[논문]식방풍 유래 화합물 3′,4′-Disenecioylkhellactone의 위암세포에서 STAT3 활성화 억제를 매개로 하는 세포사멸 유도작용

천재무; 김진웅; 김영식

식방풍 유래 화합물 3′,4′-Disenecioylkhellactone의 위암세포에서 STAT3 활성화 억제를 매개로 하는 세포사멸 유도작용
3′,4′-Disenecioylkhellactone from Peucedanum japonicum Thunb. Induces Apoptosis Mediated by Inhibiting STAT3 Signaling in Human Gastric Cancer Cells 원문보기

생약학회지, v.49 no.3, 2018년, pp.225 - 230

천재무 (서울대학교 약학대학) , 김진웅 (서울대학교 약학대학) , 김영식 (서울대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

3',4'-Disenecioylkhellactone is one of khellactone-type coumarins isolated from the roots of Peucedanum japonicum Thunb. However, its pharmacological effects are still little understood. In the present study, we investigated the inhibitory effect of 3',4'-disenecioylkhellactone on growth of gastric cancer cells. 3',4'-Disenecioylkhellactone strongly suppressed cell proliferation and induced caspase-mediated apoptosis in AGS human gastric cancer cells. Analysis of phospho-antibody arrays revealed 3',4'-disenecioylkhellactone effectively suppressed signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) tyrosine phosphorylation. 3',4'-Disenecioylkhellactone decreased STAT3 translocation to the nucleus and expression of STAT3 target genes. In addition, we examined the level of STAT3 activation in several gastric cancer cells and found that the inhibition of STAT3 phosphorylation by 3',4'-disenecioylkhellactone was associated with gastric cancer cell proliferation. Taken together, this study provides evidence for the first time that 3',4'-disenecioylkhellactone may be a potential therapeutic agent for the prevention or treatment of gastric cancer.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Anti-proliferative effect of 3',4'-disenecioylkhellactone.
그림 Fig. 2. Apoptosis induction of 3',4'-disenecioylkhellactone in AGS cells.
그림 Fig. 3. Change of the phosphokinase profiles by 3',4'-disenecioylkhellactone in AGS cells.
그림 Fig. 4. Inhibitory effect of 3',4'-disenecioylkhellactone on STAT3 activation in AGS cells.
그림 Fig. 5. Evaluation of 3',4'-disenecioylkhellactone's effect in other gastric cancer cells, including AGS, SNU-638, KATO III, and MKN-45.

AI 본문요약
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문제 정의

다양한 위암세포주에서 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 STAT3 신호전달 억제작용 - 4가지 인체유래 위암세포인 AGS, SNU-638, KATO III, MKN-45를 대상으로 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 세포성장 저해효능과 STAT3 인산화 억제작용에 대해 조사하였다.
따라서, 본 연구에서는 식방풍의 지표성분인 3',4'-disenecioylkhellactone을 대상으로 위암세포에서 암세포 성장 억제 기전에 대해 조사하였다.
본 연구는 위암세포인 AGS에서 식방풍의 지표성분 중의 하나인 3′,4′-disenecioylkhellactone를 대상으로 암세포 증식억제 및 그 기전을 조사하였다.

제안 방법

16) 따라서, 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 AGS 위암세포의 성장 억제 및 세포사멸 유도를 조절하는 상위단계 기전으로 단백질 인산화의 변화를 탐색하기 위해, 인산화효소 프로파일 대량분석을 수행하였다.
3′,4′-Disenecioylkhellactone에 의한 AGS세포의 세포사멸 유도 - 3′,4′-Disenecioylkhellactone에 의한 세포증식 억제 효과가 세포사멸 유도에 의한 것인지를 조사하기 위해 DNA 분절분석 및 세포주기분석의 sub-G1 비율을 통해 세포사멸의 기본적 특징을 조사하였다.
Ethidium bromide이 포함된 2% agarose gel에 DNA를 전기 영동 후, Doc-IT® LS image analysis software(UVP Inc., Upland, CA, USA)를 이용하여 DNA분절을 확인하였다.
Bradford 용액(Bio-Rad, CA, USA)으로 단백질 농도를 정량한 후, 동량의 단백질을 SDS-PAGE상에서 각각의 단위체로 분리하여 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. Membrane은 5% BSA로 blocking후, 각각의 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰고, 1차 항체에 상응하는 horseradish peroxidase이 결합된 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, chemiluminescence kit(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 단백질의 발현 변화를 조사하였다.
Propidium iodide 용액(50 μg/mL)을 이용하여 10분 동안 염색한 후, 유세포 분석기(FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 형광반응에 따른 세포내 DNA 양을 측정하고, CellQuest software(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
Western Blot을 이용한 단백질 발현 분석 - 단백질 발현 변화 분석을 위해 20 mM HEPES, pH 7.6, 350 mM NaCl, 1% NP-40, 20% glycerol, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA가 함유된 lysis 용액을 이용하여 세포내 전체 단백질을 추출하였다. 핵단백질 분리를 위해 10 mM HEPES, pH 7.
따라서, STAT3의 인산화 억제를 구체적으로 확인하기 위해 3′,4′-disenecioylkhellactone를 시간별로 처리한 후, STAT3 인산화 억제를 확인하였다.
세포 성장 측정 - 세포의 성장은 MTT를 사용하여 측정하였다. 위암세포(1 × 10⁴cells/well)를 100 μL씩 96-well plate에 분주하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 식방풍 유래 화합물인 3′,4′-disenecioylkhellactone를 25, 50, 100 μM의 농도로 첨가하여 배양하였다.
위암세포(1 × 104cells/well)를 100 μL씩 96-well plate에 분주하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 식방풍 유래 화합물인 3′,4′-disenecioylkhellactone를 25, 50, 100 μM의 농도로 첨가하여 배양하였다.
Membrane을 수차례 세척한 후, 상온에서 2시간 동안 검출 항체와 반응시켰다. 이 후, membrane을 검출 시약과 30분 동안 반응시켰고, 수차례 세척한 후, chemiluminescence kit(Intron Biotechnology)를 이용하여 단백질의 발현 변화를 조사하였다.
1 mM EGTA가 함유된 lysis 용액을 이용하여 세포내 전체 단백질을 추출하였다. 핵단백질 분리를 위해 10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA가 함유된 용액으로 세포막을 파괴한 후, 400mM NaCl, 20mM HEPES, pH 7.9, 1mM DTT, 1mM PMSF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA가 함유된 용액으로 최종적으로 핵 단백질을 추출하였다. Bradford 용액(Bio-Rad, CA, USA)으로 단백질 농도를 정량한 후, 동량의 단백질을 SDS-PAGE상에서 각각의 단위체로 분리하여 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다.

대상 데이터

1A)은 갯기름나물의 뿌리에서 분리하였으며, 서울대학교 약학대학 김진웅 교수로부터 제공받아 실험에 사용하였다.¹⁰⁾ RPMI 1640 배지, fetal bovine serum(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신은 GenDepot(Barker, TX, USA)에서 구입하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma Aldrich(St.
¹⁰⁾ RPMI 1640 배지, fetal bovine serum(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신은 GenDepot(Barker, TX, USA)에서 구입하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 항체 p-STAT3(Tyr705), STAT3, cyclin D1, survivin은 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 항체 caspase-3, caspase-8은 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, 항체 PARP1, SHP-1, SHP-2, caspase-9, β-actin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
세포배양 - 본 실험에 사용한 세포는 인체유래 위암세포주인 AGS, SNU-638, KATO III, MKN-45 세포로 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 10% FBS와 100 units/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.
재료 - 본 실험에 사용한 3′,4′-disenecioylkhellactone(Fig. 1A)은 갯기름나물의 뿌리에서 분리하였으며, 서울대학교 약학대학 김진웅 교수로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
항체 p-STAT3(Tyr705), STAT3, cyclin D1, survivin은 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 항체 caspase-3, caspase-8은 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, 항체 PARP1, SHP-1, SHP-2, caspase-9, β-actin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

통계분석 - 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, Prism 6.0(GraphPad)의two-tailed student's t-test를 실시하여 대조군과 실험군 간의 통계학적 유의성을 검증하였다.

이론/모형

3′,4′-Disenecioylkhellactone에 의한 암세포 증식 억제 효과 - AGS 위암세포에서 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 세포증식에 미치는 효과를 조사하기 위하여 MTT를 사용하여 평가하였다.
단백질의 인산화 변화 분석 - 대량의 단백질 인산화 변화 분석은 Human Phospho-Kinase Array Kit(#ARY003B, R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt, German)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 수행하였다.

성능/효과

Initiator caspase인 caspase-9과 caspase-8은 서로 다른 경로를 통해 활성화된다.¹⁴⁾ 내인성 경로를 매개로 하는 caspase-9는 미토콘드리아 막 투과성이 증가되어 세포질로 방출되는 cytochrome c에 의해 활성화되며, 외인성 경로를 매개로 하는 caspase-8은 세포막에 존재하는 death receptor에 의해서 활성화된다. 활성화된 caspase-9 또는 caspase-8은 effector caspase인 caspase-3을 활성화하고, 활성화된 caspase-3은 PARP 단백질을 분해하여 세포사멸을 유도한다.
15) 본 연구에서 3′,4′- disenecioylkhellactone에 의한 세포사멸 유도가 caspase의 활성화에 미치는 영향을 조사하기 위해 caspase의 변화와 PARP1 단백질이 절단되는지를 확인한 결과, Fig. 2C에서 보여주듯이, 3′,4′-disenecioylkhellactone 처리에 의해, procaspase-9의 감소 및 caspase의 활성 형태인 cleaved caspase-3 및 caspase-8의 증가를 관찰하였고, PARP1의 절단을 확인할 수 있었다.
19) 이에 대한 영향을 확인하기 위해 광범위의 tyrosine phosphatase 억제제인 pervanadate를 처리하였을 때, 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 STAT3 인산화 억제작용이 부분적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4E).
^1,2) 실제로 2015년 한국에서 가장 많이 발생한 암은 위암이었으며,³⁾ 암의 발병으로 인한 사회적, 경제적 손실이 급증하고 있기 때문에 체계적인 위암의 예방 및 국가차원에서의 지속적 관리가 반드시 필요한 실정이다.⁴⁾ 위암의 주요 치료는 외과적 수술이 시행되고 있지만, 재발 또는 전이의 위험성이 있는 경우 항암 화학적 요법이 병행된다.⁵⁾ 따라서, 항암제에 따른 부작용을 경감시키기 위한 효과적이며 새로운 표적 발굴 및 항암제 개발이 반드시 필요한 실정이다.
6) 많은 악성종양에서 STAT3의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 활성화된 STAT3은 종양의 형성, 암세포의 침윤 및 전이, 항암제에 대한 내성에도 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에, STAT3을 표적하는 화합물은 최근 유망한 항암 후보물질로 주목을 받고 있다.⁷⁾
AGS 위암세포에 3′,4′-disenecioylkhellactone를 25, 50, 100 μM의 농도로 처리하여, 24시간 후에 확인한 결과 농도 의존적으로 세포성장을 억제하는 효과가 있었다(Fig. 1B).
Fig. 3에서 보여주듯이, 3′,4′-disenecioylkhellactone를 위암세포에 처리하였을 때, CREB, ERK, p53 등의 인산화가 감소하였으며, 그중에서 STAT3 tyrosine 인산화를 가장 유의적으로 억제하였다.
Fig. 5A에서 보여주듯이, 3′,4′-disenecioylkhellactone는 AGS 세포에서 가장 강하게 세포성장을 저해하였고, SNU-638 세포에서 상대적으로 약한 세포성장 저해 효과를 보였다.
IL-6 또는 EGF에 의해 유도되는 STAT3인산화를 비교해 보았을 때, 3′,4′-disenecioylkhellactone 처리는 모든 위암세포에서 IL-6에 의한 STAT3 인산화를 억제하였으며, SNU-638 세포에서는 EGF에 의해 상대적으로 강하게 유도된 STAT3 인산화를 크게 감소시켰다(Fig. 5C).
그 결과 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의해서 시간의존적으로 STAT3의 tyrosine 인산화가 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 4A).
또한 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 세포성장 억제는 STAT3 tyrosine 인산화 억제와 관련되어 있음을 확인하였다.
또한, AGS 세포의 핵 단백질을 추출해서 STAT3단 백질을 확인하였을 때, 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 STAT3 인산화 억제는 STAT3 핵 내 이동을 저해함을 확인할 수 있었다(Fig. 4C).
서로 다른 위암 세포에서 STAT3 활성화와 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의한 STAT3 인산화 억제를 비교해 보았을 때, AGS, MKN-45, KATO III, SNU-638 세포 순서로 STAT3 활성화 정도를 나타내었으며, AGS 및 KATO III 세포에서 3′,4′-disenecioylkhellactone에 의해서 STAT3 인산화를 강하게 억제하였다(Fig. 5B).
위 결과를 종합해 볼 때, 3′,4′-disenecioylkhellactone는 위암세포에서 STAT3 인산화를 억제하였으며, 감소된 STAT3 tyrosine 인산화는 세포성장 억제와 밀접한 관련이 있을 것으로 사료된다.
종합해 볼 때, 3′,4′-disenecioylkhellactone의 위암에서 항암작용의 가능성을 제시하였고, 암 예방 기능성 소재로서 식방풍의 활용 가능성을 보여주었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	위암의 예방 및 관리가 필요한 이유는?	위암은 동아시아, 남미, 동유럽에서 발병률이 높으며, 특히 한국인의 위암 발생률이 높은 것으로 알려져 있다.1,2) 실제로 2015년 한국에서 가장 많이 발생한 암은 위암이었으며,3) 암의 발병으로 인한 사회적, 경제적 손실이 급증하고 있기 때문에 체계적인 위암의 예방 및 국가차원에서의 지속적 관리가 반드시 필요한 실정이다.4) 위암의 주요 치료는 외과적 수술이 시행되고 있지만, 재발 또는 전이의 위험성이 있는 경우 항암 화학적 요법이 병행된다.
	위암의 특징은 무엇인가?	위암은 동아시아, 남미, 동유럽에서 발병률이 높으며, 특히 한국인의 위암 발생률이 높은 것으로 알려져 있다.1,2) 실제로 2015년 한국에서 가장 많이 발생한 암은 위암이었으며,3) 암의 발병으로 인한 사회적, 경제적 손실이 급증하고 있기 때문에 체계적인 위암의 예방 및 국가차원에서의 지속적 관리가 반드시 필요한 실정이다.
	식방풍은 어떻게 활용되고 있는가?	식방풍은 대한민국약전외한약(생약)규격집에 수재되어 있으며, 국내에서 약용 및 식용으로 활발히 재배되고 있는 유용식물이다. 한방에서 방풍의 대용으로 사용되고 있으며, 민간에서는 잎과 줄기를 방풍나물이라 하여 산채 또는 나물로서 식용하고 있다.8,9) 주요 성분은 쿠마린류의 khellactone 유도체이며,10) 혈소판 응집 억제, 염증 억제, 비만 억제 등의 효능을 가지는 것으로 보고되었지만,11-13) 암세포에 대한 항암 작용 연구는 거의 보고되지 않았다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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