[논문]남극 로스해에서 분리한 Croceibacter atlanticus균 유래 리파아제의 생산, 고정화, 효소특성 연구

박채경; 김형권

doi:10.4014/mbl.1804.04012

남극 로스해에서 분리한 Croceibacter atlanticus균 유래 리파아제의 생산, 고정화, 효소특성 연구
Production, Immobilization, and Characterization of Croceibacter atlanticus Lipase Isolated from the Antarctic Ross Sea 원문보기

Microbiology and biotechnology letters = 한국미생물·생명공학회지, v.46 no.3, 2018년, pp.234 - 243

초록
AI-Helper

남극해에는 산업적으로 유용한 신규 효소촉매를 생산하는 미생물들이 들어 있다. 우리는 로스해(Ross Sea)로부터 분리한 여러 저온성 박테리아를 조사하였으며, 그 중에서 지방분해 능력이 뛰어난 Croceibacter atlanticus (No. 40-F12)를 찾았다. Shotgun 클로닝 방법으로 리파아제 유전자(lipCA)를 찾았으며 Escherichia coli 균에서 LipCA 효소를 발현하였다. Spain Arreo metagenome alpha/beta hydrolase를 기준으로 LipCA 상동구조모델을 만들어서 분석한 결과, ${\alpha}/{\beta}$ hydrolase fold, Gly-X-Ser-X-Gly motif, 그리고 lid 구조를 갖고 있기 때문에 전형적인 리파아제 효소임이 밝혀졌다. Ammonium sulfate 침전법과 겔여과 크로마토그래피를 통해서 세포추출액으로부터 LipCA 효소를 순수하게 분리한 후, 최적 온도, pH, 안정성, 기질특이성, 유기용매 안정성 등의 효소특성을 규명하였다. LipCA를 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법으로 고정화하고 효소특성을 조사, 비교하였다. 고정화를 통해 온도, pH, 유기용매에 대한 안정성이 증가하였고 기질특이성의 변화는 관찰되지 않았다. $LipCA^{CLEA}$는 원심분리 방법으로 쉽게 회수되었고 4번의 재사용 후에 40% 이상의 활성이 잔재하였다. 이 논문은 C. atlanticus 리파아제의 발현, 특성규명, Cross-linked Enzyme Aggregated 고정화를 바탕으로 안정성을 높여 산업적 활용 가능성을 제시한 최초의 보고이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The Antarctic Ocean contains numerous microorganisms that produce novel biocatalysts that can have applications in various industries. We screened various psychrophilic bacterial strains isolated from the Ross Sea and found that a Croceibacter atlanticus strain (Stock No. 40-F12) showed high lipolytic activity on a tributyrin plate. We isolated the corresponding lipase gene (lipCA) by shotgun cloning and expressed the LipCA enzyme in Escherichia coli cells. Homology modeling of LipCA was carried out using the Spain Arreo lake metagenome alpha/beta hydrolase as a template. According to the model, LipCA has an ${\alpha}/{\beta}$ hydrolase fold, Gly-X-Ser-X-Glymotif, and lid sequence, indicating that LipCA is a typical lipase enzyme. Active LipCA enzyme was purified fromthe cell-free extract by ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. We determined its enzymatic properties including optimum temperature and pH, stability, substrate specificity, and organic solvent stability. LipCA was immobilized by the cross-linked enzyme aggregate (CLEA) method and its enzymatic properties were compared to those of free LipCA. After cross-linking, temperature, pH, and organic solvent stability increased considerably, whereas substrate specificities did not changed. The LipCA CLEA was recovered by centrifugation and showed approximately 40% activity after 4th recovery. This is the first report of the expression, characterization, and immobilization of a C. atlanticus lipase, and this lipase could have potential industrial application.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

즉, 효소의 활성부위 유연성이 떨어지는 현상과 함께 구조 변성이 동시에 진행되는 것으로 추정된다[7, 8, 19]. 따라서 본 연구에서는 활성이 가장 높은 25 mM 농도의 glutaraldehyde로 만든 LipCA^CLEA를 사용하여 특성연구를 수행하였다.
atlanticus 균과 Alcanivorax 균이 동일한 리파아제 효소 유전자를 가지고 있다는 사실은 매우 흥미로운 일이며 남극의 동일 환경에서 사는 균들간에 gene transfer가 진행됐을 가능성을 보여준다. 아직까지 C. atlanticus 균으로부터 리파아제가 보고되지 않았고, Alcanivorax putative hydrolase에 대한 연구가 전혀 진행되지 않았기 때문에 본 연구팀은 LipCA 효소를 대량 생산하고 특성규명 연구를 진행하였다.
LipCA^CLEA는 원심분리 방법으로 쉽게 회수되었고 4번의 재사용 후에 40% 이상의 활성이 잔재하였다. 이 논문은 C.atlanticus 리파아제의 발현, 특성규명, Cross-linked Enzyme Aggregated 고정화를 바탕으로 안정성을 높여 산업적 활용 가능성을 제시한 최초의 보고이다.
40-F12 균으로부터 shotgun cloning 방법을 통해 리파아제 유전자(lipCA)를 찾고 Escherichia coli에서 대량 생산하였다. 현재까지 C.atlanticus 균으로부터 리파아제 효소의 분리 및 특성 규명에 대한 보고가 전혀 없기 때문에 LipCA의 특성을 규명하고 고정화함으로써 산업적으로 이용할 수 있는 가능성을 알아보았다.

제안 방법

514F; 5'-CGT GCC AGC AGC CGC GGT-3', 1542R; 5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAC CC-3'. 16s rRNA의 부분 염기 서열 분석과 데이터베이스 검색은 DNAStar 프로그램과 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST 프로그램을 이용하였다.
Spain Arreo metagenome alpha/beta hydrolase를 기준으로 LipCA 상동구조모델을 만들어서 분석한 결과, α/β hydrolase fold, Gly-X-Ser-X-Gly motif, 그리고 lid 구조를 갖고 있기 때문에 전형적인 리파아제 효소임이 밝혀졌다. Ammonium sulfate 침전법과 겔여과 크로마토그래피를 통해서 세포추출액으로부터 LipCA 효소를 순수하게 분리한 후, 최적 온도, pH, 안정성, 기질특이성, 유기용매 안정성 등의 효소특성을 규명하였다. LipCA를 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법으로 고정화하고 효소특성을 조사, 비교하였다.
C. atlanticus (Stock No. 40-F12)의 genomic DNA을 514F, 1542R primer를 이용하여 16s rRNA 분석을 진행하였다. 514F; 5'-CGT GCC AGC AGC CGC GGT-3', 1542R; 5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAC CC-3'.
지방분해 활성이 가장 큰 Croceibacter atlanticus 균으로부터 리파아제 유전자를 분리하기 위해서 다음과 같이 shotgun cloning을 수행하였다. C. atlanticus 균으로부터 genomic DNA을 추출한 후, HindIII를 처리하여 DNA library를 만들었다. DNA library를 pUC19 vector에 연결시켜 E.
Sub cloning으로 찾아낸 리파아제 유전자는 pUC19 vector에 연결되어 있으므로 M13-20F/M13-47R primer를 사용하여 서열분석을 수행하였다. DNAStar 프로그램을 통해 1.3 kb 전체 염기서열 중에서 하나의 ORF를 찾아내었는데, 이것은 1,029 bp 크기의 염기서열로 구성되어 있고 342개의 아미노산 서열을 코딩하였다. 아미노산 서열로부터 계산된 단백질의 분자량은 37,099 Da이며, 리파아제/에스터라제의 signature sequence인 Gly-Asp-Ser-Ala-Gly motif를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다(Fig.
coli XL1-Blue에 형질전환시켰다. E. coli에서 분리한 재조합 plasmid를 NdeI과 HindIII로 처리하여 lipCA 유전자를 얻었다. 이것을 pET-22 vector에 연결하여 재조합 plasmid (pET-22-lipCA)를 만들고 E.
Ammonium sulfate 침전법과 겔여과 크로마토그래피를 통해서 세포추출액으로부터 LipCA 효소를 순수하게 분리한 후, 최적 온도, pH, 안정성, 기질특이성, 유기용매 안정성 등의 효소특성을 규명하였다. LipCA를 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법으로 고정화하고 효소특성을 조사, 비교하였다. 고정화를 통해 온도, pH, 유기용매에 대한 안정성이 증가하였고 기질특이성의 변화는 관찰되지 않았다.
LipCA를 대상으로 10% 유기용매에서의 안정성 실험을 진행하였다. 실험에서 사용한 12종류의 유기용매 중, 친수성 유기용매에서 높은 안정성이 드러났으며(Fig.
LipCA와 LipCA^CLEA의 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 10℃에서 80℃까지 10℃ 간격으로 1시간 동안 방치한 후 pNPC assay를 수행하였다. LipCA와 LipCA^CLEA 모두 50 mM potassium phosphate (pH 8.
LipCA와 LipCA^CLEA의 온도와 pH에 대한 특성을 pNPC 기질에 대한 분해활성을 측정함으로써 확인하였다. LipCA와 LipCA^CLEA의 최적 온도는 모두 40℃이며(Fig.
LipCA와 LipCA^CLEA의 최적온도를 확인하기 위해 10℃에서 80℃ 사이의 온도에서 효소반응을 진행하였다. 효소활성 측정은 pNPC assay로 진행하였으며, 완충용액으로는 50 mM potassium phosphate (pH 8.
org)에 입력하여 상동성 모델링을 진행하였다. LipCA의 상동성 모델은 Spain Arreo lake metagenome에서 유래한 alpha/beta hydrolase enzyme (PDB ID 5JD4)[6]을 기준으로 수행하였고 PyMOL 프로그램을 통해 단백질 3차 구조를 만들었다.
LipCA의 아미노산 서열을 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)에 입력하여 상동성 모델링을 진행하였다. LipCA의 상동성 모델은 Spain Arreo lake metagenome에서 유래한 alpha/beta hydrolase enzyme (PDB ID 5JD4)[6]을 기준으로 수행하였고 PyMOL 프로그램을 통해 단백질 3차 구조를 만들었다.
3), 329 U/mg의 활성을 가지고 있다(Table 1). SDS-PAGE 결과를 통해 LipCA가 분리되었음을 확인하였으며 분리된 LipCA를 이용해서 효소특성 연구를 수행하였다.
40-F12)를찾았다. Shotgun 클로닝 방법으로 리파아제 유전자(lipCA)를 찾았으며 Escherichia coli 균에서 LipCA 효소를 발현하였다. Spain Arreo metagenome alpha/beta hydrolase를 기준으로 LipCA 상동구조모델을 만들어서 분석한 결과, α/β hydrolase fold, Gly-X-Ser-X-Gly motif, 그리고 lid 구조를 갖고 있기 때문에 전형적인 리파아제 효소임이 밝혀졌다.
coli에서 투명환이 형성되었다. Sub cloning으로 찾아낸 리파아제 유전자는 pUC19 vector에 연결되어 있으므로 M13-20F/M13-47R primer를 사용하여 서열분석을 수행하였다. DNAStar 프로그램을 통해 1.
lipCA 유전자를 pET-22에 클로닝하여 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하였다. E.
투명환을 생성하는 colony를 선별하여 plasmid (pUC19-lip1)를 추출한 후, sub cloning을 진행하였다. pUC19-lip1 plasmid를 HindIII와EcoRI으로 처리하여 1.3 kb 크기의 DNA 조각을 얻었다. 이것을 pUC19 vector와 연결하여 E.
기질에 대한 특이성을 알아보기 위하여 pNP-ester assay와 pH stat assay를 수행하였다. 다양한 탄소 길이를 지닌 pNP 기질을 대상으로 pNP-ester assay로 측정한 결과, 탄소수가 8개인 p-nitrophenyl caprylate를 기질로 사용하였을 때 상대 활성이 가장 높았다(Fig.
기질특이성을 조사하기 위하여 pNP ester assay와 pH stat assay로 다양한 기질에 대한 분해능력을 측정하였다. pNP ester assay는 기준조건에서 탄소수가 다른 다음과 같은 기질을 사용하였다.
남극 로스해(Ross sea)로부터 추출한 42개의 분리균 중 24개의 균이 TBN/Marine agar 배지에서 투명환을 형성했으며, 이중에서 가장 큰 활성을 보이는 분리균인 Croceibacteratlanticus (Stock No. 40-F12, 75°44'S, 176°57'E, depth 320 m)에서 리파아제 효소 유전자를 찾는 실험을 진행하였다(Supplementary Fig. S1).
남극 로스해(Ross sea)에서 분리한 균 중에서 지방분해 활성을 가지고 있는 균을 선별하기 위해 TBN/Marine agar 배지를 이용한 지방분해 균주 스크리닝을 진행하였다. TBN/Marine agar 배지의 제조법은 다음과 같다.
coli XL1-Blue에 형질전환함으로써 재조합 plasmid (pUC19-lip2)를 제조하고 삽입된 DNA의 염기서열을 분석하였다. 리파아제 유전자(lipCA)의 염기 및 아미노산 서열 분석과 데이터베이스 검색은 각각 DNAStar 프로그램과 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST 프로그램을 이용하였다.
리파아제의 pH 안정성을 확인하기 위해 효소를 pH 1.5−12.0 조건에서 1시간 동안 방치한 후, 잔존활성을 측정하였다.
본 실험에서는 남극 로스해(Ross sea)에서 분리한 Croceibacter atlanticus Stock No. 40-F12 균으로부터 shotgun cloning 방법을 통해 리파아제 유전자(lipCA)를 찾고 Escherichia coli에서 대량 생산하였다. 현재까지 C.
본 연구에서는 LipCA 효소를 CLEA 방법으로 고정화하였다. 이 방법의 가장 큰 장점은 저렴한 제조 비용과 손쉬운 회수에 있다.
세포 추출액에 ammonium sulfate를 30% 포화되도록 넣어 LipCA를 선택적으로 침전시킨 후, 4가지 농도(25, 50, 75, 100 mM)의 glutaraldehyde를 첨가하여 LipCA^CLEA를 제조하였다. 생성한 4종류의 LipCA^CLEA의 activity retention은 세포 추출액의 효소활성을 100%로 기준 잡았을 때, 각각 108%, 73%, 37%, 24%로 측정되었다(Supplementary Table S1).
세포 추출액에 ammonium sulfate를 30% 포화되도록 첨가하여 salting-out을 수행한 결과, 대부분의 LipCA 단백질이 침전되었다. 소량의 용액으로 단백질을 현탁한 후, 겔 여과 크로마토그래피를 통해 탈염과 효소분리를 동시에 진행하였다[14]. 일반적으로 대부분의 단백질이 ammonium sulfate 30−70% 포화용액에서 침전되는데 반해서[15, 16],LipCA가 ammonium sulfate 0−30% 포화용액에서 침전된 것은 매우 특이한 결과인데 이것은 LipCA 효소 표면에 소수성 아미노산 잔기가 많이 분포하기 때문이라고 추정한다.
남극해에는 산업적으로 유용한 신규 효소촉매를 생산하는 미생물들이 들어 있다. 우리는 로스해(Ross Sea)로부터 분리한 여러 저온성 박테리아를 조사하였으며, 그 중에서 지방분해 능력이 뛰어난 Croceibacter atlanticus (No. 40-F12)를찾았다. Shotgun 클로닝 방법으로 리파아제 유전자(lipCA)를 찾았으며 Escherichia coli 균에서 LipCA 효소를 발현하였다.
유기용매에 대한 안정성을 실험하기 위해 유기용매에 1시간 동안 효소를 방치한 후, 기준조건 하의 pNPC assay를 통해 잔존 활성을 측정하였다. 사용된 유기용매는 다음과 같다.
3 kb 크기의 DNA 조각을 얻었다. 이것을 pUC19 vector와 연결하여 E. coli XL1-Blue에 형질전환함으로써 재조합 plasmid (pUC19-lip2)를 제조하고 삽입된 DNA의 염기서열을 분석하였다. 리파아제 유전자(lipCA)의 염기 및 아미노산 서열 분석과 데이터베이스 검색은 각각 DNAStar 프로그램과 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST 프로그램을 이용하였다.
HindIII 제한효소를 사용하여 shotgun cloning을 진행한 결과, 약 10 kb 크기의 insert DNA를 가지고 있는 재조합 플라스미드(pUC19-lip1)를 얻었다. 이후, EcoRI으로 10 kb DNA를 자른 결과 약 1.3 kb와 9 kb 크기의 유전자 조각을 얻었고 이것들을 각각 pUC19에 연결하여 두 개의 재조합 plasmid를 만들었다. 재조합 plasmid를 E.
재조합 plasmid (pUC19-lip2)에 삽입된 lipCA 유전자를 lipCA-F/lipCA-R 프라이머를 사용한 PCR반응을 통해 증폭하였다. lipCA-F; 5'-GAT CAT ATG AAT CCT GCT GTTTTT-3', lipCA-R; 5'-GAT AAG CTT TTA CAA CCG CTG AGC-3'.
lipCA-F; 5'-GAT CAT ATG AAT CCT GCT GTTTTT-3', lipCA-R; 5'-GAT AAG CTT TTA CAA CCG CTG AGC-3'. 증폭한 DNA를 pGEM-T vector에 연결시켜 재조합 플라스미드(pGEM-T-lipCA)로 만들고 E. coli XL1-Blue에 형질전환시켰다. E.
지방분해 활성이 가장 큰 Croceibacter atlanticus 균으로부터 리파아제 유전자를 분리하기 위해서 다음과 같이 shotgun cloning을 수행하였다. C.
초음파 분쇄법으로 균을 파쇄시킨 후 원심분리(14,000 ×g,10 min)하여 세포 추출물(cell-free extract)를 얻고, 리파아제 정제와 CLEA 제조를 수행하였다.
의 회수율을 측정하기 위한 회수 방법으로 원심분리(19,000 ×g, 10 min)를 이용하였다. 총 다섯 번의 원심분리를 진행하였으며 원심분리 후의 상층액과 50 mMpotassium phosphate (pH 8.0)로 재부유한 하층액의 잔존활성을 기준조건에서 pNPC assay를 통해 측정하였다.
최적 pH도 pNPC assay를 통해 진행하였으며 반응온도는 37℃에서 진행하였다. pH 7.
coli XL1-Blue에 형질전환 시킨 후, ampicillin(100 μg/ml)을 포함한 TBN/Luria Bertani (LB) agar 배지에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 투명환을 생성하는 colony를 선별하여 plasmid (pUC19-lip1)를 추출한 후, sub cloning을 진행하였다. pUC19-lip1 plasmid를 HindIII와EcoRI으로 처리하여 1.
0)을 완충용액으로 사용하였다. 효소의 잔존 활성은 기준 조건의 pNPC assay를 통하여 측정하였으며, 기준조건은 LipCA와 LipCA^CLEA 를 각각 50 mM Tris-HCl (pH 8.5, pH 9.0)의 완충용액에서 효소와 0.1 mM pNPC을 섞고 37℃에서 3분 동안 반응시킨 후,생성되는 p-nitrophenol의 양을 흡광도(405 nm)로 측정하는 것이다.
0). 효소의 잔존 활성을 측정하기 위해 pNPC assay를 사용하였으며 37℃에서 3분 동안 LipCA는 50 mM Tris-HCl (pH 8.5)의 완충용액, LipCA^CLEA는 50 mM Tris-HCl (pH 9.0)의 완충용액에서 반응시킨 후 잔존 활성을 측정하였다.

대상 데이터

β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)는 Duchefa Biochemie B.V. Co. (Netherlands)에서 구입하였으며, Marine 배지는 Becton, Dickinson and Co. (USA)에서 구입하였다.
리파아제 활성은 다음과 같은 기준 조건에서 측정하였다. 0.1 mM p-nitrophenyl caprylate (pNPC)를 기질로 사용하였으며 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) 완충용액에 기질과 효소액을 넣고 37℃에서 3분 동안 반응시켜 흡광도(405 nm)를 측정하였다. 효소활성 1 unit은 1분 동안 1 μmol의 p-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다[9, 10].
(Japan)에서 구입하였다. Dimethylsulfoxide (DMSO), acetone, pyridine, ethyl acetate는 Junsei Co. (Japan)에서 구입하였으며, methanol, ethanol은 Merck Chemical Co. (Germany)에서 구입하였다. β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)는 Duchefa Biochemie B.
p-Nitrophenyl acetate (C₂), p-nitrophenyl butyrate(C₄), p-nitrophenyl caprylate (C₈), p-nitrophenyl caprate(C₁₀), p-nitrophenyl laurate (C₁₂), tributyrin (TBN), tricaprylin (TCN), 올리브유 (olive oil), glutaraldehyde(25% H₂O), amipicillin, isopropanol, 1,2-dimethoxyethane, acetonitrile, 1-butanol, 2-butanone, propionitrile은 Sigma Aldrich Co. (USA)에서 구입하였으며, p-nitrophenyl caproate(C₆)는 Tokyo Chemical Industry Co. (Japan)에서 구입하였다. Dimethylsulfoxide (DMSO), acetone, pyridine, ethyl acetate는 Junsei Co.
즉, 원심분리를 이용해서 CLEA 효소를 빠르고 효과적으로 회수할 수 있다. 본 실험에 사용된 LipCA^CLEA는 glutaraldehyde를 첨가하고 48시간이 지난 LipCA^CLEA를 사용하였다. 총 다섯 번의 원심분리를 수행하였으며, 4번의 회수 후에 40% 이상의 활성을 유지하였다(Fig.

이론/모형

LipCACLEA의 회수율을 측정하기 위한 회수 방법으로 원심분리(19,000 ×g, 10 min)를 이용하였다.
Lipase와 esterase의 구조적 차이점은 amphipathicα-helix lid 유무이다. LipCA의 3차원 구조를 알아보기 위해 SWISS-MODEL 프로그램의 protein structure homology-modelling server를 이용해서 상동성 모델링을 진행하였다. LipCA와 38.
pH stat assay는 triglycerides에 대한 기질 특이성을 확인하기 위한 방법으로 사용되었으며 기질로 1%의 TBN, TCN, 그리고 올리브유를 사용하였다. pH stat assay의 반응조건은 37℃에서 3분이며, 효소반응이 진행되기 전 1%의 기질과 10% gum arabic이 유화된 emulsion에 10 mM NaOH 용액을 첨가하여 pH를 8.
의 최적온도를 확인하기 위해 10℃에서 80℃ 사이의 온도에서 효소반응을 진행하였다. 효소활성 측정은 pNPC assay로 진행하였으며, 완충용액으로는 50 mM potassium phosphate (pH 8.0)을 사용하였다.

성능/효과

C. atlanticus 균에서 분리한 리파아제 유전자를 lipCA라고 명명하였다. lipCA를 NCBI의 BLAST 프로그램으로 검색한 결과, Alcanivorax sp.
lipCA를 NCBI의 BLAST 프로그램으로 검색한 결과, Alcanivorax sp. DG881의 putative alpha/beta hydrolase (Sequence ID, WP_007151635)와 100% 상동성을 보였다(Fig. 2). Alcanivorax sp.
coli BL21(DE3)에 형질전환하였다. E. coli 배양액에 IPTG를 첨가하여 20℃에서 20시간 배양한 결과, LipCA가 대량으로 생산되었으며, SDS-PAGE 분석을 통해서 LipCA가 수용성 단백질 형태로 세포 추출액의 상층액에 존재함을 알게 되었다(Fig. 3). 세포 추출액에 ammonium sulfate를 30% 포화되도록 첨가하여 salting-out을 수행한 결과, 대부분의 LipCA 단백질이 침전되었다.
S1). HindIII 제한효소를 사용하여 shotgun cloning을 진행한 결과, 약 10 kb 크기의 insert DNA를 가지고 있는 재조합 플라스미드(pUC19-lip1)를 얻었다. 이후, EcoRI으로 10 kb DNA를 자른 결과 약 1.
LipCA와 38.24% 동일성을 갖고 있는 Spain Arreo lake hydrolase를 주형으로 모델링을 수행한 결과, LipCA는 중심에 8개의 strand로 구성된 parallel β-sheet를 지닌 α/β hydrolase 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다.
LipCA와 LipCA^CLEA의 온도, pH에 대한 안정성 실험을 수행함으로써 고정화로 인한 효소의 안정성 증가를 확인할 수 있었다. 먼저 열 안정성의 경우, LipCA^CLEA가 LipCA보다 20℃ 이상 높은 온도에서 더 안정하였다(Fig.
의 온도와 pH에 대한 특성을 pNPC 기질에 대한 분해활성을 측정함으로써 확인하였다. LipCA와 LipCA^CLEA의 최적 온도는 모두 40℃이며(Fig. 4A) LipCA의 최적 pH는 pH 8.5, LipCA^CLEA의 최적 pH는 pH9.0인 것으로 밝혀졌다(Fig. 4B). 효소의 고정화로 인하여 최적 pH가 증가한 것으로 미루어 보아 효소의 활성부위가 일부 변형되었음을 알 수 있다.
LipCA를 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법으로 고정화하고 효소특성을 조사, 비교하였다. 고정화를 통해 온도, pH, 유기용매에 대한 안정성이 증가하였고 기질특이성의 변화는 관찰되지 않았다. LipCA^CLEA는 원심분리 방법으로 쉽게 회수되었고 4번의 재사용 후에 40% 이상의 활성이 잔재하였다.
LipCA^CLEA는 30% 친수성 유기용매에서만 안정성실험을 진행하였다. 그 결과 LipCA와 LipCA^CLEA 모두 DMSO와 1,2-dimethoxyethane에서 상대적 활성이 높았다(Fig. 6B) [20, 21]. 30% 1,2-dimethoxyethane에서 상대적 활성이 높은 이유는 1,2-dimethoxyethane이 단백질 침전제로 작용하였기 때문이다[22].
기질에 대한 특이성을 알아보기 위하여 pNP-ester assay와 pH stat assay를 수행하였다. 다양한 탄소 길이를 지닌 pNP 기질을 대상으로 pNP-ester assay로 측정한 결과, 탄소수가 8개인 p-nitrophenyl caprylate를 기질로 사용하였을 때 상대 활성이 가장 높았다(Fig. 5A). pH stat assay의 경우, 탄소수가 4개인 butyric acid로 구성된 TBN을 기질로 사용하였을 때 가장 높은 활성을 보였다.
를 제조하였다. 생성한 4종류의 LipCA^CLEA의 activity retention은 세포 추출액의 효소활성을 100%로 기준 잡았을 때, 각각 108%, 73%, 37%, 24%로 측정되었다(Supplementary Table S1). Glutaraldehyde의 농도가 높아질수록 활성이 줄어드는 이유를 다음과 같이 설명할 수 있다.
3). 세포 추출액에 ammonium sulfate를 30% 포화되도록 첨가하여 salting-out을 수행한 결과, 대부분의 LipCA 단백질이 침전되었다. 소량의 용액으로 단백질을 현탁한 후, 겔 여과 크로마토그래피를 통해 탈염과 효소분리를 동시에 진행하였다[14].
LipCA를 대상으로 10% 유기용매에서의 안정성 실험을 진행하였다. 실험에서 사용한 12종류의 유기용매 중, 친수성 유기용매에서 높은 안정성이 드러났으며(Fig. 6A), 그 결과를 바탕으로 30% 친수성 유기용매에서 안정성 실험을 진행하였다. LipCA^CLEA는 30% 친수성 유기용매에서만 안정성실험을 진행하였다.
3 kb 전체 염기서열 중에서 하나의 ORF를 찾아내었는데, 이것은 1,029 bp 크기의 염기서열로 구성되어 있고 342개의 아미노산 서열을 코딩하였다. 아미노산 서열로부터 계산된 단백질의 분자량은 37,099 Da이며, 리파아제/에스터라제의 signature sequence인 Gly-Asp-Ser-Ala-Gly motif를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다(Fig. 1).
3 kb와 9 kb 크기의 유전자 조각을 얻었고 이것들을 각각 pUC19에 연결하여 두 개의 재조합 plasmid를 만들었다. 재조합 plasmid를 E. coli XL1-Blue에 형질전환 시켜 TBN/LB agar배지에서 screening한 결과 1.3 kb 크기의 DNA를 가지고 있는 E. coli에서 투명환이 형성되었다. Sub cloning으로 찾아낸 리파아제 유전자는 pUC19 vector에 연결되어 있으므로 M13-20F/M13-47R primer를 사용하여 서열분석을 수행하였다.
본 실험에 사용된 LipCA^CLEA는 glutaraldehyde를 첨가하고 48시간이 지난 LipCA^CLEA를 사용하였다. 총 다섯 번의 원심분리를 수행하였으며, 4번의 회수 후에 40% 이상의 활성을 유지하였다(Fig. 7). LipCA^CLEA를 여러 번 사용하면 활성이 점차적으로 감소하는 것은 CLEA로부터 효소가 떨어지면서 생기는 결과이고, LipCA효소의 Lys 함량이 적고 cross-linker로 사용한 glutaraldehyde의 분자길이가 짧기 때문이라고 추정된다.

후속연구

LipCA^CLEA를 여러 번 사용하면 활성이 점차적으로 감소하는 것은 CLEA로부터 효소가 떨어지면서 생기는 결과이고, LipCA효소의 Lys 함량이 적고 cross-linker로 사용한 glutaraldehyde의 분자길이가 짧기 때문이라고 추정된다. 기존 문헌[23]에 따르면, BSA 첨가, pH 조절, dextran aldehyde 사용 등을 통해서 효소가 떨어지는 것을 방지할 수 있다고 밝혀졌기 때문에 LipCA의 경우에도 향후에 고정화의 최적화 연구를 통해 효소 활성을 안정화시킬 수 있을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	리파아제 효소란 무엇인가?	1.3)는 지방 가수분해 효소이며 트리글리세리드의 에스테르 결합을 가수분해하여 글리세롤과 지방산을 생성하는 효소이다. 반응조건에 따라서 에스테르합성 반응, 트랜스에스테르화 반응도 촉매하는 산업용 효소이다.
	미생물 리파아제 효소에 대한 X선 결정구조는 어떻게 관찰되는가?	현재까지 많은 미생물 리파아제 효소에 대한 X선 결정구조가 밝혀져서 보고되었다. 대부분의 경우, 효소구조의 중심에 parallel β-sheet를 지닌 α/β hydrolase fold를 갖고 있다[4]. 활성부위에 Ser-His-Asp의 catalytic triad를 가지며, 이 중에서 Ser은 Gly-X-Ser-X-Gly 보존서열 속에 들어있다[5]. 또한, 활성부위 포켓이 amphipathic α-helix로 구성된 lid로 덮여 있는데 이 구조가 리파아제 특이적인 ‘Interfacial activation’ 기작과 밀접하게 관련되어 있다. 에스터라제 효소의 경우, 리파아제와 대부분 유사한 구조를 갖고 있지만, 활성부위에 lid 구조를 갖고 있지 않다.
	산업용 촉매로 이용하기 위한 재조합 리파아제 효소 생산 방법은?	지구상 특수환경에서 발굴한 리파아제를 산업용 촉매로 활용하기 위해서는 유전공학기법으로 재조합 효소를 생산해야 한다. 발굴한 리파아제 유전자 ORF를 특수 프로모터를 지닌 발현벡터에 넣어 미생물을 형질전환하고, 배지조성, 배양온도, 배양시간, 유도물질 농도, 유도배양시간 등을 조절하여 활성형태로 대량 생산하면 적은 비용으로 재조합 리파아제 효소를 만들 수 있다. 또한, 안정성을 향상시키고 반복 사용할 수 있도록 효소를 고정화해야 한다.

참고문헌 (23)

Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. 2001. Production, purification, characterization, and applications of lipase. Biotechnol. Adv. 19: 627-662.

상세보기
Datta S, Christena LR, Rajaram YRS. 2013. Enzyme immobiliza- tion: an overview on techniques and support materials. 3 Biotech. 3: 1-9.

상세보기
Sheldon RA. 2011. Cross-linked enzyme aggregates as industrial biocatalysts. Org. Process Res. Dev. 15: 213-223.

상세보기
Lenfant N, Hotelier T, Velluet E, Bourne Y, Marchot P, Chatonnet A. 2013. ESTHER, the database of the ${\alpha}/{\beta}$ -hydrolase fold superfamily of proteins: tools to explore diversity of functions. Nucl. Acids Res. 41: 423-429.
Arpigny JL, Jaeger KE. 1999. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties. Biochem. J. 343: 177-183.

상세보기
Martinez-Martinez M, Alcaide M, Tchigvintsev A, Reva O, Polaina J, Bargiela R, et al. 2013. Biochemical diversity of carboxyl esterases and lipases from lake Arreo (Spain): a metagenomic approach. Appl. Environ. Microbiol. 79: 3553-3562.

상세보기
Kartal F, Janssen MHA, Hollmann F, Sheldon RA, Kilinc A. 2011. Improved esterification activity of Candida rugosa lipase in organic solvent by immobilization as cross-linked enzyme aggregates (CLEAs). J. Mol. Catal. B: Enzym. 71: 85-89.

상세보기
Rehman S, Bhatti HN, Bilal M, Asgher M. 2016. Cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of Pencilluim notatum lipase enzyme with improved activity, stability and reusability characteristics. Int. J. Biol. Macromol. 91: 1161-1169.

상세보기
Iftikhar T, Niaz M, Jabeen R, Haq IU. 2011. Purification and characterization of extracellular lipase. Pak. J. Bot. 43: 1541-1545.
Perez D, Martin S, Fernandez-Lorente G, Filice M, Guisan JM, Ventosa A, et al. 2011. A novel halophilic lipase, LipBL, showing high efficiency in the production of eicosapentaenoic acid (EPA). PLoS One. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023325.

상세보기
Kim HK, Park SY, Lee JK, Oh TK. 1998. Gene cloning and charac- terization of thermal stable lipase from Bacillus stearothermophilus L1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 66-71.

상세보기
Cho JC, Giovannoni SJ. 2003. Croceibacter atlanticus gen.nov., sp. Nov., A Novel Marine Bacterium in the Family Flavobacteriaceae. Syst. Appl. Microbiol. 26: 76-83.

상세보기
Lai Q, Wang J, Gu L, Zheng T, Shao Z. 2013. Alcanivorax marinus sp. Nov., isolated from deep-sea water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63: 4428-4432.

상세보기
Saxena RK, Sheoran A, Giri B, Davidson WS. 2003. Purification strategies for microbial lipase. J. Microbiol. Methods. 52: 1-18.
Li M, Yang LR, Xu G, Wu JP. 2013. Screening, purification and characterization of a novel cold-active and organic solvent-tolerant lipase from Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 4254. Bioresour. Technol. 148: 114-120.

상세보기
Wang Q, Hou Y, Ding Y, Yan P. 2012. Purification and biochemical characterization of a cold-active lipase from Antarctic sea ice bacteria Pseudoalteromonas sp. NJ 70. Mol. Biol. Rep. 39: 9233-9238.

상세보기
Gauthier MA, Ayer M, Kowal J, Wurm FR, Klok HA. 2011. Arginine-specific protein modification using ${\alpha}$ -oxo-aldehyde functional polymers prepared by atom transfer radical polymerization. Polym. Chem. 2: 1490-1498.

상세보기
Farris S, Song J, Huang Q. 2010. Alternative reaction mechanism for the cross-linking of gelatin with glutaraldehyde. J. Agric. Food Chem. 58: 998-1003.

상세보기
Migneault I, Dartiguenave C, Bertrand MJ, Waldron KC. 2004. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37: 790-802.

상세보기
Yedavalli P, Rao NM. 2013. Engineering the loops in a lipase for stability in DMSO. Protein Eng. Des. Sel. 26: 317-324.

상세보기
Dachuri V, Boyineni J, Choi S, Chung HS, Jang SH, Lee CW. 2016. Organic solvent-tolerant, cold-adapted lipase PML and LipS exhibit increased conformational flexibility in polar organic solvents. J. Mol. Catal. B: Enzym. 131: 73-78.

상세보기
Lopez-Serrano P, Cao L, van Rantwijk F, Sheldon RA. 2002. Cross-linked enzyme aggregates with enhanced activity: application to lipases. Biotechnol. Lett. 24: 1379-1383.

상세보기
Valdes EC, Soto LW, Arcaya GA. 2011. Influence of the pH of glutaraldehyde and the use of dextran aldehyde on the preparaton of cross-linked enzme aggregates (CLEAs) of lipase from Burkholderia cepacia. Electronic J. Biotechnol. 14. doi:10.2225/ vol14-issue3-fulltext-1.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증