Botrytis cinerea와 Colletotrichum acutatum에 항균활성을 갖는 점액세균 Sorangium cellulosum에 대한 아종 분류 및 길항 특성 연구 Subspecies Classifying and Characterizing the Two Groups of Antagonistic Sorangium cellulosum against Botrytis cinerea and Colletotrichum acutatum원문보기
섬유소 분해 점액세균인 Sorangium cellulosum 균주들 중 Botrytis cinerea에 길항력을 갖는다고 보고한 4균주(Antagonistic to Botrytis, AB 계열)와 Colletotrichum acutatum에 길항력을 갖는다고 보고한 2균주(Antagonistic to Colletotrichum, AC 계열)를 5가지(A-E)의 S. cellulosum 아종(subspecies)으로 분류하였다. 분류 기준 유전자인 xynB1, bglA2, groEL1 세 유전자의 유전자 유무 및 염기서열 분석을 통해 AB 계열은 아종 C, AC 계열은 아종 D로 분류하였다. 또한, 배양추출물을 고효율 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석한 아종 분류 결과 AB 계열 4균주는 머무름시간 20-22.5분에 유사한 특징 피크가 나타난 반면, AC 계열인 2균주는 특징 피크가 없으므로 AB 계열은 아종 C, AC 계열은 아종 D임을 재확인하였다. AB 계열 4균주들의 배양여액을 사용하여 방울토마토에 전처리 후 B. cinerea를 접종한 생물검정으로 방제가와 크로마토그램 특징 피크의 상대 면적값과의 상관분석 결과, 피크 면적이 큰 균주일수록 방제가도 높은 양의 상관관계($R^2=0.9652$)를 확인하였다. 아종 분류 결과 AB 계열은 아종 C의 대표 생리활성 물질의 파생물인 epothilone D로 추정되어, 이를 표준시료로 HPLC 분석한 결과 epothilone D의 머무름시간은 9.9분이었던 반면, KYC 3270 특성 피크의 머무름시간은 11.581분으로 달랐다. 따라서 우리는 AB 계열이 분비하는 생리활성 물질은 epothilone의 파생물인 7-ketone epothilone D로 추정하였다.
섬유소 분해 점액세균인 Sorangium cellulosum 균주들 중 Botrytis cinerea에 길항력을 갖는다고 보고한 4균주(Antagonistic to Botrytis, AB 계열)와 Colletotrichum acutatum에 길항력을 갖는다고 보고한 2균주(Antagonistic to Colletotrichum, AC 계열)를 5가지(A-E)의 S. cellulosum 아종(subspecies)으로 분류하였다. 분류 기준 유전자인 xynB1, bglA2, groEL1 세 유전자의 유전자 유무 및 염기서열 분석을 통해 AB 계열은 아종 C, AC 계열은 아종 D로 분류하였다. 또한, 배양추출물을 고효율 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석한 아종 분류 결과 AB 계열 4균주는 머무름시간 20-22.5분에 유사한 특징 피크가 나타난 반면, AC 계열인 2균주는 특징 피크가 없으므로 AB 계열은 아종 C, AC 계열은 아종 D임을 재확인하였다. AB 계열 4균주들의 배양여액을 사용하여 방울토마토에 전처리 후 B. cinerea를 접종한 생물검정으로 방제가와 크로마토그램 특징 피크의 상대 면적값과의 상관분석 결과, 피크 면적이 큰 균주일수록 방제가도 높은 양의 상관관계($R^2=0.9652$)를 확인하였다. 아종 분류 결과 AB 계열은 아종 C의 대표 생리활성 물질의 파생물인 epothilone D로 추정되어, 이를 표준시료로 HPLC 분석한 결과 epothilone D의 머무름시간은 9.9분이었던 반면, KYC 3270 특성 피크의 머무름시간은 11.581분으로 달랐다. 따라서 우리는 AB 계열이 분비하는 생리활성 물질은 epothilone의 파생물인 7-ketone epothilone D로 추정하였다.
We classified the previously reported antagonistic strains of Sorangium cellulosum into 5 subspecies (A-E). Four strains were antagonistic to Botrytis cinerea (AB group) and two strains were antagonistic to Colletotrichum acutatum (AC group). According to the genetic and sequential analyses with sta...
We classified the previously reported antagonistic strains of Sorangium cellulosum into 5 subspecies (A-E). Four strains were antagonistic to Botrytis cinerea (AB group) and two strains were antagonistic to Colletotrichum acutatum (AC group). According to the genetic and sequential analyses with standard genes, xynB1, bglA2, groEL1 for grouping, all strains of AB group were belonged to subspecies C and all strains of AC group were belonged to subspecies D. In addition, high pressure liquid chromatography with the culture filtrates confirmed the genetic results, because AB group had peaks with retention time at 20-22.5 minutes, whereas AC group had no peak. There was positive relationship ($R^2=0.9652$) between the control values of infecting B. cinerea on cherry tomatoes and the main peak areas of chromatograms among the four isolates of AB group. From the subspecies results of AB group, the main peak of KYC 3270 was expected to be epothilone D. However the retention times of the standard of commercial epothilone D and the main peak of KYC 3270 culture filtrate were different as 9.9 and 11.581 min., respectively. Finally, the antagonistic metabolite of AB group was inferred as 7-ketone epothilone D.
We classified the previously reported antagonistic strains of Sorangium cellulosum into 5 subspecies (A-E). Four strains were antagonistic to Botrytis cinerea (AB group) and two strains were antagonistic to Colletotrichum acutatum (AC group). According to the genetic and sequential analyses with standard genes, xynB1, bglA2, groEL1 for grouping, all strains of AB group were belonged to subspecies C and all strains of AC group were belonged to subspecies D. In addition, high pressure liquid chromatography with the culture filtrates confirmed the genetic results, because AB group had peaks with retention time at 20-22.5 minutes, whereas AC group had no peak. There was positive relationship ($R^2=0.9652$) between the control values of infecting B. cinerea on cherry tomatoes and the main peak areas of chromatograms among the four isolates of AB group. From the subspecies results of AB group, the main peak of KYC 3270 was expected to be epothilone D. However the retention times of the standard of commercial epothilone D and the main peak of KYC 3270 culture filtrate were different as 9.9 and 11.581 min., respectively. Finally, the antagonistic metabolite of AB group was inferred as 7-ketone epothilone D.
cellulosum을 유전학적 및 분석화학적 방법으로 아종 분류하여 두 계열의 차이를 구명하고자 한다. 또한 아종 분류를 위한 HPLC 크로마토그램의 특성 피크를 정량하여 식물 병원균에 대한 방제가와 상관분석을 통해 피크에 나타나는 물질이 길항력과 관련되는지 확인하고자 한다. 마지막으로 AB 계열의 점액세균이 분비하는 B.
또한 아종 분류를 위한 HPLC 크로마토그램의 특성 피크를 정량하여 식물 병원균에 대한 방제가와 상관분석을 통해 피크에 나타나는 물질이 길항력과 관련되는지 확인하고자 한다. 마지막으로 AB 계열의 점액세균이 분비하는 B. cinerea 길항 물질 동정을 위해, 아종 분류를 위한 HPLC 크로마토그램의 특성 피크로부터 추론된 epothilone D를 표준시료로 활용하여 AB 계열의 길항 특성을 구명하고자 한다.
본 연구는 선행 섬유소 분해 아종 분류 연구에서는 수행되지 않은 잿빛곰팡이 병원균에 길항력을 갖는 AB 계열 네 균주와 고추 탄저병에 길항력을 갖는 AC 계열 두 균주의 S. cellulosum을 유전학적 및 분석화학적 방법으로 아종 분류하여 두 계열의 차이를 구명하고자 한다. 또한 아종 분류를 위한 HPLC 크로마토그램의 특성 피크를 정량하여 식물 병원균에 대한 방제가와 상관분석을 통해 피크에 나타나는 물질이 길항력과 관련되는지 확인하고자 한다.
제안 방법
아종 분석 결과 대표 생리활성물질로 추정된 epothilone D (PMID 268909, Sigma-Aldrich, USA)를 시중에서 구하고 표준시료로 정해 메탄올 1 ml에 1,000배 희석 후 zorbax C-18 컬럼을 사용하여 HPLC 크로마토그램에서 특성 피크를 얻었다. 2차 대사산물을 동정하기 위한 용매 체계는 아종분류를 위한 용매 체계를 약간 변형하여 분석시간을 15분으로 단축하고 용매 A 와 B의 비율을 변경하여 진행하였다(Kern 등, 2015).
대상 데이터
병원균 및 점액 세균 배양.
잿빛곰팡이 병원균인 B. cinereal (No. 43528)는 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection: KACC)로부터 분양받았고, 고추 탄저병원균인 C. acuatum SWS은 수원 고추포장에서 2000년 초에 분리하였다. 두 병원균은 감자한천배지에서 25ºC로 7일간 배양한 후 얻은 포자를 1×105 conidia/ml 농도의 현탁액으로 만들어 실험에 사용하였다.
데이터처리
각 처리 당 방울토마토 4개, 딸기 10개의 과실을 사용하였으며, 실험은 총 4회 반복하였다. 각 균주별 방제가(control value)와 특징 피크 상대 면적값을 이변량 변수(x, y)로 만들어 점도표를 작성한 후, 이를 선형 회귀분석하였다.
이론/모형
6가지 길항 균주들의 아종 분류를 위한 DNA 추출, 프라이머 제작과 PCR 조건은 Lee 등(2013)의 아종 분류 실험방법에 따라 수행하였다. 염기서열 분석은 MacrogenⓇ에 의뢰하였다.
길항균 배양 여액들을 이용하여 B. cinerea에 대한 방제가를 얻기 위한 생물검정 실험은 Kim과 Yun (2011)에서 KYC 3270을 선발했던 방법과 같은 방법을 사용했다. 방울토마토와 딸기 과실을 접종 24시간 전 70% 에탄올과 멸균수로 표면 살균한 후, 각 처리 당 배양 여액 10 ml을 분무하여 준비하였으며, positive control은 시판농약인 fludioxonil(사파이어, Syngenta, China, a.
선발한 길항균 배양 추출물 1 ml을 사용하여 아종 분류의 특성 피크를 얻기 위한 크로마토그램 분석은 Lee 등(2013)이 실시한 S. cellulosum 아종 분류를 위한 용매체계(solvent system)를 사용하였다. 고효능액체크로마토그래피 기기(Shimazu HPLC 2300, Japan)와 컬럼 Agilent zorbax C-18 (Agilent, USA)을 이용하여 배양 추출물 1개 당 50분 동안 분석하였다.
성능/효과
결론적으로, 잿빛곰팡이를 길항하는 AB 계열의 4가지 대표 균주들은 S. cellulosum 아종 C로, 탄저병을 길항하는 AC 계열 2가지 대표 균주들은 S. cellulosum 아종 D로 분류되었으므로 두 계열은 각각 다른 아종이었고, 길항 기작의 차이는 다른 종류의 생리활성 물질을 분비하기 때문인 것으로 추정된다. 유전자 분석 결과 AB, AC 계열 S.
본 연구결과 AB 계열 S. cellulosum 4 균주 KYC 3130, 3247, 3248, 3270 네 균주 모두는 아종 C의 특성 피크를 갖으며 7-ketone epothilone D로 추정되는 생리활성물질을 분비하였다. 따라서 우리가 스크리닝한 318균주의 섬유소 분해 점액 세균으로부터 잿빛곰팡이에 길항력을 보인 79균주 중 탄저병 및 다른 식물병원균에 길항력이 없고 오직 잿빛곰팡이에만 길항력을 보이는 72균주의 대부분은 아종 C로 추정된다.
후속연구
KYC 3262 배양여액 처리구의 방제가는 3년간 각각 31%, 89%, 82%였으며, 화학 농약인 dithianon 방제가는 각각 19%, 97%, 91%여서 배양여액의 방제가는 화학농약 대비 10%에 버금가는 차이를 보여 생물 농약의 가능성을 보여주었다(Yun, 2014). 비록, 본 연구에서는 HPLC 화학분석 방법으로 AC 계열의 특성 피크를 얻지 못하였지만, 아종 D의 대표 생리활성 물질은 ambruticin일 가능성이 높으므로(Lee 등, 2013), 향후 연구에서는 AC 계열 균주가 분비하는 ambruticin의 정량분석 연구를 통해 생리활성 물질을 규명하는 연구를 수행하는 것이 합리적이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
아종 C의 특징은?
아종 C는 spirangien과 epothilone 두 가지 생리활성물질을 생산하며, 이들은 epothilone을 생산하는 epoA 유전자와 spirangien을 생산하는 spiG 유전자를 갖는다(Lee 등, 2013). 두 대표 생리활성 물질은 정성적 차이에 의하여 각각 spirangien A-G, epothilone A-K 유도체를 갖는데 머무름시간은 물질마다 각각 다르다(Frank 등, 2007; Kern 등, 2015).
섬유소 분해성 점액세균의 아종 분류를 위한 기준 유전자는?
섬유소 분해성 점액세균은 유전적 특성에 따라 크게 5가지 아종(subspecies A-E)으로 분류한다(Lee 등, 2013). 아종 분류를 위한 세 가지 기준 유전자는 groEL1, xynB1, bglA2 (Jiang 등, 2008)이며, 유전자 유무에 따라 groEL1 유전자만 결손된 것을 아종 A, xynB1 유전자만 결손된 것을 아종 E, 세 유전자가 모두 존재하면 아종 B, C, D 중 하나로 분류한다. 아종 B, C, D 분류는 groEL1, xynB1 염기서열 분석을 통해 전형적인 타입 균주들과의 유사성을 분석하여 최종 분류한다.
섬유소 분해 점액세균이란 무엇인가?
생물적 방제를 위한 후보 길항균 중 하나인 섬유소 분해 점액세균 Sorangium cellulosum은 독특하고 다양한 항진균 물질을 분비하는 그람 음성 세균이다. Kim과 Yun (2011)은 Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Pyricularia grisea, Penicillium sp.
참고문헌 (12)
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