유재묘
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
강윤환
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
김보미
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
김동희
(National Development Institute of Korean Medicine)
,
박태순
(National Development Institute of Korean Medicine)
맥문동탕 열수추출물의 용매분획물을 이용하여 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase, tyrosinase 억제 효과를 검증하였고 그 결과 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)에서 가장 우수한 저해활성을 보여주었다. 세포를 이용한 활성 검증에서는 MW-EA를 처리하였을 때 ROS 저해활성에서 34% ($100{\mu}g/mL$), MMPs 저해 50% ($100{\mu}g/mL$) 이상, 미백 활성에서는 tyrosinase를 25% ($50{\mu}g/mL$) 억제하는 것을 확인 하였다. 따라서 맥문동탕은 피부개선 소재로서 개발 가능성이 높다고 사료된다.
맥문동탕 열수추출물의 용매분획물을 이용하여 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase, tyrosinase 억제 효과를 검증하였고 그 결과 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)에서 가장 우수한 저해활성을 보여주었다. 세포를 이용한 활성 검증에서는 MW-EA를 처리하였을 때 ROS 저해활성에서 34% ($100{\mu}g/mL$), MMPs 저해 50% ($100{\mu}g/mL$) 이상, 미백 활성에서는 tyrosinase를 25% ($50{\mu}g/mL$) 억제하는 것을 확인 하였다. 따라서 맥문동탕은 피부개선 소재로서 개발 가능성이 높다고 사료된다.
In this study, we verified the 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase, tyrosinase inhibitory effect by using the solvent fractions of Maekmoondong-tang hot water extract. As a result, the ethyl acetate fractio...
In this study, we verified the 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase, tyrosinase inhibitory effect by using the solvent fractions of Maekmoondong-tang hot water extract. As a result, the ethyl acetate fraction (MW-EA) showed the highest inhibitory activity. In cell-based assays, MW-EA treatment confirmed a 34% ($100{\mu}g/mL$) efficacy in reactive oxygen species inhibitory activity, and at the same concentration, MMPs showed more than 50% inhibition and tyrosinase inhibited 25% ($50{\mu}g/mL$). Therefore Maekmoondong-tang is considered high development potential as a material to improve the skin.
In this study, we verified the 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase, tyrosinase inhibitory effect by using the solvent fractions of Maekmoondong-tang hot water extract. As a result, the ethyl acetate fraction (MW-EA) showed the highest inhibitory activity. In cell-based assays, MW-EA treatment confirmed a 34% ($100{\mu}g/mL$) efficacy in reactive oxygen species inhibitory activity, and at the same concentration, MMPs showed more than 50% inhibition and tyrosinase inhibited 25% ($50{\mu}g/mL$). Therefore Maekmoondong-tang is considered high development potential as a material to improve the skin.
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문제 정의
맥문동탕은 맥문동(麥門冬), 진피(陳皮), 반하(半夏), 백출(白朮), 복령(茯 ), 소맥(小麥), 인삼(人蔘), 감초(甘草), 오매(烏梅), 생강 (生薑) 총 10가지 약재로 구성되어 있으며, 보고된 연구결과로는 폐활량 개선에 미치는 영향[13], 알레르기 천식[14], 호흡기 점액 생성 및 분비[15], 항암 및 항전이 효능[16] 등이 있는데, 항산화, 주름억제, 미백효과 등에 대한 연구는 진행된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 맥문동탕의 신규 적응증 발굴을 위해 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 용매 분획물을 이용하여 검증하였다.
본 연구를 통해 맥문동탕의 피부개선효과를 검증함으로써 한방 처방을 이용한 피부개선 천연 소재의 개발 가능성을 확인하였다.
제안 방법
CCD-986sk cell에 MW-EA를 처리하여 주름 형성에 작용하는 것으로 알려진 MMP-1, -2, -9, -13에 대한 단백질의 발현을 확인하였다. MW-EA는 6.
CCD-986sk cell을 이용하여 MW-EA를 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하였고 아무처리도 하지 않은 대조군과 비교하였을 때 100 μg/mL에서 87.8%의 합성율을 보여주었다(Fig. 3B).
DPPH, ABTS radical 소거능 측정과 ROS-GloTM H2O2 assay kit를 이용한 ROS 생성량 측정을 통해서 맥문동탕 열수추출물의 헥산(MW-H), 에틸아세테이트(MW-EA), 부탄올(MW-B), 물(MW-W) 분획물의 항산화 효과를 확인하였다. DPPH radical 소거능 측정에서 MW-EA가 가장 우수한 효과를 나타냈는데 100, 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 76, 96%로 확인되었다(Fig.
Elastase 억제활성 측정에서 가장 우수한 MW-EA를 이용해서 procollagen type-I C peptide 생성량 확인 및 광노화 유도 인자인 MMPs에 대해서 western blot을 실시하였다. Procollagen 은 collagen의 전구체이고 이것을 측정하기 위해 c-말단을 인지하는 항체를 이용하여 생성량을 측정하는 방법으로 확인하였다.
PVDF membrane에 transfer하는 과정과 primary&secondary antibody를 반응시키는 것을 통해 결과를 측정하였다.
Elastase 억제활성 측정에서 가장 우수한 MW-EA를 이용해서 procollagen type-I C peptide 생성량 확인 및 광노화 유도 인자인 MMPs에 대해서 western blot을 실시하였다. Procollagen 은 collagen의 전구체이고 이것을 측정하기 위해 c-말단을 인지하는 항체를 이용하여 생성량을 측정하는 방법으로 확인하였다. CCD-986sk cell을 이용하여 MW-EA를 6.
PVDF membrane에 transfer하는 과정과 primary&secondary antibody를 반응시키는 것을 통해 결과를 측정하였다. 결과는 ImageQuant LAS-4000 (GE life sciences, Taipei, Taiwan)를 사용하여 수치화 하였다.
또한 세포 실험을 위해 CCD-986sk cell에서 시료의 세포 독성을 검증하였고, 그 결과 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 2C).
맥문동탕 시료 제조는 맥문동(麥門冬) 8 g, 진피(陳皮), 반하(半 夏), 백출(白朮), 복령(茯 ), 소맥(小麥)을 각각 4 g, 인삼(人蔘), 감초(甘草), 생강(生薑)을 각각 2 g, 오매(烏梅) 1개 준비하는 것을 1회 분량으로 하였다. 여기에 10배의 물을 넣고 3시간씩 추출하는 방법으로 3회 반복하였다.
맥문동탕 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)이 포함하고 있는 hesperidin과 narirutin의 함량을 확인하기 위해 Table 1의 조건에서 분석을 수행하였다. HPLC 분석에 사용된 칼럼 및 장비는 YMC Triart C18 (4.
맥문동탕의 미백 효과는 tyrosinase 억제활성과 western blot을 통해 미백관련 인자의 발현 확인으로 검증하였다. 맥문동탕 분획물의 tyrosinase 저해효과는 MW-EA, MW-H, MW-B, MWW의 순서로 우수하였으며 1,000 μg/mL의 농도에서 각 각 65, 23, 13, 9%로 나타났다(Fig.
맥문동탕의 주름억제 효능을 검증하기 위해 elastase 억제활성을 측정하였다. 시료는 MW-H, MW-EA, MW-B, MW-W로 측정하였으며 MW-EA가 10, 100, 1,000 μg/mL의 농도에서 10, 21, 43%의 효과로 가장 우수한 저해효과를 나타내었다(Fig.
세포를 이용한 항산화 활성 검증은 ROS-GloTM H2O2 assay kit로 측정하였으며 앞서 DPPH, ABTS radical 소거능에서 가장 저해효과가 우수한 MW-EA를 처리하여 확인하였다. 또한 세포 실험을 위해 CCD-986sk cell에서 시료의 세포 독성을 검증하였고, 그 결과 6.
시료의 세포 독성을 확인하기 위해 96 well plate에 CCD-986sk와 HEM 세포를 1×104 , 3×104 cells/well로 분주하고 24시간동안 안정화시켰다.
반면에 도인승기탕은 동일한 농도에서 MITF는 20%, tyrosinase 는 13%, TRP-1은 12%, TRP-2는 15%의 억제효과를 보여주었다[30]. 이 결과들을 통해 MW-EA의 미백 활성을 확인하였다.
Procollagen type-I 생합성 측정은 96 well plate에 CCD-986sk cell을 1×104 cells/well로 분주하여 UV-B (20 mJ/cm2)와 TNF-α (10 ng/mL)를 처리한 후 48시간 배양하였다. 이것의 상등액을 취하여 propeptide의 양을 측정하였다.
(Santa cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 주름 개선활성 측정을 위해 procollagen type I Cpeptide kit (Takara Shuzo, Kyoto, Japan), 항산화활성 측정은 ROS-GloTM H2O2 assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 구입하였다.
그후 UV-B (20 mJ/cm2), TNF-α (10 ng/mL) 또는 forskolin (1 nM) 을 시료와 함께 48시간 동안 배양하였다. 처리된 세포를 lysis buffer로 모은후 bradford assay를 통해 정량하였으며 10% SDS-PAGE로 전기영동 하였다. PVDF membrane에 transfer하는 과정과 primary&secondary antibody를 반응시키는 것을 통해 결과를 측정하였다.
항산화 활성 검증은 DPPH radical scavenging[18]과 ABTS radical scavenging[19] 그리고 ROS-GloTM H2O2 assay kit를 사용하여 측정하였다. ROS 생성량 측정의 경우 96 well plate 에 CCD-986sk cell을 1×104 cells/well의 양으로 분주하여 시료를 처리하고 ROS 발생양을 microplate reader로 측정하였다.
6%로 확인되었다. 확보된 추출물 중 10 g으로 용매분획법을 통해 n-hexane (0.35 g), ethyl acetate (0.29 g), butanol (1.42 g) water (7.74 g) 분획물을 확보하였다.
대상 데이터
HPLC 분석에 사용된 칼럼 및 장비는 YMC Triart C18 (4.6×250 mm, I.D. 5 μm, YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)과 Agilent 1260 Infinity (Agilent, Folsom, CA, USA)를 사용하였다.
(Grand Island, New York, USA)에서 구입하였으며, 주름억제 활성 측정을 위한 시약으로 위한 human tumor necrosis factor-α with carrier, sterile (TNF-α)를 Cell Signaling사(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, 미백활성 검증에는 forskolin (Sigma)을 사용하였다. Primary antibody 및 secondary antibody는 Santa cruz biotechnology Inc. (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 주름 개선활성 측정을 위해 procollagen type I Cpeptide kit (Takara Shuzo, Kyoto, Japan), 항산화활성 측정은 ROS-GloTM H2O2 assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 구입하였다.
미백 활성은 mushroom tyrosinase (110 U/mL)를 사용하여 측정하였다. 0.
본 연구에서 사용한 효능 측정 시약은 n-succinyl-(L-Ala) 3 -pnitroanilide, collagenase from Clostridium histolyticum, potassium persulfate, L-ascorbic acid, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (LDOPA), 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)를 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 맥문동탕의 구성약재는 2016년 2월 (주)휴먼허브(Gyeongsan-si, Korea) 에서 구입하여 실험에 사용하였다.
1과 같았다. 본 연구에서는 지표성분(hesperidin, narirutin)의 함량과 성분 profile pathern이 확인된 MW-EA를 주요 시험 시료로 이용하였다.
세포 배양을 위한 시약으로는 penicillin/streptomycin, fetal bovine serum (FBS), dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)을 gibco BRL Co. (Grand Island, New York, USA)에서 구입하였으며, 주름억제 활성 측정을 위한 시약으로 위한 human tumor necrosis factor-α with carrier, sterile (TNF-α)를 Cell Signaling사(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, 미백활성 검증에는 forskolin (Sigma)을 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 맥문동탕의 구성약재는 2016년 2월 (주)휴먼허브(Gyeongsan-si, Korea) 에서 구입하여 실험에 사용하였다. 지표성분의 경우 hesperidin (Sigma)에서 구입하였으며 narirutin은 한약진흥재단 천연물 물질은행에서 분양받아서 사용하였다. 세포 배양을 위한 시약으로는 penicillin/streptomycin, fetal bovine serum (FBS), dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)을 gibco BRL Co.
데이터처리
SPSS 10.0으로 통계처리 하였으며, t-test를 통해 유의수준 p < 0.05에서 분산분석(ANOVA: analysis of variance)으로 검증하였다.
이론/모형
시료의 standard 물질 함량에 대한 분석은 ‘의약품 등 분석법의 벨리데이션 가이드라인(식품의약품안전처)’을 참고하여 수행하였다.
성능/효과
ABTS radical 소거능에서는 MW-EA, MW-B, MW-W, MWH의 순서로 저해활성이 높았으며 MW-EA의 경우 100, 1,000 μg/mL에서 각각 92, 96%의 억제효과를 보여주었다(Fig. 2B).
DPPH radical 소거능 측정에서 MW-EA가 가장 우수한 효과를 나타냈는데 100, 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 76, 96%로 확인되었다(Fig. 2A).
MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2에 대한 저해 효과는 50 μg/ mL의 농도에서 각 각 10, 25, 6, 12%로 나타났다(Fig. 6B-E).
Standard 물질을 이용한 calibration curve를 통해 hesperidin은 MW-EA 1,000 μg 당 16.480±0.636 μg을 포함하고 있고, narirutin의 경우 12.535± 0.301 μg을 포함하는 것을 알 수 있었다.
따라서 6.25-100 μg/mL 의 농도에서 ROS 저해활성을 검증하였으며 그 결과 50, 100 μg/mL의 농도에서 약 17, 34%의 억제활성을 확인하였다(Fig. 2D).
맥문동탕 분획물의 tyrosinase 저해효과는 MW-EA, MW-H, MW-B, MWW의 순서로 우수하였으며 1,000 μg/mL의 농도에서 각 각 65, 23, 13, 9%로 나타났다(Fig. 5).
기존 연구에서는 참깨 에탄올 추출물이 동일한 농도에서 MMP-1 protein의 발현을 약 40% 억제하였다는 보고가 있다[27]. 이 결과들을 통해 MW-EA의 주름 억제 효능을 예측할수 있었다.
여기에 10배의 물을 넣고 3시간씩 추출하는 방법으로 3회 반복하였다. 이 방법으로 3회 추출하고 (111 g) 시료 37.28 g을 얻었으며 수율은 33.6%로 확인되었다. 확보된 추출물 중 10 g으로 용매분획법을 통해 n-hexane (0.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
UV에 의해 유발되는 피부노화란?
UV에 의해 유발되는 피부노화는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 인한 세포막 손상으로 최종적으로는 피부세 포의 기능을 상실하여 주름을 야기시킨다. 그리고 콜라겐과 matrix metalloproteinase (MMP) expression의 기본 메커니즘을 확인하는 것 또한 중요한데, 이에 대한 피부의 초기 반응 중 하나는 epidermal growth factor receptor와 tumor necrosis factor (TNF)-α receptor와 같은 세포 표면에 발현되는 성장 인자 및 사이토카인 수용체의 활성화를 들 수 있다[5].
임상을 통해서 알 수 있는 자외선이 사람의 피부에 미치는 영향은?
자외선(UV)은 피부에 많은 영향을 미치는데 염증, 피부암 및 피부 노화(광노화)를 유발할 수 있다[1,2]. 임상에서 노화로 인한 피부는 미세하고 거친 주름, 색소 침착 및 모세 혈관 확장 등으로 확인할 수 있고, 생물학적으로 봤을 때는 콜라겐 발현을 억제하는 것을 특징적인 것으로 볼 수 있다[3]. UV에 의한 노화의 경우 프로콜라겐 합성 감소 및 콜라겐의 분해 등으로 인해 노화가 일어난다[4].
맥문동탕의 구성은?
맥문동탕은 맥문동(麥門冬), 진피(陳皮), 반하(半夏), 백출(白朮), 복령(茯 ), 소맥(小麥), 인삼(人蔘), 감초(甘草), 오매(烏梅), 생강 (生薑) 총 10가지 약재로 구성되어 있으며, 보고된 연구결과로는 폐활량 개선에 미치는 영향[13], 알레르기 천식[14], 호흡기 점액 생성 및 분비[15], 항암 및 항전이 효능[16] 등이 있는데, 항산화, 주름억제, 미백효과 등에 대한 연구는 진행된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 맥문동탕의 신규 적응증 발굴을 위해 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 용매 분획물을 이용하여 검증하였다.
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