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문제 정의
- 또한 봉독을 사용하는 농가에서 젖소의 유량이 증가하는 효과가 있다고 알려져 있었다. 따라서 본 연구를 통해 봉독이 젖소의 유량을 증가시키는 효과가 있는지를 확인하고자 하였다. 유생산량은 유선의 발달과 분화 정도에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다.
- 따라서 본 연구에서는 낙농산업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 젖소 유방염 원인균에 대해 강력한 항균효과와 염증억제 효과를 갖는 봉독이 MAC-T 세포에서 유단백 합성을 촉진하는 효과를 측정하여 젖소 유방염 예방 및 치료제로 개발 가능성뿐만 아니라 생산성 향상에도 도움이 되는지를 검증하고자 하였다.
- 본 연구에서는 유선세포인 MAC-T 세포에서 주요 유단백질인 β-casein의 발현을 활성화시키는지를 확인하였다.
- 본 연구팀에서는 2005년 봉독채집장치와 채집된 봉독으로부터 이물질을 제거할 수 있는 봉독정제법을 개발하였다(한 등, 2007). 이로써 국내에서도 봉독채집이 가능하게 되었으며, 화장품과 의약품의 원료와 동물용의약외품 세정제로 정제봉독이 상용화되었다.
제안 방법
- MAC-T 세포에서 50 ng/mL의 농도에서 β-casein 단백질 발현이 가장 높은 것으로 확인되어 50 ng/mL의 농도로 봉독을 처리 한 후 단백질 발현 지속시간을 측정하였다.
- MAC-T 세포에서 봉독의 β-casein 단백질 발현 지속시간을 측정하고자 단백질 발현 최적 농도로 처리한 후 12시간 간격으로 상청액을 취하여 발현량을 측정하였다.
- amfiRivert platinum cDNA synthesis master mix (GenDEPOT, USA)를 이용하여 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 PCR을 수행하여 cDNA를 합성하였으며, β-casein 합성 유전자인 bCSNB gene의 증폭을 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.
- 구입한 정제봉독의 성분 확인을 위하여 4 mg/mL의 농도로 3차 증류수에 녹여 PTFE 0.2 μm 필터(Sigma-Aldrich, USA)로 여과하여 UPLC (Ultra performance liquid chromatography, Waters, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 94℃에서 3분 반응 후, 94℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초 반응 사이클을 35회 반복하여 증폭한 후 마지막 72℃에서 10분간 반응시켰다. 그 후 1% agarose gel에서 전기영동하였고 UV를 조사하여 증폭 산물을 확인하였다.
- 24시간 동안 배양 후 50 L CCK-8 용액(Dojindo, Japan)을 첨가하여 3시간 배양하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세포의 형태에도 변화를 주는 지를 확인하고자 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.
- 세포독성을 유발하지 않는 농도의 정제봉독을 MAC-T 세포에 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 세포를 수거하여 bCSNB의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 정제봉독을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 봉독 농도가 증가함에 따라 bCSNB의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 50 ng/mL의 봉독을 적용하였을 경우 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하였다(Fig.
- 본 실험에서는 정제된 봉독을 MAC-T 세포에 다양한 농도로 처리한 후 WST-8 환원 방법을 이용하여 세포독성을 확인하였다. MAC-T 세포에 다양한 농도의 봉독을 처리하였으며, 그 결과 정제봉독 10 μg/mL에서는 세포의 생존율이 57%로 현저히 낮게 나타났으며 1 μg/mL 부터 0.
- 서양종꿀벌의 일벌로부터 분리한 봉독은 멜리틴을 주성분으로 다양한 항균, 항염, 면역증강 효과 등을 갖고 있다. 본 연구에서는 봉독채집장치로 대량으로 채취한 봉독을 이물질을 제거하고 멜리틴 함량 정제봉독 내의 멜리틴, 아파민 그리고 포스포리파아제 A2의 함량이 63.9%, 2.3% 그리고 10.9%인 정제봉독을 젖소 유선세포인 MAC-T 세포를 사용하여 유단백질의 합성을 증가시키는지를 확인하였다. 정제봉독은 1 μg/mL 이하의 농도에서는 MAC-T 세포의 증식을 촉진하였으나 10 μg/mL 이상에서는 세포독성을 갖고 있었다.
- 봉독을 함유하지 않은 배지와 1, 10, 50, 100 ng/mL 농도로 봉독이 함유된 DMEM 배지로 배양액을 교체하였으며 37°C, 5% CO2 조건 하에서 24시간 반응시킨 뒤 그 상청액을 실험에 적용하였다.
- 표준품인 apamin, mellitin, 그리고 phospholipase A2는 시그마사(Sigma-Aldrich)로부터 구입하여 2 mg/mL로 만들어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하였다. 분석기기는 PDA (photo diode array, Waters)검출기가 장착된 Acquity UPLC I-Class (Waters)를 사용하여, Table 1과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 220 nm의 검출파장에서 분석하였다(Han 등, 2017). 정제봉독 내의 멜리틴, 아파민 그리고 포스포리파아제 A2의 함량은 각각의 표준품 수용액 시료에 나타나는 피크와 비교하여 63.
- 세포는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, USA), 1% penicillin/ streptomycin (Gibco BRL)이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 5% CO2 배양기에서 37°C로 배양하였다.
- 수거한 상청액은 Cow Casein β ELISA Kit (Abbexa, UK)를 사용하여 단백질 함량을 측정하였다.
- 유단백인 β-casein (CSN2)의 발현은 Cow Casein β ELISA Kit (Abbexa, UK)를 사용하여 측정하였다.
- 이러한 결과를 바탕으로 본 실험에서는 MAC-T 세포에 1μg/mL 이하의 봉독을 처리한 후 β-casein의 단백질 및 bCSNB mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
- 정제봉독이 젖소 유선세포인 MAC-T 세포에서 주요 유단백질인 casein의 합성을 촉진하는지를 확인하기 위하여 Cow Casein β ELISA kit를 이용하였다(Chen 등, 2013).
대상 데이터
- 시험물질인 정제봉독은 봉독채집장치를 사용하여 서양종꿀벌로부터 채취한 봉독을 ‘봉독의 간이정제방법으로(한 등, 2007) 정제한 정제봉독을 구입하여 사용하였다(한국정제봉독협동조합, 한국).
- 본 실험에 사용한 MAC-T 세포는 고려대학교 식품생명공학과로부터 분양받아 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, USA), 1% penicillin/ streptomycin (Gibco BRL)이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 5% CO2 배양기에서 37°C로 배양하였다.
- 2 μm 필터(Sigma-Aldrich, USA)로 여과하여 UPLC (Ultra performance liquid chromatography, Waters, USA)를 사용하여 분석하였다. 표준품인 apamin, mellitin, 그리고 phospholipase A2는 시그마사(Sigma-Aldrich)로부터 구입하여 2 mg/mL로 만들어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하였다. 분석기기는 PDA (photo diode array, Waters)검출기가 장착된 Acquity UPLC I-Class (Waters)를 사용하여, Table 1과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 220 nm의 검출파장에서 분석하였다(Han 등, 2017).
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 R 통계프로그램을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 평균±표준오차(mean±SEM)로 표시하였다.
이론/모형
- 세포는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, USA), 1% penicillin/ streptomycin (Gibco BRL)이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에 5% CO2 배양기에서 37°C로 배양하였다. 정제봉독 하에서 MAC-T 세포의 생존율을 측정하기 위하여 WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl-2H-tetrazolium, monosodium salt) 환원 방법을 이용하였다. 24시간 동안 배양 후 50 L CCK-8 용액(Dojindo, Japan)을 첨가하여 3시간 배양하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- β-casein의 함량은 정제봉독의 처리 농도 의존적으로 증가하여 50 ng/mL의 농도에서 증가율이 가장 높았으며 이후 정제봉독의 농도가 증가함에 따라 오히려 단백질 합성이 감소하는 것으로 확인되었다.
- 1 μg/mL 이하의 정제봉독은 MAC-T의 생존에 영향을 미치지 않으며 세포의 증식에 도움에 되는 것으로 확인되었다.
- MAC-T 세포에 다양한 농도의 봉독을 처리하였으며, 그 결과 정제봉독 10 μg/mL에서는 세포의 생존율이 57%로 현저히 낮게 나타났으며 1 μg/mL 부터 0.01 μg/mL의 농도는 각각 99.9%, 102.2% 그리고 103.5%로 세포의 증식이 미세하게 증가하는 것을 나타났다(Fig. 2).
- 그 결과 봉독은 매우 낮은 농도인 1 ng/mL에서도 유단백질 합성이 활성화 되었으며 봉독의 농도가 증가 할수록 casein 합성량도 증가하였으나 50 ng/mL의 농도에서 가장 효과적으로 casein 합성량이 증가하는 것으로 확인되었다. MAC-T 세포에서 봉독처리 후 36시간 후 유단백 합성량이 가장 증가되었으며 단백질 발현 증가는 96시간 동안 유지되는 것으로 확인되었다.
- bCSNB 유전자 발현은 농도 의존적으로 증가하였으나 β-casein 단백질 합성에서와 같이 50 ng/mL을 기점으로 농도가 증가하더라도 더 이상 증가폭은 크지 않은 것으로 확인되었다.
- 그 결과 Fig. 3에서 보는바와 같이 1 ng/mL 이상의 농도로 처리했을 경우 세포 배양액 내 β-casein 함량이 증가하는 것으로 확인되었다.
- MAC-T 세포에서 50 ng/mL의 농도에서 β-casein 단백질 발현이 가장 높은 것으로 확인되어 50 ng/mL의 농도로 봉독을 처리 한 후 단백질 발현 지속시간을 측정하였다. 그 결과 봉독 처리 후 36시간째 발현량이 가장 높았으며 이후에도 단백질 발현은 증가하여 96시간 동안 지속되었다(Fig. 4). 그러나 단백질 발현량 증가율은 35시간 이후 급격히 감소하여 120시간 이후에는 단백질 발현 증가가 확인되지 않았다.
- 본 연구에서는 유선세포인 MAC-T 세포에서 주요 유단백질인 β-casein의 발현을 활성화시키는지를 확인하였다. 그 결과 봉독은 매우 낮은 농도인 1 ng/mL에서도 유단백질 합성이 활성화 되었으며 봉독의 농도가 증가 할수록 casein 합성량도 증가하였으나 50 ng/mL의 농도에서 가장 효과적으로 casein 합성량이 증가하는 것으로 확인되었다. MAC-T 세포에서 봉독처리 후 36시간 후 유단백 합성량이 가장 증가되었으며 단백질 발현 증가는 96시간 동안 유지되는 것으로 확인되었다.
- 배양 후 세포를 수거하여 bCSNB의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 정제봉독을 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 봉독 농도가 증가함에 따라 bCSNB의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 50 ng/mL의 봉독을 적용하였을 경우 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 5). 정제봉독에 의한 bCSNB 유전자 발현 수준은 1 ng/ml의 처리 농도에서도 대조군에 비하여 통계적으로 유의성을 나타내었다(P＜0.
- 세포독성을 갖지 않는 정제봉독의 농도로 MAC-T 세포에 처리 후 유단백질인 β-casein의 합성이 증가되는 확인한 결과 1 ng/mL 이상의 농도로 처리했을 경우 세포 배양액 내 β-casein 함량이 증가하는 것으로 확인되었으며 유단백질 합성은 96시간 동안 지속되는 것으로 확인되었다. 또한 정제봉독은 1 ng/mL 이상의 농도에서β-casein 합성 유전자인 bCSNB mRNA 발현을 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 봉독은 유단백질과 유단백질 유전자 발현을 증가시켜 궁극적으로 가축의 생산량을 증대시키기 위해 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 유선세포내의 유단백질 유전자의 발현 증가는 유선조직의 기능 활성화 정도를 나타내는 것으로 유선세포의 활성화는 다음번 포유기에도 지속적으로 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Kim, 2000). 본 연구결과 정제봉독은 유단백질 유전자인 bCSNB mRNA발현을 증가시켜 유단백질의 합성을 촉진하는 것으로 확인되었다. 앞으로 기존 항생제 대체 젖소 유방염 예방과 치료에 봉독을 처리 현장적용 시험을 통해 유량 증대 효과 검증과 더불어 봉독 처리 용량 및 투여 방법 등에 대한 추가 연구가 필요하다.
- 정제봉독은 1 μg/mL 이하의 농도에서는 MAC-T 세포의 증식을 촉진하였으나 10 μg/mL 이상에서는 세포독성을 갖고 있었다. 세포독성을 갖지 않는 정제봉독의 농도로 MAC-T 세포에 처리 후 유단백질인 β-casein의 합성이 증가되는 확인한 결과 1 ng/mL 이상의 농도로 처리했을 경우 세포 배양액 내 β-casein 함량이 증가하는 것으로 확인되었으며 유단백질 합성은 96시간 동안 지속되는 것으로 확인되었다. 또한 정제봉독은 1 ng/mL 이상의 농도에서β-casein 합성 유전자인 bCSNB mRNA 발현을 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었다.
- 분석기기는 PDA (photo diode array, Waters)검출기가 장착된 Acquity UPLC I-Class (Waters)를 사용하여, Table 1과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 220 nm의 검출파장에서 분석하였다(Han 등, 2017). 정제봉독 내의 멜리틴, 아파민 그리고 포스포리파아제 A2의 함량은 각각의 표준품 수용액 시료에 나타나는 피크와 비교하여 63.9%, 2.3% 그리고 10.9%로 확인되었다(Fig. 1).
- 정제봉독은 유선세포에서 β-casein 합성 유전자인 bCSNB mRNA 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다.
후속연구
- 본 연구결과 정제봉독은 유단백질 유전자인 bCSNB mRNA발현을 증가시켜 유단백질의 합성을 촉진하는 것으로 확인되었다. 앞으로 기존 항생제 대체 젖소 유방염 예방과 치료에 봉독을 처리 현장적용 시험을 통해 유량 증대 효과 검증과 더불어 봉독 처리 용량 및 투여 방법 등에 대한 추가 연구가 필요하다.
- 또한 정제봉독은 1 ng/mL 이상의 농도에서β-casein 합성 유전자인 bCSNB mRNA 발현을 유의하게 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 봉독은 유단백질과 유단백질 유전자 발현을 증가시켜 궁극적으로 가축의 생산량을 증대시키기 위해 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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