는 통계적으로 인정되지 않았다.
- 또한 op-HE와 HE (30, 100 μg/mL)의 전처치는 모두 AA+iron으로부터 유발된 세포 독성에 대하여 세포 보호효과를 나타내었으며, 30 μg/mL에서는 op-HE가 HE에 비하여 우수한 효능을 나타내었으나 100 μg/mL에서는 op-HE와 HE간의 통계적 차이는 확인되지 않았다 (Fig. 5B, right).
- 5A, left). 또한 단일 본초 추출물의 AA+iron으로 유발된 세포독성에 대한 보호효과를 확인하기 위하여 MTT assay를 수행한 결과砂仁, 生薑, 厚朴, 蘇葉, 白芍藥, 茯苓에서 통계적으로 유의한 세포 보호효과를 확인하였다 (Fig. 5A, right). 이상의 解肝煎 구성 본초에 대한 ARE-luciferase를 통한 Nrf2 활성화 효과 및 MTT assay를 통한 세포보호효과 연구에서 공통적으로 통계적 유의성을 나타내는 5종의 구성 본초 중 문헌 연구를 통하여 Nrf2 이외의 세포신호전달 경로에 의존적인 간세포 보호효능이 규명된 본초와 解肝煎과 유사한 세포 보호효능을 나타내지 못하는 본초를 제외한 상위 3종인 厚朴, 砂仁, 蘇葉을 이용하여 解肝煎에 포함된 동량의 厚朴, 砂仁, 蘇葉로 解肝煎 최적방제 (op-HE)를 구성하였다 (Table 1).
- 간조직 내 흡수된 CCl4는 cytochrome P450에 의하여 대사되며, 생성된 CCl4 대사체는 지질과산화를 일으켜 산화적 스트레스 유도성간손상을 유발한다21). 본 실험에서 CCl4의 투여는 간손상의 지표인 혈중 ALT, AST 활성을 증가시켰으며, 조직형태학적 소견상 간실질 내 변성 면적 및 변성 간세포 수의 증가와 함께 염증세포 침윤을 증가시켰다. 본 연구에서 HE 및 op-HE가 CCl4로 유도된 ALT, AST의 상승 및 간조직 내의 손상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 AA+iron 병용처치를 이용하여 산화적 스트레스를 매개로 하는 간세포 독성에 대한 解肝煎의 세포 보호효과와 그 약리기전을 우선 연구하였다. 본 연구를 통하여 HE의 전처치가 AA+iron로 유발된 미토콘드리아 막의 기능장애와 그로 인해 활성화된 세포자멸사로부터 간세포 보호효과를 나타낼수 있음을 규명하였으며, HE는 AA+iron에 의한 세포내의 H2O2 생성과 GSH의 고갈을 억제할 수 있음을 확인하였다.
- 본 실험에서 CCl4의 투여는 간손상의 지표인 혈중 ALT, AST 활성을 증가시켰으며, 조직형태학적 소견상 간실질 내 변성 면적 및 변성 간세포 수의 증가와 함께 염증세포 침윤을 증가시켰다. 본 연구에서 HE 및 op-HE가 CCl4로 유도된 ALT, AST의 상승 및 간조직 내의 손상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 반복적 CCl4의 투여는 만성적 염증과 수복과정을 반복하여 간성상세포의 활성화를 통한 간섬유화를 유도한다22).
- 다른 연구그룹의 선행연구에서도 砂仁은 dimethylnitrosamine으로 유발된 아만성 간손상에서 고갈된 GSH, catalase, superoxide dismutase 등의 활성을 증가시켜 간 보호 효능을 나타냄을 보고하였으며28), 厚朴의 주요성분인 honokiol 및 magnolol은 Nrf2 활성화를 통한 항산화 효능이 보고된바 있다29). 본 연구에서 도출된 厚朴, 砂仁, 蘇葉으로 구성된 解肝煎 최적방제 (op-HE)는 in vitro Nrf2 활성화 및 세포 보호 효능에 있어 解肝煎과 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 더불어 CCl4로 유도된 마우스 간손상 모델에서도 HE와 op-HE는 혈중 ALT, AST 활성도, 간조직 내 변성부위 및 변 간세포수, 침윤된 염증세포수, 콜라겐 침착 면적의 지표에서 모두 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 1B). 예상하였던바와 같이, AA+iron의 처치는 PARP, caspase-3, bcl-2의 세포 내 발현을 감소시켜 세포자멸사를 유도하였음을 확인하였다. HE (100 μg/mL)의 전처치는 AA+iron의 처치에 의하여 감소된 PARP, caspase-3, bcl-2의 발현을 무처치 정상세포 수준으로 통계적으로 유의하게 회복시켰다.
- 84%로서 무처치 대조세포와 비교하여 유의미한 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과는 HE가 산화적 스트레스로부터 유발되는 미토콘드리아 막의 기능장애를 보호함으로써 세포 보호효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
- 5B, right). 이상의 결과는 약리활성 정보를 바탕으로 구성한 解肝煎 최적방제 op-HE가 解肝煎 추출물과 동등한 Nrf2 활성화를 통한 세포 보호효능을 in vitro 수준에서 나타낼 수 있음을 시사한다.
- HE (100 μg/mL)의 전처치는 AA+iron의 처치에 의하여 감소된 PARP, caspase-3, bcl-2의 발현을 무처치 정상세포 수준으로 통계적으로 유의하게 회복시켰다. 이상의 결과를 통하여 HE가 HepG2 세포에서 세포자멸사 억제를 통하여 세포 보호효과를 나타냄을 확인하였다.
후속연구
- 더불어 CCl4로 유도된 마우스 간손상 모델에서도 HE와 op-HE는 혈중 ALT, AST 활성도, 간조직 내 변성부위 및 변 간세포수, 침윤된 염증세포수, 콜라겐 침착 면적의 지표에서 모두 유의한 차이를 나타내지 않았다. 비록 본 연구에서 아쉽게도 解肝煎 최적방제에 포함되지 않은 본초들로 구성된 처방과의 효능 비교연구와 解肝煎 최적방제의 약물구성의 한의학적 원리를 검증하지 못하였으나, 방제의 약리작용점을 처방을 구성하는 약재에 적용하여 최적화하는 시도는 새로운 처방을 발굴할 수 있는 학문적접근법의 확대에 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 이상의 결과를 바탕으로 解肝煎 및 解肝煎 최적방제의 Nrf2 의존적 in vivo 효능의 검증과 더불어 Nrf2 활성화에 관여하는 상위 신호분자 규명 및 지표성분에 대한 후속 연구가 지속적으로 이루어진다면 급만성 간질환의 예방과 치료 소재로 解肝煎 및 解肝煎 최적방제를 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 HE 및 op-HE가 CCl4에 의해 증가된 간 실질 내 콜라겐 축적을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 이상의 결과는 HE 및 op-HE가 콜라젠 축적에 관여하는 간성상세포의 활성화를 억제할 수 있는 가능성을 시사하며 이에 대한 후속연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 비록 본 연구에서 아쉽게도 解肝煎 최적방제에 포함되지 않은 본초들로 구성된 처방과의 효능 비교연구와 解肝煎 최적방제의 약물구성의 한의학적 원리를 검증하지 못하였으나, 방제의 약리작용점을 처방을 구성하는 약재에 적용하여 최적화하는 시도는 새로운 처방을 발굴할 수 있는 학문적접근법의 확대에 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 이상의 결과를 바탕으로 解肝煎 및 解肝煎 최적방제의 Nrf2 의존적 in vivo 효능의 검증과 더불어 Nrf2 활성화에 관여하는 상위 신호분자 규명 및 지표성분에 대한 후속 연구가 지속적으로 이루어진다면 급만성 간질환의 예방과 치료 소재로 解肝煎 및 解肝煎 최적방제를 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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